CN101245098B - 模拟md2的抗菌抗炎拮抗多肽 - Google Patents

Abstract

本发明提供能模拟MD2与LPS结合的关键序列，可竞争性地拮抗LPS与MD2发生的特异性结合，从而达到减轻LPS对免疫炎症细胞过度活化，进而缓解由此而导致对机体过度的脓毒性损害的拮抗多肽。该拮抗多肽的氨基酸序列包括：序列1：Lys Thr Val Pro Asp Asn His序列2：Ile Gly Lys Phe Leu Tyr Arg。上述多肽能有效减轻细菌内毒素LPS所诱导的脓毒性炎症损害，显著提高内毒素感染的小鼠的存活率，从而可在特异阻抑LPS对炎症细胞过度刺激的同时，还能保持机体免疫防御功能。用于制备因革兰氏阴性菌所导致的感染，以及与toll样受体蛋白相关的炎症性疾病的治疗药物。

Description

模拟MD2的抗菌抗炎拮抗多肽

技术领域

本发明属生物医药领域，特别涉及模拟MD2的抗菌抗炎拮抗多肽，以及所述拮抗多肽在制备用于治疗因革兰氏阴性菌感染、及由此造成相关的过度炎症性损害类疾病的药物中的应用。

背景技术：

细菌感染，特别是革兰氏阴性菌感染所导致的脓毒症已成为当前临床病人，特别是外科ICU患者死亡的主要原因。资料表明，住院病人发生脓毒症的比例是1/3，ICU病人＞50％，而外科ICU则在80％以上。然而令人遗憾的是，目前尽管高效广谱抗生素的出现，脓毒症仍然是临床ICU病人死亡的重要原因，究其主要原因在于细菌毒素对机体产生的过度刺激所导致的一系列炎症性损害，抗生素的应用虽然可以对病菌具有抑制和杀灭作用，但病菌死亡后其毒素的释放无疑是导致机体发生严重脓毒症，脓毒性休克，甚至死亡的主要因素之一。因而，寻找新型的，兼有抗菌作用和抗过度炎症作用的药物已成为当今重要的药物研究热点之一。

细菌对机体造成的感染脓毒症通常由细菌外毒素及内毒素对机体的刺激产生。细菌毒素进入体内后，首先刺激免疫炎症细胞，通过机体模式识别受体，主要为TLR2和TLR4受体，启动机体的感染免疫反应，但当机体遭受过度刺激后，大量产生的炎症介质则可对机体造成一系列过度的炎症性损害。

有鉴于此，采用恰当的免疫策略当前对脓毒症实施有效防治，已成为免疫学家，临床学家，以及制药行业关注的重点问题之一。当今对脓毒症的免疫治疗策略可大致分为三个方面，其一，围绕病原体本身展开，如针对细菌内毒素脂多糖(lipopolysacchride，LPS)或其它致病因子制备相应的单克隆抗体进行中和作用，但作为LPS表位抗原的决定簇较多，单一的单抗中和难以达到预期效果；其二，针对前炎症因子采用单克隆抗体拮抗，如抗肿瘤坏死因子抗体，抗白介素6，白介素8抗体等，但这种对炎症介质逐一对抗的方法无疑事倍功半；其三，近来有报道从控制炎症细胞受激活化角度切入的研究，即从炎症细胞被病原体刺激后核转录因子活化角度进行调控和干预，众所周知，核转录因子不仅控制着过度炎症介质的释放，同时也是许多重要生理事件的调控“阀门”，对其全或无的干预很可能将带来难以预料的副作用，此外，采取干预或调控的药物必须能穿过细胞膜，这无疑对药物的制作工艺提出了更高的要求。

近年来，有资料提示，活化蛋白C(activated protein C，APC)，可作为能有效控制脓毒症发生发展的一种有效的药物制剂，然而遗憾的是，最近通过美国多中心临床研究证实，其临床效果与相应的对照治疗组无明显差异。

对各种疾病的治疗都应集中在发病早期环节上，免疫细胞对细菌内毒素脂多糖(lipopolysacchride，LPS)的识别是炎症反应发生的初始环节，如何调控免疫炎症细胞对LPS的识别，下调LPS所致的过度炎症反应，从而在减轻炎症性损害的同时，又不影响机体免疫细胞正常的抗感染免疫功能则应是针对脓毒症实施有效免疫治疗的理想策略。

在免疫炎症细胞LPS的膜式识别受体复合物(TLR4/MD2/CD14)中，任何一个功能结构域的破坏都导致LPS信号转导障碍。资料证实，CD14与TLR4/MD2的亲和力较弱，而TLR4/MD2的亲和力较强，并且MD2(myeloid differential protein2，髓样分化蛋白2)同TLR4(toll like receptor4，Toll样受体4)的结合发生在同LPS结合之前，丧失LPS结合功能的MD2即使结合在TLR4胞外区，也不能赋予TLR4对LPS的反应性。表明MD2分子中与LPS结合的结构域对整个复合体的功能乃至之后的信号转导强度都有决定性的作用。并且，MD2与TLR4的胞外区相耦联，是一个只含有160个氨基酸的分泌蛋白，具有分子量小，核酸片段短，且为可分泌型等特点，对MD2的调控更易于操作，因而成为治疗内毒素休克十分有潜力的靶点之一。

越来越多的实验说明，MD2在结合LPS及诱导其信号的胞内传导中都起着关键的作用。有研究显示，阻断LPS与MD2的结合，比阻断LPS与TLR4/MD2的结合要容易近100倍]，因而在应用前景上给我们以提示，如何开发一种可以干扰LPS与MD2结合的药物，或者是抑制MD2与TLR4结合，可能是控制LPS诱导的炎症反应发展的更为有效、事半功倍的治疗策略。

发明内容

本发明的目的是提供能模拟MD2与LPS结合的关键序列，可竞争性地拮抗LPS与MD2发生的特异性结合，从而达到减轻LPS对免疫炎症细胞过度活化，进而缓解由此而导致对机体过度的脓毒性损害的拮抗多肽。该拮抗多肽的氨基酸序列包括：

序列1：Lys Thr Val Pro Asp Asn His

序列2：Ile Gly Lys Phe Leu Tyr Arg。

由于上述拮抗多肽的功能，本发明的第二目的还涉及上述氨基酸序列在制备治疗由革兰氏阴性菌所导致的感染，过度炎症性损伤的生物多肽制剂中的应用，及在制备治疗由toll样受体所诱导的炎症性疾病的生物多肽制剂中的用途。

为实现上述目的而采用的技术方案是这样的：第一，首先通过生物信息学技术，分析MD2蛋白的结构特征，如亲水性，柔韧性，可及性等生物信息学参数，分析MD2与细菌毒素LPS相互作用的关键序列；第二以该氨基酸序列为模板，利用噬菌体肽库筛选技术，从随机的噬菌体肽库中筛选获得能与该模板特异结合的多肽片断；第三，从总多候选的拮抗多肽中利用炎症介质产生抑制作用，筛选对MD2具有高度亲和作用的拮抗性多肽；第四，利用生物素标记转移实验证实，筛选出的拮抗多肽可与MD2蛋白发生直接的结合作用；第五，采用两种不同作用浓度，分别在3种细胞模型中验证所筛选出的2种拮抗多肽，对细菌毒素(LPS)所诱发的炎症反应的抑制作用；第六，通过活体动物实验进一步炎症所筛选出的拮抗多肽对细菌内毒素LPS攻击小鼠的生物保护效应。

