CN107041950A

CN107041950A - 一种多房棘球蚴多表位疫苗ltb‑ae的设计、制备方法和应用

Info

Publication number: CN107041950A
Application number: CN201610970113.3A
Authority: CN
Inventors: 格日力; 汤锋; 李润乐; 樊海宁; 刘川川; 冯琳; 刘文磊; 杨宝良; 杨全余
Original assignee: Qinghai University
Current assignee: Qinghai University
Priority date: 2016-10-28
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2017-08-15
Anticipated expiration: 2036-10-28
Also published as: CN107041950B

Abstract

本发明涉及一种多房棘球蚴多表位疫苗LTB‑AE的设计、制备方法和应用，多房棘球蚴多表位疫苗LTB‑AE的活性成分是一条多肽，主要由多房棘球蚴多表位肽AE以及黏膜免疫佐剂大肠杆菌不耐热毒素B亚基(LTB)构成。本发明主要通过基因合成技术合成多房棘球蚴多表位疫苗LTB‑AE基因序列，通过双酶切连接至表达载体中，然后将表达载体转化进Arctic Express进行融合蛋白的表达。蛋白纯化后，获得多房棘球蚴多表位疫苗LTB‑AE。该多房棘球蚴多表位疫苗能够诱发机体产生针对多房棘球蚴T细胞及B细胞免疫应答和高滴度特异性抗体体液免疫应答，可用于预防和治疗多房棘球蚴感染相关性疾病。

Description

一种多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE的设计、制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种多房棘球蚴疫苗的设计、制备方法和相关应用。

背景技术

包虫病( echinococcosis) 是一种人畜共患型寄生虫疾病，又称棘球蚴病,包括由细粒棘球绦虫引起的幼虫病：单房/细粒棘球蚴病(cystic echinococcosis, CE)和多房棘球绦虫引起的幼虫病：多房棘球蚴病（alveolar echinocococosis, AE）。多房棘球蚴在中间宿主肝内以出芽的方式生长或浸润式增殖，产生新囊泡，长入肝组织，囊壁外角皮层很薄且常不完整，囊体与周围组织间无明显界限，囊液持续渗漏可与肝组织接触，引起局部肝组织病变、增生、肝纤维化、萎缩、变性和坏死，晚期似肝癌样转移能转移至肺、脑、乳腺等脏器，临床有“虫癌”之称，预后极差。青海省是多房棘球蚴病的高发区，已被列为重点防治寄生虫病之一。多房棘球蚴病具有发病范围广、恶性程度高、预后效果差的特点。在高原地域，大多数牧区患者出现症状时就医往往已是晚期，不能手术切除，即使进行肝部分或半叶切除，术后复发率也很高。甲苯达唑、阿苯达唑等抗生素疗法有一定的治疗效果，但是由于需长期连续治疗导致该疗法具有耐药性的出现及治疗后复发率高等缺限。

表位疫苗具免疫特异性高、稳定、无毒、分子结构小而简单等优势，并且表位疫苗可通过组合不同的Th1、Th2及B细胞表位可有效防止免疫逃避现象的发生，故已被应用于抗细菌、病毒等感染与抗肿瘤中。表位疫苗与全菌疫苗、基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗相比，具有以下优点：（1）表位疫苗一般稳定、无毒，具有更高的安全性。（2）抗原表位肽的分子结构小而简单，不会引起免疫抑制或者自身免疫性疾病。（3）表位疫苗可对抗原表位进行精确定位，具有更高的免疫针对性和特异性。（4）表位疫苗具有十分灵活的设计性，可组合不同Th、B细胞抗原表位，制成针对多种病原体的疫苗。（5）表位疫苗选用高保守性的抗原表位肽，可有效防止病原体快速基因突变所形成的免疫逃避机制。

研究发现Emy162具有很强的免疫作用，并稳定表达于棘球蚴生命周期的各阶段（原头节、培养的棘球蚴、未成熟成虫与成熟成虫），在棘球蚴的粘附及运动生理学中发挥重要的作用。Sugimoto C发现多房棘球蚴表面抗原TSP3具有良好的免疫原性；但是Oku Y等人在最新的研究中发现TSP3以及TSP3融合FBP在免疫老鼠的后期发生Th1型向Th2型的免疫类型的转变，导致多房棘球蚴免疫逃逸的发生，抑制率仅为60%，因此以Emy162制备多房棘球蚴亚单位基因工程疫苗，存在不易表达、提取、纯化等问题。故传统药物及疫苗在预防和治疗包虫病在临床应用中的效果确实不尽如人意。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种针对多房棘球蚴的多表位疫苗。