通过上述六步实验证实，本发明所述的2条拮抗性多肽对细菌毒素(LPS)攻击的动物具有明显的抗炎，抗菌作用，能显著受攻击小鼠的存活率，从而在特异阻抑LPS对炎症细胞过度刺激的同时，还能保持机体免疫防御功能。可用于因革兰氏阴性菌所导致的感染，以及与toll样受体蛋白相关的炎症性疾病的治疗。

附图说明

图1.MD2蛋白的生物信息学分析结果示意图；

图中：A为亲水性预测、B为柔性预测、C为抗原性预测、D为可及性预测、E为MD2三段序列的亲水性预测。

序列A：NH2-FSKGKYKCV-COOH

序列B：NH2-FKGIK FSKGKYKCV VEAIS-COOH

序列C：NH2-全长MD2分子-COOH

综合生物信息学单参数指标看，序列A亲水性，可及性及柔韧性最好，因此选择该序列为模板，可用于筛选与MD2特异结合的拮抗多肽。

图2.MD2与拮抗肽相互作用Western Blot图：

图中对2条筛选出的多肽分别加用还原和非还原缓冲液，得到4条带。MD2蛋白的分子量为18.2KD，MD2+拮抗多肽1分子量为1.015KD，MD2+拮抗多肽2，分子量为1.100KD，而Bio-tinylated蛋白标准范围为10～200KD。

因此，上述结果证实所筛选出的2条多肽确实与MD2发生了直接的相互结合，这为我们下一步利用细胞模型进一步分析拮抗多肽的生物效应，奠定了基础。相互作用。

图中A为拮抗多肽1，B为拮抗多肽1+MD2，C为拮抗多肽2，D为拮抗多肽2+MD2。加入MD2后阳性蛋白条分子量为多肽+MD2，表明二者发生了相互结合作用。

图3为拮抗多肽对LPS所致内毒素血症小鼠的保护作用病理切片图；

A为正常小鼠的肺组织病理切片(HE染色，400倍)，B为仅用LPS的小鼠肺病理切片(HE染色，400倍)，C为无关多肽干预的小鼠肺病理切片(HE染色，400倍)，D为MD2拮抗多肽1干预的小鼠肺病理切片(HE染色，400倍)，E为MD2拮抗多肽2干预的小鼠肺病理切片(HE染色，400倍)。

从图中可以看出，与正常肺组织切片相比，单纯使用LPS组小鼠，表现为肺泡腔出现炎症渗出，肺泡间隔增宽，大量炎症细胞浸润等一系列明显的炎症反应。而在LPS+拮抗多肽处理的小鼠，肺泡腔渗出减少，肺泡间隔炎症细胞浸润显著减弱，炎症反应明显减轻，表明使用MD2的拮抗多肽后，可显著改善LPS处理小鼠肺组织的病理变化。

具体实施方式：

(分六步实验完成)

实验一.MD2蛋白的生物信息学分析及其可用于筛选拮抗多肽模板的选择。

实验目的：利用生物信息学技术，分析MD2蛋白的结构特征，对亲水性，可及性，柔韧性等参数的分析，寻找MD2与细菌毒素LPS相互作用的关键氨基酸序列。并以此序列为模板，为后续筛选其相应的拮抗多肽奠定基础。

实验方法

1.单参数预测：MD2的亲水性(Hydrophilicity)、抗原性(Antigenicity)、可及性(Accessibility)和主链柔性(Flexibility)。

2.二级结构预测和其他信息分析：在PHD和SOPMA服务器上完成。

3.确定细胞表位：将单参数预测结果汇总；排除二级结构位于α-螺旋和β-折叠内不易形成表位的序列，将位于β-转角、无规则卷曲处者确定为MD2的候选B细胞优势表位。最后采用吴玉章等报道方法，将平均抗原指数(AI)最高值对应的序列确定为为hMD2的B细胞优势表位。

4.MD2的核酸序列分析：用DNAclub软件搜索hMD2编码序列中的酶切位点。

5.MD2蛋白功能预测：在BLAST、PRS和Superfamily服务器上提交AA序列，以氨基酸序列、组成以及超家族分类等方法进行MD2的功能预测。

6.可以与MD2结合的AA序列特征分析：通过BLAST服务器，比对和搜寻TLR4/TLR2的相似序列(交叉序列)；再以此序列BLAST，搜索与TLR4/TLR2相似序列同源的蛋白质，这些蛋白质可能就与MD2的功能有关。

7.蛋白质分子量(MW)和等电点(PI)：用ExPASy的Comput PI/MW程序计算。

8.MD2模拟小肽的合成：由生物技术公司合成。纯度＞95％，质量20mg，成品经过HPLC纯化，并经MS检测。

实验结果

一、MD2的序列信息

1.表位预测：(1)单参数预测：MD2的亲水性、抗原性、主链柔韧性和可及性单参数预测结果见图1.A～D(高于基线的AA所对应的肽段为表位)；汇总于表5；(2)二级结构预测：用PHD和SOPMA预测MD2二结构见表2。

表1.MD2单参数预测汇总

预测方法    预测表位

亲水性      26-33，36-42，51-61，66-74，87-97，97-107，107-115，122-136，140-117

可及性      28-34，34-45，54-59，65-76，83-92，97-104，108-115，124-132，139-145，155-160

柔韧性      26-32，53-59，86-93，96-102，108-117，122-133，138-145，156-160

抗原性      54-63，67-77，86-93，97-110，126-136，151-160

表2.二级结构预测

                        预测二级结构

序列    QKQYWVCNSSDASISYTYCDKMQYPISINVNPCIELKGSKGLLHIFYIPRRDLKQLYF

结构    TEEEEEECCCCCCEEEEHCCTTCCCEEEECCCEEEETTTTCEEEEEECCCCCHHHHEE

序列    NLYITVNTMNLPKRKEVICRGSDDDYSFCRALKGETVNTTISFSFKGIKFSKGKYKC

结构    EEEEEEEEECCCCCCEEEEECCCCCCEEHHHHTTCCCEEEEEEEETTEEECTTCHHEE

序列    VVEAISGSPEEMLFCLEFVILHQPNSN

结构    EHHHTTCCHHHEEEHHHEEECCCCCC

#Alpha helix(14.08％)；Extended strand(43.66％)；Beta turn(10.56％)；Random coil(31.69％)

2.核酸序列分析：MD2编码序列中单酶切位点有BamH I(166)，Cfo I/HhaI(267)，DraI(210)，HpaI(142)，SacI(317)，VspI(136)。常用的高效率内切酶BamH I(GGATCC)位点编码2个AA(56G，57S)，可以避免移码突变的产生。

3.MD2的AA序列功能位点信息见表3：MD2是致密的球蛋白；很容易在分子内和分子间二硫键。在96～141位AA具有多达5个的功能位点，这段序列是重要序列。

表3.MD2蛋白质的重要功能位点

4.等电点(PI)和分子量(Mw)计算(表4)

                表4.蛋白质等电点和分子量计算

二、MD2的功能预测

1.MD2的家族归属：MD2含有ML功能域(MD2-related lipid-reccognition)，与MD-1、GM2A、Npc2等蛋白质同属一个家族，与天然免疫和脂质代谢有关；ML功能域位于MD2分子的C-末端。PRS服务器(按照AA组成)预测显示，MD2与细胞色素C氧化酶的氨基酸组成相似，提示它可能与该蛋白质功能有关。PHD服务器的二级结构预测提示，MD2的结构与PHD数据库中编号1B8F的蛋白质相似，该蛋白质是铜绿假单胞菌组氨酸裂解酶(Histidine ammonia-lyase，HLA)。

2.可能与MD2结合的序列和蛋白质：PSI-BLAST搜索TLR4/TLR2交叉点，得到5个序列片断，其中1个在细胞内区(PPFQLCLHYRDFIPG)，4个在细胞外区；以此序列分别进行BLAST搜索，得到可能与MD2结合的蛋白质，其中细胞色素P450因为与炎症反应也有关而备受关注。

3.Superfamily超家族预测：MD2的1～43位AA可形成Kringle样结构，31～151位AA属于免疫球蛋白超家族的结构模式。提示MD2在N-末端和C-末端具有两个相对独立的功能域，可能是MD2既能与配基结合也能与TLRs结合分子基础。

实验结论：

本实验对MD2的生物信息分析显示：MD2在结构上可能分成两个相对独立的功能域，N-末端与相关蛋白质(TLR4或TLR2)结合，C-末端与脂质类配基(LPS)结合。其中K128/132是与LPS结合功能域的关键氨基酸，可能是MD2与LPS结合的分子基础。根据亲水性预测，以K128-K132为中心的肽段呈现较强的亲水性(见图1)，即NH2-FSKGKYKCV-COOH，为此，本研究拟以该氨基酸序列作为后续筛选拮抗多肽的模板，进行实验。

将此段序列作为MD2与LPS结合的模拟小肽。由生物技术公司合成，纯度＞95％，质量20mg，成品经过HPLC纯化，并经MS检测其序列正确。

实验二.利用噬菌体肽库筛选具有抗炎效应MD2候选拮抗多肽

实验目的：利用实验一所获取的模板，利用随机肽库筛选技术，筛选出可与该模板发生特异性，高亲和力结合的拮抗性多肽。

实验方法

将噬菌体展示肽库与包被有靶分子的平板(或磁珠)共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。

第一天

根据同时要进行文库淘选的靶分子数量和种类的不同，淘选试验可以在单个灭菌聚苯乙烯培养皿、12-、24-孔板或96孔微量板中进行。每种靶分子至少包被一个板(或一个孔)。下述方法中给出的量是60×15mm培养皿的用量，微孔板的用量在括号中注明，其他中等大小尺寸的孔可相应调整用量。但无论用哪种板，加入的噬菌体数量都应是相同的，即2×10¹¹个病毒子。

1.准备100μg/ml的靶分子(MD2)溶液(溶于0.1M pH 8.6的NaHCO3)。如果需要稳定靶分子，也可使用其他相似离子强度的缓冲液(含金属离子等)。

2.每板(孔)加入1.5ml(微孔板每孔150μl)上述溶液，反复旋转直到表面完全湿润(小心不要使溶液溅出)。

3.在增湿容器(如：可封口塑料盒中加些湿纸巾)中4℃轻微震荡，孵育过夜。平板可在此容器中4℃贮存备用。

第二天

4.挑ER2738单克隆(噬菌体滴度测定时铺的板)于10ml LB液体培养基中。如果同一天扩增洗脱的噬菌体，也可将ER2738接种于20ml LB液体培养基，250ml三角瓶，37℃剧烈震荡培养。

5.弃掉每板中的包被液后，将平板倒置于干净的纸巾上用力拍甩以去除残余溶液。在每板或每孔中加满封阻液，4℃作用至少1小时。

6.按5中所述方法除去封阻液。再用TBST(TBS+0.1％[v/v]Tween-20)缓冲液快速洗板6次。每次均旋转以使板或孔的底部及边缘都被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液(或使用自动洗板机)。此操作要快以避免板干燥。

7.用1ml(微孔板则用100μl)的TBST缓冲液稀释2×10¹¹的噬菌体(即10μl的原始文库)，然后加到已包被好的板上，室温温和摇动10-60分钟。

8.弃掉未结合噬菌体，将平板倒置于干净的纸巾上用力拍甩以去除残余溶液。

9.按6中所述方法用TBST缓冲液洗板10次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染。

10.根据所研究的分子间相互作用，用1ml(微孔板则用100μl)适当的洗脱缓冲液洗脱已结合的噬菌体。室温温和摇动10-60分钟，然后将洗脱液吸入另一干净微量离心管中。通常是用竞争法将与靶分子结合的噬菌体置换出来，竞争物可以是靶分子的已知配体溶液(0.1-1mM溶于TBS溶液)，也可以是游离靶分子溶液(约100μg/ml溶于TBS中)。如果相互作用是依赖于环化了的多肽，那么，已结合的多肽也可用溶于TBS的1mM DTT洗脱。

10a另外，也可用非特异性缓冲液如0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)，1mg/mlBSA来分离已结合的分子。温和摇动＞10分钟，洗脱液吸入另一干净微量离心管中。然后再用150μl(微量孔则用15μl)1M HCl(pH 9.1)中和上述洗脱液。

11.按下述“测定噬菌体滴度”中的程序测定少量(约1μl)洗脱物的滴度。如需要，可对第一或第二轮洗脱物滴度测定所得的噬菌斑进行测序，方法见下述。必要时可将剩余洗脱物4℃贮存过夜，以便第二天扩增。这时，可将ER2738在LB-Tet培养基中过夜培养，第二天将培养物1∶100稀释于20ml LB中(用250ml三角瓶盛装)，然后加入未扩增的洗脱物。37℃剧烈摇动培养4.5小时，继续第13步骤。

12.剩余洗脱物应当被扩增：将洗脱物加入到20ml ER2738培养物中(菌体应当处于对数前期)，37℃剧烈摇动培养4.5小时

13.将培养物转入一离心管中，然后，4℃10,000rpm离心10min。上清液转入另一离心管中，再离心。

14.将80％的上清液上部转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4℃沉淀至少60分钟，最好过夜。

测定噬菌体滴度

1.接种ER2738单菌落于5-10ml LB培养基中，摇床培养至对数中期(OD600值约0.5)。

2.细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。保存于45℃备用。

3.37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。

4.在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。

5.建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：10⁸-10¹¹；未扩增的淘选洗脱物：10¹-10⁴。每个稀释度换一新鲜吸头，建议用带滤芯吸头以避免交叉污染。

6.当菌体培养物达对数中期，分成200μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。

7.每管加入10μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5分钟。

8.将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。

9.待平板冷却5分钟后，倒置于37℃培养过夜。

10.检查平板，计数有约10²个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10μl噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。