本发明的第二个目的在于提供一种多房棘球蚴多表位疫苗的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供多房棘球蚴多表位疫苗的用途。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：一种多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE，该多房棘球蚴多表位疫苗主要由大肠杆菌不耐热性肠毒素（LTB）和Emy162、TSP3的T细胞表位和B细胞表位构成，多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE的整体氨基酸序列如序列1所示，多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE的核苷酸序列如序列2所示；多表位肽AE的氨基酸序列如序列3所示；多房棘球蚴多表位肽AE的核苷酸序列如序列4所示。所述多房棘球蚴多单位疫苗LTB-AE包含核苷酸序列的表达载体、转基因细胞系及宿主菌；大肠杆菌不耐热毒素B亚基（LTB）和多房棘球蚴多表位肽AE之间的间隔序列为DPRVPSS。

所述多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE具有以下优点：（1）多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE将Emy162及TSP3的优势抗原表位和黏膜免疫佐剂LTB科学合理地整合在一起，可激发针对多房棘球蚴抗原Emy162及TSP3的T细胞免疫应答和特异性体液免疫应答。（2）TSP3是多房棘球蚴表面抗原，被公认为是多房棘球蚴疫苗的理想候选抗原能够取得良好的保护作用；Emy162蛋白表达在多房棘球蚴的多个时期，是良好的候选抗原。（3）由于以Emy162制备多房棘球蚴亚单位基因工程疫苗，存在不易表达、提取、纯化等问题，多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE含有这4种Emy162及TSP3的优势Th和B细胞抗原表位或区段，相对分子量较小，易于表达、提取及纯化。（4）LTB-AE抗原表位肽的分子量很小，免疫原性很低，而所述多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE采取“偶联分子内免疫佐剂”的设计思路来增强表面抗原AE的免疫原性，从而诱发高滴度的特异性抗体产生。

本发明的第二个目的是提供所述多房棘球蚴多表位疫苗的制备方法，其技术路线详述如下：

（1）新型多房棘球蚴多表位疫苗抗原分子的结构设计

根据机体对多房棘球蚴的免疫保护性机制，合理选择多房棘球蚴抗原蛋白Emy162和TSP3的Th、B细胞优势抗原表位，通过生物信息学对抗原表位的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数，加以分析和确定，并与黏膜免疫佐剂大肠杆菌不耐热性肠毒素（LTB）相偶联设计出一个科学合理、结构新颖的多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE。

（2）重组表达质粒pCzn1-LTB-AE（含有融合基因LTB-AE）的构建

采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成基因LTB-AE，通过双酶切连接至pCzn1载体的Nde I和Xba I之间，获得的重组质粒pCzn1-LTB-AE。

（3）融合蛋白LTB-AE的原核表达及纯化

将重组表达载体pCzn1-LTB-AE转化进大肠杆菌Arctic Express中，构建重组基因工程菌株Arctic Express/pCzn1-LTB-AE。利用IPTG诱导表达，并通过Ni-IDA镍离子亲和层析获得电泳纯度的融合蛋白LTB-AE，即为多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE。

本发明的第三个目的是提供多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE的用途。多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE可用于预防和治疗多房棘球蚴感染相关性疾病。

本发明以大肠杆菌不耐热毒素B亚基（LTB）作为分子内佐剂。大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）是由产肠毒素大肠杆菌（enteroxigenic Escherichiacoli, ETEC）分泌的一种外毒素。LT是大肠杆菌质粒的编码产物，天然状态下分泌于大肠杆菌质周腔。已有报道显示，LTB具有复杂的免疫调节功能，是很强的粘膜免疫原和粘膜免疫佐剂，是开发粘膜免疫佐剂的研究热点对象，LTB还具有免疫调节作用，用于某些自身免疫病的防治研究。

本发明通过采用分子克隆技术通过对抗原表位的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数的分析设计泡型包虫多表位疫苗，并经原核系统表达并纯化获得重组蛋白LTB-AE；继而将多表位疫苗LTB-AE免疫小鼠后经Elisa、小鼠脾淋巴细胞增殖实验、GM1特异性Elisa等技术考察多表位疫苗LTB-AE的免疫原性及生物活性。确认该多房棘球蚴多表位疫苗能够诱发机体产生针对多房棘球蚴T细胞及B细胞免疫应答和高滴度特异性抗体体液免疫应答，可用于预防和治疗多房棘球蚴感染相关性疾病。