第三天

15. 4℃10,000rpm离心PEG沉淀15分钟。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。

16.沉淀物重悬于1ml TBS中，悬液转入微量离心管中，4℃离心5min使残余细胞沉淀。

17.上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15-60min。4℃离心10分钟，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。

18.沉淀物重悬于200μl TBS，0.02％NaN3中。离心1分钟，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱物。

19.根据上述“测定噬菌体滴度方法”用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。4℃贮存。

20.再包被一个板或孔准备第二轮淘选时用，见步骤1-3。

第四和第五天

21.计数板上蓝斑数确定滴度。用这个值来计算相应于2×10¹¹pfu的加入量。如果滴度太低，接下来的几轮淘选可用低至10⁹pfu的噬菌体加入量进行试验。

22.进行第二轮淘选：用第一轮淘选扩增的洗脱物中2×10¹¹pfu的噬菌体量重复步骤4-18，在清洗步骤中将Tween的浓度增至0.5％(v/v)。

23.在LB/IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度。

24.再包被一个板或孔准备第三轮淘选时用，见步骤1-3。

第六天

25.进行第三轮淘选：用第二轮淘选扩增的洗脱物中2×10¹¹pfu的噬菌体量重复步骤4-11，清洗步骤中同样用0.5％(v/v)的Tween。

26.在LB/IPTG/Xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度。第三轮洗脱物不必再扩增，滴度测定时得到的噬菌斑可做测序用：只要注意平板培养时间不要超过18小时，培养时间过长容易出现缺失。其余洗脱物4℃贮存。

27.挑一ER2738单克隆于LB-Tet培养基中培养过夜(不要接种稀释后的铺板培养物)。

对照淘选试验

按照上述程序，以链霉亲和素作为靶分子，在封阻液中加入0.1μg/ml的链霉亲和素以结合BSA中混有的少量生物素。用0.1mM的生物素(溶于TBS中)洗脱结合噬菌体，至少作用30分钟。经三轮富集/扩增后，得到链霉亲和素结合肽的共有序列如下：

CGXF/Y/WS/NHPQC，其中HPQ基序最为保守

结合克隆的特征鉴定

噬菌斑的扩增

1.将ER2738过夜培养物按1∶100稀释接种于LB培养基，分1ml到培养管中。每个要鉴定的克隆一管。一般情况下，由第三轮淘选物中取10个克隆便足以检测结合肽中的共有序列。

2.用灭菌牙签或吸头，挑一蓝色噬菌斑到上述1ml培养管中。注意：要从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选，以便保证每个被挑的噬菌斑仅含一个DNA序列。

3.37℃摇床培养4.5-5小时。

4.备选步骤。除测序单个克隆外，也可以对整个被选噬菌体集合进行测序。这样只通过一个步骤就可以得到共有结合序列，但这种情况只是当共有序列重复出现在每个克隆的7肽“框架”内相同位置的时候。加10μl未扩增的洗脱物到1ml稀释的过夜培养物中，37℃摇床培养4.5-5小时。

5.培养物转入微量离心管中，离心30sec。上清转入以新鲜管中，再离心。用移液器将80％的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液，可以4℃贮存几个星期而对滴度影响不大。长期贮存应用灭菌甘油1∶1稀释后，-20℃贮存。

测序模板的快速纯化(22)

1.按上述方法进行噬菌斑扩增，在第一步离心后，将500μl含噬菌体上清转入一新鲜离心管。

2.加200μl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10分钟。

3.离心10分钟，弃上清液。

4.短暂离心，小心吸去残余上清。

5.沉淀物彻底重悬于100μl碘化物缓冲液中，加入250μl乙醇。室温温育10分钟。短时间的室温温育使单链噬菌体DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。

6.离心10分钟，弃上清。用70％的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。

7.沉淀重悬于30μl TE[10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA]中。

8. 5μl的上述模板溶液足够进行35S或33P标记的手工双脱氧测序，或染料标记的自动循环双脱氧测序。根据测序方法的不同，适当增减模板用量。

实验结果

1.肽库筛选：

进行3轮筛选，每一轮结束后均记录噬菌体投入量及回收量，并计算回收率。结果见表5。

    表5 用MD2模拟小肽进行3轮亲和筛选中噬菌体回收率的改变

TU：transduced unit

2.测序结果：

对照组链霉亲和素拮抗多肽的测序结果为：

C1 CTG CGG ATG ACT CCA CGA ACC

C4 CTA AGG ATG CCA AAA AGA CCC

C5 CTA AGG ATG CCA AAA AGA CCC

那么，链霉亲和素拮抗多肽的氨基酸序列为上述从右至左的反义链，即：

C1 GGT TCG TGG AGT CAT CCG CAG    GSWSHPQ

C4 GGG TCT TTT TGG CAT CCT TAG    GSFWHPQ

C5 GGG TCT TTT TGG CAT CCT TAG    GSFWHPQ

因此，HPQ为强烈保守。

实验结论：

通过上述淘选过程，获得了15条候选多肽，但这15条多肽是否具有抗炎抗菌生物学作用，须通过下一步实验验证。

实验三利用细胞因子生成抑制实验筛选具有抗炎效应的MD2拮抗多肽

实验目的：实验二中我们初步获取了15条候选的可能具有抗炎作用的拮抗多肽，在本部分实验中，我们进一步利用炎症细胞因子生成抑制实验，力图筛选出几条作用明显的拮抗性多体。

实验方法

1.细胞培养：

将U937细胞株复苏后培养于含10％小牛血清的RPMI1640培养基，培养在25cm²的培养瓶内，置37℃，含5％CO₂的培养箱内。经过2-3次细胞传代以后，调整细胞计数为0.9×10⁶。U937需经佛波醇乙酯(Phorbol myristate acetate，PMA)刺激后才能分化为单核巨噬样细胞，加入20ng/ml PMA于U937细胞培养液中，37℃，5％CO₂培养箱内继续培养24h。

2.大量扩增噬菌体：

将ER2738过夜培养物按1∶100稀释接种于LB培养基，分10ml到培养管中。给每个要扩增的克隆准备一管，并编号。

取要扩增的噬菌体存储液200ul(实验组和对照组共16份样本，前一实验准备。)接种于上述10ml的稀释菌液中(1∶50)。

于37℃振荡培养4.5-5h，时间不能过长。

将培养物转到10ml离心管，10000rpm，4℃离心30S，移上清，再离心30S。将所得上清的80％转移分装：其中7ml转入离心管，4℃保存，以备后面的细胞因子生成抑制实验用；另外700ul装入EP管，并加入700ul甘油，备作噬菌体存储液，-20℃保存。

3.细胞因子生成抑制实验：

1)将经PMA刺激后的U937以Hanks液洗涤3遍后，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1×10⁵/ml。