附图说明

图1：多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE的分子结构设计特点；

图2：重组表达载体pCzn1-LTB-AE的双酶切鉴定，泳道1：DNA Marker；泳道2：pCzn1-LTB-AE酶切前质粒；泳道3：pCzn1-LTB-AE /Nde I+Xba I；

图3：重组表达载体pCzn1-LTB-AE载体构建图谱；

图4：多房棘球蚴多表位肽融合蛋白LTB-AE的原核表达，泳道M：蛋白质Marker；泳道1：未加IPTG诱导菌液蛋白；泳道2：加IPTG诱导后菌液蛋白；泳道3：加入0.5mM IPTG 37℃诱导后菌液离心后上清；泳道4：加入0.5mM IPTG 37℃诱导菌液离心后沉淀；

图5：多房棘球蚴多表位肽融合蛋白LTB-AE的Ni-IDA亲和层析纯化，泳道M：蛋白质Marker；泳道1：LTB-AE未纯化蛋白；泳道2：20mM咪唑洗脱的杂蛋白和部分目的蛋白；泳道3：纯化后的LTB-AE蛋白样品；

图6：多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE诱发抗Emy162 IgG抗体的检测，多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE能诱发产生一定滴度抗Emy162的IgG抗体，并具有较高的抗体效价，而rLTB不能引起抗Emy162的IgG抗体；

图7：多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE诱发抗多房棘球蚴总蛋白IgG抗体的检测，多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE能够产生一定滴度抗多房棘球蚴总蛋白的IgG抗体；

图8：多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE致敏小鼠脾脏淋巴细胞对抗原刺激的增殖反应；

图9：多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE免疫特异性的免疫印迹（Western Blot）鉴定；

图10：多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE与神经节苷脂GM1的结合活性检测。

具体实施方式

材料：

1、IPTG溶液：称取1.2g IPTG置于50ml离心管中，加入40ml 无菌水，充分混匀溶解后，定容至50ml；用0.22μm滤器过滤除菌，小份分装，-20℃保存。

2、氨苄青霉素（Amp）贮液（100 mg/mL）：称取100mg氨苄青霉素（Amp）溶于1mL无菌水，制得浓度为100mg/mL 的贮存液，通过0.22µm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱中。

3、培养基：（1）LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl，加蒸馏水至1000ml，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌；（2）LB固体培养基：1.5g琼脂粉/100ml LB培养液，高压灭菌后，倾倒平板。

4、DNA电泳缓冲液（50 x TAE）：称取242g Tris、37.2g Na₂EDTA·2H₂O和57.1ml 冰乙酸，加水至1000ml，使用时稀释50倍。

5、SDS-PAGE电泳缓冲液（5X）：称取Tris粉末15.1g、甘氨酸 94g、SDS 5.0g；加入约800ml的去离子水，搅拌溶解；加去离子水定容至1L，室温保存；注意：加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。

6、考马斯亮蓝蛋白染色试剂：（1）考马斯亮蓝G-250染液（蛋白质定量用）：考马斯亮蓝G-250 100mg溶解在50ml 95%乙醇中，然后加入86%磷酸100ml，用蒸馏水稀释至1000ml。（2）脱色液：250ml乙醇、80ml冰醋酸用蒸馏水稀释至1000ml。

8、实验动物： BALB/c小鼠：为SPF级，雄性，6～8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001。

9、ELISA试剂：（1）包被液：1.6g Na₂CO₃，2.9g NaHCO₃，0.2g NaN₃，加双蒸水至1L，调pH值至9.6。（2）洗涤液：分别称取0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄∙12H₂O，8.0g NaCl，0.2gKCl，0.5ml Tween-20，加入ddH₂O定容至1000 ml（PBST）。（3）封闭液：称取3.0g BSA溶解于100ml 洗涤缓冲液中，过滤除菌后4℃保存。（4）底物液：可溶性单组份TMB底物溶液。（5）终止液：量取蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml（1M H₂SO₄）。

10、淋巴细胞增殖实验主要试剂（1）小鼠脾脏淋巴细胞分离液（购于CEDARLANE公司，CL5031）（2）RPMI-1640完全培养液：在RPMI-1640基础培养液加入10% 胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素。（3）RPMI-1640不完全培养液：称取10.4g RPMI-1640干粉、2.4gHEPES、0.75g NaHCO₃，加去离子水至1000ml，pH 7.4，超滤除菌，分装。

实施例1：多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE的分子结构设计

根据“机体对多房棘球蚴的免疫保护性机制”和“表位疫苗构建理论”，使用多房棘球蚴抗原蛋白Emy162的表位Emy162_36-48、Emy162 _7-13及TSP3抗原表位TSP3_33-42 、TSP3 _80-90用于多房棘球蚴多表位疫苗的构建。在多房棘球蚴多表位疫苗的设计中，本发明将Th细胞表位放在B细胞表位的前端，有助于B细胞表位的有效递呈，再经过生物信息学DNAstar和RANKPEP软件的分析和评价，抗原表位顺序确定为TSP3_80-90- Emy162_36-48 - TSP3 _33-42-Emy162 _7-13；选择KK作为相邻Th抗原表位的间隔序列，选择GS作为相邻B抗原表位的间隔序列；将Emy162和TSP3抗原表位Emy162_36-48、Emy162 _7-13、TSP3_33-42 和TSP3 _80-90分别拷贝两次；选择大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基（LTB）作为分子内免疫佐剂，融合在多表位肽（AE）的N端，增强多表位肽（AE）的免疫原性。

结果：多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE的分子结构设计特点和思路如图1所示。

实施例2：重组表达载体pCzn1-LTB-AE（含有融合基因LTB-AE）的构建

将前期设计的多表位肽LTB-AE的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性原则转化成相应的核苷酸序列，采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基合成基因LTB-AE，通过克隆位点Nde I和Xba I连入表达载体pCzn1。

结果：利用Nde I和Xba I双酶切待检重组质粒pCzn1-LTB-AE，37℃反应2h，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，发现双酶切的DNA片段约为620bp，与融合基因LTB-AE的理论大小一致，如图2所示。重组表达载体pCzn1-LTB-AE的载体构建图谱如图3所示。将获得的重组质粒pCzn1-LTB-AE转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果与预期序列完全一致，且无移码突变。

实施例3：多表位肽融合蛋白LTB-AE的原核表达

将验证正确的重组表达质粒pCzn1-LTB-AE转入到大肠杆菌Arctic Express菌株中。在预先制备好的含50μg/mL Amp的LB平板上，接种环划线基因工程菌株pCzn1-LTB-AE/ArcticExpress，倒置于37℃培养箱，过夜培养后，挑取单个菌落，接种于含50µg/mL Amp 的LB培养基中，37℃，220rpm，培养过夜。以2%接种量分别接种重组菌于含50µg/mL Amp LB培养基中，37℃，220rpm，培养至至菌体OD600为0.6-0.8 (约2h)，加入IPTG使终浓度达到1mmol/L，37℃，220rpm诱导表达4h，以未加IPTG诱导的载体菌pCzn1-LTB-AE/Arctic Express作为阴性对照。

结果：与对照菌株对比，基因工程重组菌株pCzn1-LTB-AE/Arctic Express在约26KD处出现目的蛋白条带，与多表位肽融合蛋白LTB-AE的理论大小相符合，如图4所示。多表位肽融合蛋白LTB-AE在包涵体蛋白中存在。

实施例4：多表位肽融合蛋白LTB-AE的纯化

（1）包涵体蛋白的变复性

将菌体沉淀重悬于20 ml lysis buffer (20 mM Tris-HCl containing 1 mM PMSFand bacteria protease inhibitor cocktail, pH 8.0)，超声破碎(功率400 W，工作4sec，间歇8 sec，共20 min)；将超声破碎的细胞裂解液4℃、10000g离心20 min，收集沉淀；使用包涵体洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0)洗涤包涵体3次；用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素 pH8.0)，按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，15000rpm离心15min；将上述溶液滴加20 mM Tris-HCL 5mM EDTABuffer PH7.8缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于PBS pH7.4溶液中透析过夜。

（2） Ni-IDA镍离子亲和层析柱的纯化

利用低压层析系统，蛋白溶液以0.5 ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B亲和层析柱；用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl，20 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用Ni-IDAElution-Buffer(20 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS（PH7.4）进行透析过夜。