2)将U937接种至96孔培养板上，每孔100ul。

3)将扩增的噬菌体离心10000rpm，30S，转移5ml包涵噬菌体的上清至新的离心管。

4)加入2mlPEG/NaCl，倒转混匀，室温放置30-60min。

5)离心10000rpm，10min，弃上清，再次离心30S，洗尽残余上清。

6)用1.5ml 0.9％生理盐水或者1640培养液悬浮沉淀。

7)将上述噬菌体100ul加入96孔细胞培养板上(内含U937)，并孵育1h。

8)1h后加入100ul LPS(终浓度为100ng/ml)

9)将上述细胞培养板放入37℃，5％CO₂培养箱内。

10)2h后收集细胞培养液上清，-20℃保存，待测细胞因子TNF-α；6h后收集细胞培养液上清，-20℃保存，待测细胞因子IL-6。

实验中设3个对照组：I组(U937)、II组(U937+LPS)、III组(U937+LPS+对照组噬菌体)，实验组为U937+LPS+噬菌体克隆下又分为11个克隆组。各组LPS的终浓度均为100ng/ml。

4.按ELISA试剂盒说明书分别测定TNF-α和IL-6的浓度。

1)从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条，其它板条请密封放回4℃。

2)除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中；用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90分钟。

3)洗板5次。

4)除空白孔外，加生物素化抗体工作液100ul/孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃，孵箱孵育60分钟。

5)洗板5次。

6)除空白孔外，加酶结合物工作液100ul/孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃，孵箱孵育30分钟。

7)洗板5次。

8)加入显色剂100ul/孔，37℃，避光，孵箱孵育20-25分钟。(视显色深浅灵活掌握)

9)加入终止液100ul/孔，混匀后即刻测量OD450值(5分钟内)。

*空白孔：仅加入底物和终止液，单波长检测时用以校准酶标仪的基准点。使用双波长检测可以不设。

5.具有抗炎效应的MD2拮抗多肽和无关多肽的合成：

将具有抗炎效应的MD2拮抗多肽以及无关多肽(将MD2拮抗多肽中无抗炎效应的一条作为无关多肽)委托生物技术公司进行合成，其纯度要求达95％以上，15mg，成品经过HPLC纯化，并经MS检测。

实验结果

阳性克隆筛选：

将实验二中，用于测序的噬菌体储存液共16个克隆，利用细胞因子生成抑制实验进行筛选，结果显示II组TNFα、IL-6含量显著高于I组(P＜0.01)，III组TNFα、I L-6含量与II组无显著差异(P＞0.01)。噬菌体克隆T4、T5、T6、T8、T10和T11组的TNFα、IL-6含量与III组有显著差别(P＜0.01)，见表6。

表6噬菌体展示肽对LPS诱导U937分泌TNFα，IL-6的抑制活性(n＝6，x±s)

#：P＜0.01，vs group II；*：P＜0.01，vs group III

表中T1-T15分别为实验二中初步获取的15条候选多肽

2.阳性噬菌体克隆DNA序列确定：

选取上述细胞因子生成抑制实验最好并具有统计学意义的3个噬菌体克隆(T6，T8，T11)，查出其DNA序列为：

T6   ATG ATT ATC CGG CAC CGT CTT

T8   ATT CCT AGT CAA CGG AGA ATC

T11  CCT ATA CAG AAA CTT CCC AAT

那么，要合成的序列为：

T6  AAG ACG GTG CCG GAT AAT CAT    Lys Thr Val Pro Asp Asn His

T8  GAT TCT CCG TTG ACT AGG AAT    Asp Ser Pro Leu Thr Arg Asn

T11 ATT GGG AAG TTT CTG TAT AGG    Ile Gly Lys Phe Leu Tyr Arg

3.具有抗炎效应的MD2拮抗多肽的人工合成：

由生物技术公司人工合成上述3条7肽，作为MD2的拮抗多肽；将MD2拮抗多肽中无抗炎效应的一条作为无关多肽(序列为：GGT TCG TGG AGT CATCCG CAG)并人工合成。3条多肽各15mg，纯度96％以上，成品经过HPLC纯化，并经MS检测确证。

实验四.具有抗炎效应的MD2拮抗多肽与MD2的亲和力鉴定

实验目的：通过体外实验验证上述3条筛选出的拮抗多肽是否与MD2发生直接的相互结合作用，这是拮抗肽发挥生物活性作用的基础。

实验方法：利用生物素标记转移验证两种蛋白的结合

主要试剂的配制

10％SDS：(100ml，PH7.2)

SDS           10g

温热去离子    定容至100ml

加热至68℃助溶，用稀HCl调PH至7.2。

1.5mol/L Tris缓冲液：PH8.8  100ml

Tris                        18.165g

三蒸水                      80ml

HCl调pH值为8.8，三蒸水定容至100ml；

1mol/L Tris缓冲液：PH 6.8   100ml

Tris                        12.114g

去离子                      80ml

HCl调PH值为6.8，三蒸水定容至100ml

电转移缓冲液：1000ml

甘氨酸        39mmol/L    -----2.9

Tris碱        48mmol/L    -----5.8

SDS(电泳级)   0.037％     -----0.37

甲醇          20％        -----200ml

三蒸水定容至1L

5×Tris甘氨酸电泳缓冲液储存液：1000ml

Tris碱                 15.1g

甘氨酸(电泳级，PH8.3)  94g

溶于900ml去离子水，然后加入SDS(10％，电泳级)50ml储存液，定容至1000ml。

10×TBS缓冲液：

Tris碱                        24.2g

NaCl                          80g

以HCl调pH至7.6

1×TBST洗脱液

三蒸水                        900ml

10×TBS                       100ml

Tween-20                      0.5ml

30％丙烯酰胺溶液(100ml)

丙烯酰胺(29％)                29g

N，N｀-亚甲双丙烯酰胺(1％)    1g

温热去离子水定容至100ml，0.45um滤膜过滤除菌，查证该溶液的PH值应不大于7.0，棕色瓶分装，室温保存。

10％过硫酸胺(APS)

过硫酸胺        0.1g

去离子水        定容至1ml

※现用现配

PBS(磷酸盐缓冲液)1000ml

NaCl             8g

KCl              0.2g

Na₂HPO₄          1.44g

KH₂PO₄           0.24g

三蒸水           800ml

HCl调节PH值至7.4，加水定容至1L，15lbf/in²(1.034×10⁵Pa)高压蒸汽灭菌20分钟，室温保存。

5×SDS凝胶加样缓冲液：5ml

Tris(PH6.8)  0.25mol/L 1mol/L Tris缓冲液(PH6.8)    1.25ml

SDS(电泳级)  10％                                  0.5g

溴酚蓝       0.5％                                 0.025g

甘油         50％                                  2.5ml

灭菌水                                             1.25ml

混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。

15％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶：10ml

水                               2.3ml

30％丙烯酰胺混合液               5.0ml

1.5mol/L Tris(PH8.8)             2.5ml

10％SDS                          0.1ml

10％过硫酸胺                     0.1ml

TEMED                            0.004ml

聚丙烯酰胺凝胶电泳5％积层胶：8ml

水                           5.5ml

30％丙烯酰胺混合液           1.3ml

1.0mol/L Tris(PH6.8)         1.0ml

10％SDS                      0.08ml

10％过硫酸胺                 0.08ml

TEMED                        0.008ml

实验操作流程

用Sulfo-SBED标记诱导蛋白(MD2)：

1.配制PBS500ml，以超纯水稀释，过滤消毒，4℃贮存。

2.以PBS溶解或稀释MD2蛋白，浓度为500ug/ml，反应容积范围在80ul。将MD2溶液转移到一个琥珀色或铝箔覆盖的聚丙烯微量离心管内。

3.计算Sulfo-SBED的用量，比MD2超出1～5mol数。

4.将装有Sulfo-SBED并覆盖箔纸的微量管刺孔，加入100ulDMF，用移液管尖轻柔混合直到Sulfo-SBED溶解为止。此时Sulfo-SBED的浓度为10ug/ul。