结果：经Ni-IDA镍离子亲和层析柱的纯化后，收集的各个蛋白峰进行SDS-PAGE分析，可以发现目的蛋白集中在250mM咪唑洗脱产生的蛋白峰。通过凝胶成像检测仪分析在250mM咪唑洗脱的目的蛋白纯度可达电泳纯，如图5所示。

实施例5：多表位疫苗LTB-AE的免疫原性和免疫特异性研究

（1）BALB/c小鼠的免疫

实验分组：将SPF级BALB/c小鼠随机分为3组，分别为多表位融合蛋白LTB-AE免疫组、重组霍乱毒素B亚基（rLTB）免疫组和PBS免疫组。每组6只BALB/c小鼠，共18只，详细分组如下图所示：

表1：SPF级BALB/c小鼠分组及免疫方案

实验组	数目	免疫方式	免疫次数	免疫剂量	免疫佐剂
						LTB-AE	6	腹腔注射	3次	50μg/只	弗氏佐剂
rLTB	6	腹腔注射	3次	50μg/只	弗氏佐剂
						PBS	6	腹腔注射	3次	50μg/只	弗氏佐剂

免疫方式：用75% 酒精对小鼠腹部消毒，然后腹部多点皮下注射表位融合蛋白LTB-AE和弗氏完全佐剂的混合乳化剂；每隔一周加强免疫一次，第2、3周加弗氏不完全佐剂，第4周直接注射表位融合蛋白溶液加强免疫。

抗血清的采集：在末次免疫后第五天，摘小鼠眼球采血，收集血液，放置待血清完全分离，3000rpm离心5分钟分装血清，－80℃冻存备用。

（2）抗血清中特异性抗体的ELISA检测

将抗原（Emy162和多房棘球蚴总蛋白）分别用包被液稀释成10μg/ml，100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜。用洗涤液洗4次后，每孔加入300μl封闭液，37℃封闭2h。用洗涤液洗4次后，将抗血清（鼠抗LTB-AE抗血清和鼠抗rLTB抗血清）和小鼠阴性血清倍比稀释后加入ELISA板，100μl/孔，在37℃下孵育60min。用洗涤液洗4次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1:10000），100μl/孔，在37℃下孵育1h。用洗涤液洗4次后，加入100μl/孔TMB底物显色液，室温避光反应10min，加50μl终止液终止反应。用酶标仪测定各孔OD450值。

结果：Emy162的包被浓度为10μg/ml，通过ELISA检测，多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE能够产生针对Emy162的特异性IgG抗体，而rLTB免疫组不能产生抗Emy162抗体，如图6所示；多房棘球蚴总蛋白的包被浓度为10μg/ml，通过ELISA检测，多表位疫苗LTB-AE能够产生抗多房棘球蚴总蛋白的抗体，而PBS免疫组不能产生抗多房棘球蚴总蛋白的特异性IgG抗体，如图7所示。

（3）小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验

将经抗原免疫的小鼠脱臼处死，泡75%酒精5min后，移入超净工作台。用剪刀小心剪开小鼠的腹部外皮，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏（暗红色）。在小平皿中放入2-3ml Lympholyte ®-M 淋巴细胞分离液；用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中；把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约1ml的1640培养基；1000g-1500g离心20min。离心结束后淋巴细胞会在1640培养基下层悬浮。用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基制备成一定浓度的细胞悬液（5 x 10⁵/ml）。在96孔平底培养板中，每孔加入100μl细胞，同时加入LTB-AE和Emy162各20μg/ml、Emy162抗原表位肽（Emy162_36-48和Emy162_7-13）、TSP3抗原表位肽（TSP3_33-42和TSP3_80-90）和生理盐水各100μl，终体积为200μl/孔，每组做3个平行孔。将加好的96孔平底培养板放置37℃ 5% CO₂培养箱中培养60h后，向各孔中加入MTS溶液40μl，继续培养2h后用酶标仪读取 OD570值。刺激指数（SI）≥ 2时，判断为阳性；刺激指数计算公式如下：

结果：多表位疫苗LTB-AE致敏过的小鼠脾脏淋巴细胞经LTB-AE、 Emy162、Emy162抗原表位肽（Emy162_36-48和Emy162_7-13）、TSP3抗原表位肽（TSP3_33-42和TSP3_80-90）刺激均能够发生明显的淋巴细胞增殖反应，而PBS免疫组的小鼠脾脏淋巴细胞接受上述抗原刺激时均未发生淋巴细胞增殖反应，说明多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE中Emy162抗原表位肽及TSP3抗原表位肽均保持有其免疫学特性，能够刺激机体产生针对各自Th抗原表位的细胞免疫应答，如图8所示。

（4）蛋白免疫印迹（Western blot）

取蛋白样品LTB-AE进行15% SDS-PAGE电泳。用半干式电转移法将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，恒流1mA/cm²，2h；将PVDF膜洗净后用10 %脱脂牛奶封闭液28℃摇床封闭2 h；PBST洗膜3次，每次10min。分别加入按1:2500倍数稀释好的抗血清（鼠抗LTB-AE血清），4℃过夜；第二天用PBST洗膜3次，每次10min。加入按1:10000倍数稀释好的二抗（HRP 酶标羊抗鼠IgG），28℃摇床孵育1h；用PBST洗膜3次，每次10min。在暗室(允许红色光源)中，将PVDF膜蛋白面朝上，放在保鲜膜上，吸水纸吸掉多余的PBST溶液，向膜上均匀滴加事先混合好的ECL发光液，反应1min；将PDVF膜包裹在保鲜膜中，剪下一块等大的X光胶片（胶片也作剪角处理以区分条带顺序），放置夹片盒曝光0.5~30min；取出X光胶片，在显影剂中漂至条带出现，放到停影液（1.5%冰醋酸）中停影1min，用流水冲洗1min后在定影剂中漂至背景部分透明，最后流水冲洗20min固定影像。

结果：鼠抗LTB-AE血清能够与纯化的LTB-AE蛋白发生结合反应，说明多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE，能够激发机体产生针对LTB-AE的高特异性抗体，如图9所示。

实施例5：GM1-ELISA检测多表位疫苗LTB-AE中LTB组分的分子免疫佐剂活性

将神经节苷脂GM1或者牛血清白蛋白（BSA）用包被液稀释至10μg/ml，100μl/孔，包被ELISA板，4 ℃过夜。用PBST洗涤4次；每孔加入300μl封闭液，37℃封闭2h；用洗涤液PBST洗4次后，4℃保存。将多表位肽融合蛋白LTB-AE和重组霍乱毒素B亚基（rLTB）按照一定比例稀释（100μg/ml到0.78μg/ml），加入100μl/孔，37℃放置60min。用洗涤液PBST洗4次，加入鼠抗LTB多克隆抗体（1:1000），100μl/孔，37℃温育60min。洗涤4次；加入HRP标记羊抗鼠IgG（1:10000），100μl/孔，37℃放置30min。洗涤4次后，加入100μl/孔TMB底物显色液，37℃孵育10min，50μl终止液终止反应。用酶标仪检测各孔OD450值。

结果：通过GM1-ELISA检测多表位肽融合蛋白LTB-AE和rLTB是否具有形成五聚体和神经节苷脂GM1结合的活性。多表位肽融合蛋白LTB-AE和rLTB的OD450都显著高于阴性对照组（包被BSA），证明多表位肽融合蛋白LTB-AE和rLTB均具有形成五聚体和神经节苷脂GM1结合的活性，也说明新型多表位疫苗LTB-AE和rLTB组分具有较好的分子免疫佐剂活性，如图10所示。

序列表

序列1

<110> 青海大学

<120> 一种多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE的设计、制备方法和应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 208

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Thr Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn

1 5 10 15

Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser

20 25 30

Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Glu

35 40 45

Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys

50 55 60

Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr

65 70 75 80

Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn

85 90 95

Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn Asp Pro Arg Val Pro Ser Ser

100 105 110

Lys Pro Tyr Pro Ala Ser Cys Cys Lys Ser Gly Lys Lys Lys Pro Tyr

115 120 125

Pro Ala Ser Cys Cys Lys Ser Gly Lys Lys Thr Leu Pro Glu His Phe

130 135 140

Arg Trp Ile His Val Gly Ser Lys Lys Thr Leu Pro Glu His Phe Arg

145 150 155 160

Trp Ile His Val Gly Ser Lys Lys Leu Val Gly Lys Glu Met Gln Arg

165 170 175

Glu Ile Gly Ser Leu Val Gly Lys Glu Met Gln Arg Glu Ile Gly Ser

180 185 190

Leu Ile Leu Leu Ala Thr Ser Gly Ser Leu Ile Leu Leu Ala Thr Ser

195 200 205

序列2

<210> 2

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgacagcac ctcagacgat taccgaattg tgtagcgaat atcgcaatac ccagatctat 60