5.如果我们需要10ug Sulfo-SBED，则加入上述已配好的Sulfo-SBED溶液1ul至MD2溶液中，轻柔混合并用铝箔遮盖反应管或置暗室室温孵育30min，或者4℃2h。

6.准备1X标记转移液：将15ml 20X标记转移液用285ml超纯水稀释。

7.仔细将标记反应液80ul移至一个MINI Dialysis管(试剂盒提供)内并盖上盖子。如果反应液多于100ul，则移至多个MINI Dialysis管。将包含有MD2蛋白的MINI Dialysis管插入提供的浮体中，并将浮体放入装有500ml1X标记转移液的烧杯中。

8.用铝箔遮盖烧杯并透析5h，以完全去除没有反应的连接物。

9.透析完成后，Sulfo-SBED标记的MD2将准备与捕获蛋白(多肽)通过标记转移液发生反应。按一次量分装Sulfo-SBED标记的MD2溶液，并避光贮存于-80℃，避免反复冻融。

B.蛋白的相互作用及交联

1.将标记SBED的MD2蛋白分别加入两条MD2拮抗多肽中。将标记的MD2(500ug/ml)10ul分别加入两条多肽中(多肽浓度为250ug/ml，体积为20ul)。将SBED标记的MD2蛋白与多肽室温下孵育30min。注意避光，直到完成交联作用。

2.用UV光源(300-370nm)照射激活SBED交联复合物的过程虽然可在室温下完成，但用高瓦特灯源照射时可使样品产热，因此最好将样品置于冰上。照射时间应随灯源强度的变化而不同，按如下标准：

180瓦灯    照射5min    距离样品10cm

C.Western blot分析

1.刺破箔纸覆盖的二硫苏糖醇(DTT)微量管，加入50ul超纯水达到1M DTT。

2.加入50ul 1MDTT至50ul非还原样品buffer(5×SDS凝胶加样缓冲液)。

3.将15ul样品分别加入两个新的微量管中，其中一个加入1/5体积的还原样品buffer(步骤2准备)，DTT的终浓度必须是100mM，以还原二硫键。另一个微量管加入1/5体积的非还原样品buffer(5×SDS凝胶加样缓冲液)。混旋两个微量管。

4.加热样品70℃，5min。

5.将样品高速离心10000bpm，30Sec，然后进行上样。

6.将样品做聚丙烯酰胺凝胶电泳。采用5％积层胶和15％分离胶，先用80V恒压电泳1h后，再以150V恒压电泳约2h，待溴酚蓝指示剂进入分离胶的2/3处时(以防小分子的多肽电泳至分离胶外)，停止电泳。

7.转移蛋白到PVDF膜上。取与凝胶大小一致的PVDF膜，在甲醇中浸泡15Sec至半透明，用清水冲洗干净，放入转移缓冲液中平衡15min；将Whatman滤纸和海绵同样用转移液浸泡后，按海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵依次组合，并排尽各层间的空气，放入转移槽中，方向为：胶面向阴极，膜面向阳极。50V恒压电转移约12h，4℃。

8.取下电转移的PVDF膜，以PBS洗膜5min×3。

9.用5％BSA封闭膜，室温，30min。

10.以PBS洗膜5min×3。

11.加入链亲酶素偶联的辣根过氧化物酶(4-20ng/ml)作用30min～60min，水浴37℃。用100ul超纯水配制链亲酶素偶联的辣根过氧化物酶的储存液(1mg/ml)，4℃可保存1月以上，或按1次用量分装，贮存于-20℃。

12.以PBS洗膜10min×5。

13.将PVDF膜放入化学发光试剂中反应1～2min，并用保鲜膜包好，暗室中使用X片暴光，常规方法显影、定影。

实验结果：

参见附图2。

实验结论：

通过生物素标记转移，结合Western Blot实验证实，只有其中2条拮抗多肽可与MD2发生直接结合。

实验五.MD2拮抗多肽的生物学活性验证

实验目的：对实验四中筛选出的2条拮抗多肽，利用3种炎症细胞模型，分别采用不同的作用浓度，观察这2条拮抗多肽的抗炎抗菌生物活性

实验方法：

1.U937和THP-1的细胞培养：

将U937和THP-1细胞株复苏后分别培养于含10％小牛血清的RPMI1640培养基，培养在25cm²的培养瓶内，置37℃，含5％CO₂的培养箱。经过2-3次细胞传代以后，调整细胞计数为0.5～0.9×10⁶。U937和THP-1均需经佛波醇乙酯(Phorbolmyristate acetate，PMA)刺激后才能分化为单核巨噬样细胞，加入20ng/ml PMA于U937细胞培养液中，37℃，5％CO₂培养箱内继续培养24h；加入100ng/ml PMA于THP-1细胞培养液中，37℃，5％CO₂培养箱内继续培养24h。

2.分离人外周血单核细胞(PBMC)(密度梯度离心法)：

1)从血液中心获取健康成人抗凝全血100ml，与Hank’s液1∶1混合进行稀释。

2)吸取20ml人单核细胞分离液置于50ml离心管中，然后将离心管倾斜45度角，将20ml稀释后的血液加在单核细胞分离液界面，注意距分离液界面约1cm处沿管壁缓缓加入。

3)将离心管置水平式离心机内，室温条件下1500rpm离心20min。

4)离心后，管内分为三层，上层为血浆和Hank’s液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为单核细胞分离液，在上、中层界面处有一层以单个核细胞为主的白色云雾样狭窄带，以无菌吸管轻轻插入此层内，吸出该层物。

5)将所得悬液盛入含Hank’s液4-5ml的无菌离心管中，充分混匀后，以2000rpm离心10min，吸去上清液，沉淀经Hank’s液反复洗2次。

6)以10ml RPMI1640重悬之。

7)细胞计数并检测细胞活力。

8)以1.5×10⁶/ml的密度(用含30％人AB血清的1640稀释)接种于6孔培养板内，37℃，5％CO₂孵箱内培养6-8h。

9)将非贴壁细胞组分(淋巴细胞)用不含血清的1640洗涤除去。

10)收集贴壁细胞，即得所需的外周血单核细胞(peripheral bloodhistomonocyte)。

11)细胞计数。

12)以1×10⁵/ml的密度(用含10％人AB血清的1640稀释)接种于96孔细胞培养板上。

13)37℃，5％CO₂孵箱内培养30min。

3.分组：

将上述准备好的3种细胞分别设3个对照组：I组(巨噬细胞)，II组(巨噬细胞+LPS)，III组(巨噬细胞+LPS+无关多肽)；实验组为(巨噬细胞+LPS+拮抗多肽)，其中拮抗多肽3条，分别采用两种浓度(T6，T8，T11：200ug/ml；T6’，T8’，T11’：100ug/ml)，与巨噬细胞和LPS一起孵育6h，LPS的终浓度为100ng/ml。培养6h后回收细胞上清液，-20℃冰箱保存待测TNFα和IL-6。