actatcaatg acaaaattct cagctacaca gaatccatgg ccggtaaacg cgagatggta 120

atcattactt ttaagtcggg cgaaaccttt caagtggaag tccccggcag ccaacatatt 180

gactcgcaga aaaaagcgat tgaacgcatg aaagataccc tccgtatcac ctatctgacc 240

gagactaaga tcgataagct gtgtgtatgg aacaacaaga caccgaacag tattgcggcg 300

atcagcatgg aaaacgatcc tcgtgttccc agtagtaaac cgtatccagc cagttgttgc 360

aaaagcggca aaaaaaaacc gtacccggcg agctgctgta aatcggggaa aaaaactctg 420

ccggagcatt tccgctggat tcatgttgga tctaaaaaaa ccctcccgga gcattttcgc 480

tggattcatg tggggtcaaa gaaacttgtt ggcaaagaaa tgcagcgcga aattggctca 540

cttgtcggta aagaaatgca gcgcgagatt ggctctctga ttctgcttgc gacaagtggc 600

agtctgatct tgttagcaac gtctctgatc ttgttagcaa cgtcttaa 648

序列3

<210> 3

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Lys Pro Tyr Pro Ala Ser Cys Cys Lys Ser Gly Lys Lys Lys Pro Tyr

1 5 10 15

Pro Ala Ser Cys Cys Lys Ser Gly Lys Lys Thr Leu Pro Glu His Phe

20 25 30

Arg Trp Ile His Val Gly Ser Lys Lys Thr Leu Pro Glu His Phe Arg

35 40 45

Trp Ile His Val Gly Ser Lys Lys Leu Val Gly Lys Glu Met Gln Arg

50 55 60

Glu Ile Gly Ser Leu Val Gly Lys Glu Met Gln Arg Glu Ile Gly Ser

65 70 75 80

Leu Ile Leu Leu Ala Thr Ser Gly Ser Leu Ile Leu Leu Ala Thr Ser

85 90 95

序列4

<210> 4

<211> 288

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaaccgtatc cagccagttg ttgcaaaagc ggcaaaaaaa aaccgtaccc ggcgagctgc 60

tgtaaatcgg ggaaaaaaac tctgccggag catttccgct ggattcatgt tggatctaaa 120

aaaaccctcc cggagcattt tcgctggatt catgtggggt caaagaaact tgttggcaaa 180

gaaatgcagc gcgaaattgg ctcacttgtc ggtaaagaaa tgcagcgcga gattggctct 240

ctgattctgc ttgcgacaag tggcagtctg atcttgttag caacgtct 288

Claims

1.一种多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE，其活性成分是一条多肽，主要由大肠杆菌不耐热毒素B亚基（LTB）和多房棘球蚴多表位肽AE构成，其氨基酸序列如序列1所示。

2.如权利要求1所述的多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE，其核苷酸序列如序列2所示。

3.如权利要求1所述的多房棘球蚴多单位疫苗LTB-AE，多房棘球蚴多表位肽AE主要由Emy162和TSP3的优势Th和B细胞抗原表位的多拷贝体构成，其氨基酸序列如序列3所示。

4.如权利要求3所述的多房棘球蚴多单位疫苗LTB-AE，多房棘球蚴多表位肽AE的核苷酸序列如序列4所示。

5.如权利要求2或4所述的多房棘球蚴多单位疫苗LTB-AE，包含所述的核苷酸序列的表达载体、转基因细胞系及宿主菌。

6.如权利要求1所述的多房棘球蚴多单位疫苗LTB-AE，大肠杆菌不耐热毒素B亚基（LTB）和多房棘球蚴多表位肽AE之间的间隔序列为DPRVPSS。

7.一种多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE的制备方法，通过基因合成技术合成多房棘球蚴多表位肽LTB-AE的核苷酸序列，构建含有融合基因LTB-AE的重组表达载体pCzn1-LTB-AE及其重组基因工程菌Arctic Express；重组基因工程菌株发酵后，经Ni-IDA镍离子交换层析纯化，获得该疫苗的融合蛋白LTB-AE。

8.权利要求1-6任一项所述的多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE，其特征在于能够激发机体产生针对多房棘球蚴B细胞及T细胞免疫应答。

9.权利要求1-7任一项所述的多房棘球蚴多表位疫苗LTB-AE在预防和治疗多房棘球蚴感染中的应用。