4.测定巨噬细胞经LPS刺激后的TNFα含量：

按晶美试剂盒说明书操作，过程如下：

1)算好需要检测的样品个数及标准品和空白对照的孔数。

2)从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条，其它板条请密封放回4℃。

3)除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中；用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90分钟。

4)洗板4次。

5)除空白孔外，加生物素化抗体工作液100ul/孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃，孵箱孵育60分钟。

6)洗板5次。

7)除空白孔外，加酶结合物工作液100ul/孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃，孵箱孵育30分钟。

8)洗板5次。

9)加入显色剂100ul/孔，37℃，避光，孵箱孵育20-25分钟。(视显色深浅灵活掌握)

10)加入终止液100ul/孔，混匀后即刻测量OD₄₅₀值(5分钟内)。

*空白孔：仅加入底物和终止液，单波长检测时用以校准酶标仪的基准点。使用双波长检测可以不设。

注意：手工洗板的方法：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干，洗5次。

5.测定巨噬细胞经LPS刺激后的IL-6含量：按晶美试剂盒说明书操作，过程同TNFα。

实验结果

1.外周血单核细胞的分离纯化：

1)抗凝全血经单核细胞分离液密度梯度离心后，PBMC的分离效果，如下图，管内可分为四层，上层为血浆、Hank’s液和大部分血小板；下层主要为红细胞和粒细胞；中层为单核细胞分离液；在单核细胞分离液与血浆交界部位有一层白色云雾样狭窄带即为单个核细胞层

2)PBMC细胞计数：

100ml抗凝全血分离得到的PBMC细胞总数为1×10⁷，接种于96孔培养板内，每孔的细胞数为1×10⁵，以供实验用。

3)细胞活力检测：2％台酚蓝染色结果示PBMC细胞活力大于95％。

2.U937经LPS刺激后MD2拮抗多肽的抑炎效应：

两种浓度的2条MD2拮抗多肽与经PMA分化后的U937和LPS培养6h后，测定细胞因子TNFα，IL-6含量，结果显示II组TNFα、IL-6含量显著高于I组(P＜0.01)，III组TNFα、IL-6含量与II组无显著差异(P＞0.05)。两种浓度的3条多肽与II组、III组有非常显著差别(P＜0.01)，并且有剂量依赖关系，见表7。

表7  2条拮抗多肽对经LPS诱导U937分泌TNFα，IL-6的抑制活性(n＝6，x±s)

I组(巨噬细胞)，II组(巨噬细胞+LPS)，III组(巨噬细胞+LPS+无关多肽)；

T6拮抗多肽1，200μg；T11拮抗多肽2，200μg；

T6’拮抗多肽1，100μg；T11’拮抗多肽2，100μg；

#P＜0.01，vs group II；*：P＜0.01，vs group III

3.THP-1细胞株经LPS刺激后MD2拮抗多肽的抑炎效应：

两种浓度的2条拮抗多肽与经PMA分化后的THP-1和LPS培养6h后，测定细胞因子TNFα，IL-6含量，结果显示II组TNFα、IL-6含量显著高于I组(P＜0.01)，III组TNFα、IL-6含量与II组无显著差异(P＞0.01)。两种浓度的3条多肽与II组、III组有显著差别(P＜0.01)，但无剂量依赖关系，见表8。

表8  2条MD2拮抗多肽对经LPS诱导THP-1分泌TNFα，IL-6的抑制活性(n＝6，x±s)

I组(巨噬细胞)，II组(巨噬细胞+LPS)，III组(巨噬细胞+LPS+无关多肽)；

T6拮抗多肽1，200μg；T11拮抗多肽2，200μg；

T6’拮抗多肽1，100μg；T11’拮抗多肽2，100μg；

# P＜0.01，vs group II；*：P＜0.01，vs group III。

4.人外周血单核细胞经LPS刺激后MD2拮抗多肽的抑炎效应：

两种浓度的2条拮抗多肽与人外周血单核细胞和LPS培养6h后，测定细胞因子TNFα，IL-6含量，结果显示II组TNFα、IL-6含量显著高于I组(P＜0.01)，III组TNFα、IL-6含量与II组无显著差异(P＞0.01)。两种浓度的2条多肽与II组、III组有显著差别(P＜0.01)，但无剂量依赖关系，见表9。

表9  2条MD2拮抗多肽对经LPS诱导PBMC分泌TNFα，IL-6的抑制作用(n＝6，x±s)

I组(巨噬细胞)，II组(巨噬细胞+LPS)，III组(巨噬细胞+LPS+无关多肽)；

T6拮抗多肽1，200μg；T11拮抗多肽2，200μg；

T6’拮抗多肽1，100μg；T11’拮抗多肽2，100μg；

# P＜0.01，vs groupII；*：P＜0.01，vs group III

实验六 MD2拮抗多肽对细菌内毒素攻击小鼠的保护作用

实验目的：

进一步利用细菌内毒素制备感染动物模型，观察2条拮抗多肽的抗炎抗菌作用

材料和方法

1.动物来源：

Balb/c小鼠48只，6-8周龄，雄性，体重20-21g。(来源于重庆医科大学实验动物中心)

2.主要试剂：

小鼠TNF-αELISA试剂盒              晶美生物工程

小鼠IL-6ELISA试剂盒                晶美生物工程

LPS(0111：B4)                      Sigma，美国

Triton-X                           Sigma，美国

D-PBS                              Sigma，美国

蛋白酶抑制剂片                     Roche，英国

戊二醛

4％多聚甲醛

3条MD2拮抗多肽                     吉尔生化，上海

无关多肽                           吉尔生化，上海

地塞米松                           上海

3.主要试剂的配制：

1)PBS(磷酸盐缓冲液)1000ml

NaCl               8g

KCl                0.2g

Na₂HPO₄            1.44g

KH₂PO₄             0.24g

三蒸水             800ml

HCl调节PH值至7.4，加水定容至1L，15lbf/in²(1.034×10⁵Pa)高压蒸汽灭菌20分钟，室温保存。

2)0.1％Triton-X in D-PBS

D-PBS                 0.96g

Triton-X               0.1g

溶于100ml双蒸水。

3)3条多肽的配制：200ug/ml，100ug/ml

4)阴性对照无关多肽的配制：200ug/ml

5)阳性对照地塞米松的配制：100ug/ml

6)LPS的配制：400ug/ml

实验方法

1.分组：

将小鼠分为5组，

C组(正常对照组)：每只小鼠腹腔注射1ml生理盐水；

I组：每只小鼠腹腔注射1ml LPS(400ug/ml)溶液；

II组(阴性对照)：每只小鼠在用LPS处理前1h注射1ml无关多肽溶液；

III组(阳性对照)：每只小鼠在用LPS处理前1h注射1ml地塞米松(100ug/ml)；

实验组分为3条多肽，分别采用两种浓度(T6，T8，T11：200ug/ml；

T6’，T8’，T11’：100ug/ml)每只小鼠在用LPS处理前1h分别注射1ml多肽。

2.观察经上述处理后的24h死亡率。

3.在LPS注射后6h脱颈处死小鼠。

4.摘除小鼠眼球抽取血液，血清贮存于-20℃待测炎症因子含量。

5.切除肺组织、肝组织(冰上操作)，冰冻保存(液氮过一下，再放于-70C)。

6.收集组织匀浆液上清：

1)将匀浆器钻头(最小型号)在戊二醛中浸泡30min。

2)将Roche公司的蛋白酶抑制剂片放入已配制好的0.1％Triton-X in D-PBS中，每10ml加一片，待其溶解，作为组织匀浆液。

3)将一部分肺组织尽量剪碎后，放入10ml离心管，加入上述组织匀浆液，(0.2g组织加1ml匀浆液)，用组织匀浆器研磨。

*注意：所有操作均在冰上进行；

每一标本均匀浆30S左右，保持匀浆时间一定；

不同标本，钻头均用双蒸水清洗。

4)将肺组织匀浆离心12000g*10min，肺组织匀浆上清回收，贮存于-20℃待测炎症因子的含量。

7.测定小鼠血清和肺组织匀浆的TNFα浓度：

按晶美试剂盒说明书操作，过程如下：

1)算好需要检测的样品个数及标准品和空白对照的孔数。

2)从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条，其它板条请密封放回4℃。

3)除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中；用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90分钟。

4)洗板4次。

5)除空白孔外，加生物素化抗体工作液100ul/孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃，孵箱孵育60分钟。

6)洗板5次。

7)除空白孔外，加酶结合物工作液100ul/孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃，

孵箱孵育30分钟。

8)洗板5次.。

9)加入显色剂100ul/孔，37℃，避光，孵箱孵育20-25分钟。(视显色深浅灵活掌握)

10)加入终止液100ul/孔，混匀后即刻测量OD₄₅₀值(5分钟内)。

8.测定小鼠血清和肺组织匀浆的IL-6浓度：

按晶美试剂盒说明书操作，过程同TNFα。

9.病理形态学检查：

在LPS注射6h后脱颈处死小鼠，立即取肺组织标本，福马林固定后石蜡包埋、切片行HE染色，然后在光镜下观察组织学改变。

实验结果

1.仅注射LPS组，小鼠表现为急性患病的症状，出现嗜睡无力，畏寒，皮毛卷曲。但经预先注射MD2拮抗多肽的小鼠明显症状要轻得多。

2.肺组织病理学：肺大体观察，正常对照组肺外观呈粉红色；内毒素血症组肺体积增大，表面暗红；MD2拮抗多肽治疗组病变较内毒素血症组无明显区别。光镜下，内毒素血症和无关多肽组肺泡隔增宽，部分肺泡内见渗出、水肿、出血，肺间质见大量炎症细胞浸润；MD2拮抗多肽治疗组较内毒素血症肺损伤组明显减轻。

(图片见附图说明部分)

3.分别采用不同剂量的拮抗多肽(T6，T11，为200μg；T6’，T11’为100μg)治疗后，内毒素血症小鼠血清TNFα，IL-6含量明显减低。见表10。

表102条MD2拮抗多肽对内毒素血症小鼠血清TNFα，IL-6的抑制活性(n＝8，x±s)

#：P＜0.05，vs group II；*：P＜0.05，vs group III

C：未加入LPS对照组             I：单纯LPS组

II：无关多肽+LPS组             III：地塞米松+LPS组

T6：结合肽1(200μg)+LPS组      T11：结合肽2(200μg)+LPS组

T6’：结合肽1(100μg)+LPS组    T11’：结合肽2(100μg)+LPS组

4.分别采用不同剂量的拮抗多肽(T6，T11，为200μg；T6’，T11’为100μg)治疗后，内毒素血症小鼠肺组织TNFα，IL-6含量明显减低。见表11

表11 2条MD2拮抗多肽对内毒素血症小鼠肺组织匀浆TNFα，IL-6的抑制活性(n＝6，x±s)

#：P＜0.05，vs group II；*：P＜0.05，vs group III

C：未加入LPS对照组               I：单纯LPS组

II：无关多肽+LPS组               III：地塞米松+LPS组

T6：结合肽1(200μg)+LPS组        T11：结合肽2(200μg)+LPS组

T6’：结合肽1(100μg)+LPS组      T11’：结合肽2(100μg)+LPS组

5.内毒素血症小鼠及经MD2拮抗多肽干预后小鼠的死亡率

仅注射LPS组，小鼠24h死亡率为100％，而经结合肽1或结合肽2干预后，小鼠的死亡率分别下降到55.6％。

实验结论：

通过本部分实验我们可以得出以下结论：

1.这2条拮抗肽可显著降低细菌内毒素攻击小鼠的死亡率，死亡率分别由100％下降至55.6％；

2.2条拮抗多肽，可显著减轻细菌毒素攻击小鼠肺组织的炎症性病理反应；

3.2条拮抗多肽可显著减低细菌内毒素攻击小鼠肺组织炎症因子白介素6，肿瘤坏死因子的表达；

4.2条拮抗肽可显著减低细菌内毒素攻击小鼠血液中炎症因子白介素6，肿瘤坏死因子的产生；

因此，上述步骤筛选出的这2条拮抗肽：即序列1：Lys Thr Val Pro Asp Asn His的拮抗多肽和序列2：Ile Gly Lys Phe Leu Tyr Arg的拮抗多肽具有明显的抗炎，抗菌活性，并能有效保护细菌毒素对机体的攻击。可在制备治疗由革兰氏阴性菌所导致的感染，过度炎症性损伤的生物多肽制剂中的应用；或在制备治疗由toll样受体所诱导的炎症性疾病的生物多肽制剂中的用途。具有非常明显的临床应用前景。

 本发明涉及的多肽序列

<110>中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所

<120>模拟MD2的抗菌抗炎拮抗多肽

<160>2

<170>PatentIn Version 2.1

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>人(Human.)

<220>

<221>misc_feature

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<400>1

Lys Thr Val Pro Asp Asn His

1                 5

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>人(Human.)

<220>

<221>misc_feature

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<400>2

Ile Gly Lys Phe Leu Tyr Arg

1                  5

Claims (4)

1.一种能模拟MD2蛋白的拮抗多肽，其特征是在于该拮抗多肽的氨基酸序列为：

Lys Thr Val Pro Asp Asn His。

2.权利要求1所述的拮抗多肽在制备治疗革兰氏阴性菌所致的感染的生物多肽制剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述感染为因革兰氏阴性菌所导致的过度炎症性损伤。

4.权利要求1所述的拮抗多肽在制备治疗由脂多糖通过TLR4/MD2所诱导的炎症疾病的生物多肽制剂中的用途。

Images