CN105567620B - 一株产减毒类脂A的Cronobacter sakazakii突变株及其应用 - Google Patents

一株产减毒类脂A的Cronobacter sakazakii突变株及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105567620B
CN105567620B CN201610065729.6A CN201610065729A CN105567620B CN 105567620 B CN105567620 B CN 105567620B CN 201610065729 A CN201610065729 A CN 201610065729A CN 105567620 B CN105567620 B CN 105567620B
Authority
CN
China
Prior art keywords
esa
cronobacter sakazakii
sakazakii
bacterium
baa894
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610065729.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105567620A (zh
Inventor
李颜颜
王小元
刘璐
王琳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201610065729.6A priority Critical patent/CN105567620B/zh
Publication of CN105567620A publication Critical patent/CN105567620A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105567620B publication Critical patent/CN105567620B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
    • A61K2039/55594—Adjuvants of undefined constitution from bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一株产减毒类脂A的Cronobacter sakazakii突变株及其应用，属于基因工程技术领域。本发明的Cronobacter sakazakii突变株的ESA‑03574基因片段进行敲除，使Cronobacter sakazakii菌株对阳离子抗菌肽抗性显著降低、更容易被抗菌肽杀死，本发明的Cronobacter sakazakii突变株细胞激活TLR4免疫通路的能力减弱，对细胞毒性减弱，有利于疫苗佐剂的开发。

Description

一株产减毒类脂A的Cronobacter sakazakii突变株及其应用
技术领域
本发明涉及一株产减毒类脂A的Cronobacter sakazakii突变株及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
阪崎克罗诺肠杆菌(Cronobacter sakazakii)是一种自然界中广泛存在的食源性革兰氏阴性致病菌，主要污染婴儿配方奶粉。它可以引起新生儿脑膜炎、败血病、菌血症及坏死性小肠结膜炎等疾病。近些年的研究表明，有些革兰氏阴性菌的致病能力与其外膜类脂A的分子结构密切相关，但关于阪崎克罗诺肠杆菌类脂A分子修饰及作用还有待研究。
细菌细胞膜表面的LPS并不是一个稳定的结构，细菌处于特定条件下是会对其结构进行不同的修饰，这些修饰赋予了细菌对抗菌剂的抗性，以及提升了入侵宿主的能力。PmrA-PmrB是一个二元调控系统，调控多种发生在LPS上的化学修饰，并且它可以在多种细菌物种内行使作用。PmrA-PmrB的修饰作用可以增强细菌对阳离子抗菌肽粘菌素的抗性以及细菌在巨噬细胞中的复制能力。同时，PmrA-PmrB二元调控系统还对细胞的生命活动有着整体的影响，可以影响细菌的毒性。
疫苗佐剂(Vaccine adjuvant)，又称免疫增强剂(Immunomodulator)，是在疫苗接种过程中辅助疫苗作用、改善或增强疫苗作用效果的一类物质。免疫佐剂需具备有效激起非特异性免疫反应，增强机体对某疫苗的免疫原性或保护性应答的能力。
如何降低菌株毒性以便制备疫苗佐剂是目前亟需解决的问题之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供C.sakazakii的类脂A分子中修饰相关的基因工程菌，检测该修饰对菌株的影响。
本发明的第一个目的是提供一种Cronobacter sakazakii的基因工程菌，所述基因工程菌缺失了ESA-03574基因片段。
在本发明的一种实施方式，所述ESA-03574基因片段的核苷酸序列是SEQ ID NO:1的序列。
在本发明的一种实施方式，所述基因工程菌为无抗性C.sakazakii BAA894△ESA-03574，以Cronobacter sakazakii BAA894为出发菌、缺失了核苷酸序列为SEQ ID NO:1的ESA-03574基因片段。
在本发明的一种实施方式，所述基因工程菌的构建方法如下：将人工构建的ESA-03574敲除片段电转化入含pKD46质粒的C.sakazakii BAA894，获得突变株C.sakazakiiBAA894ΔESA-03574-loxPkan，再化转入pKD-Cre质粒(参考文献：Yaning Han,Construction of Monophosphoryl Lipid A Producing Escherichia coli Mutants andComparison of Immuno-Stimulatory Activities ofTheir Lipopolysaccharides,Marine Drugs,2013,11,363-376)，通过位点特异性重组敲除卡那霉素抗性基因；去除pKD-Cre质粒后获得无抗性lipidA的基因结构突变的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式，所述ESA-03574敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的第二个目的是提供一种降低Cronobacter sakazakii对阳离子抗菌肽抗性和/或降低Cronobacter sakazakii对HEK4细胞刺激作用的方法，所述方法是敲除Cronobacter sakazakii菌的ESA-03574基因片段。
在本发明的一种实施方式，所述Cronobacter sakazakii菌株为BAA894；所述ESA-03574基因片段的核苷酸序列是SEQ ID NO:1的序列。
在本发明的一种实施方式，敲除了ESA-03574基因片段的Cronobacter sakazakii菌在低pH(比如pH 5)条件下作用。
在本发明的一种实施方式，所述降低Cronobacter sakazakii对HEK4(即HEK-BluehTLR4)细胞刺激作用，检测方法如下：
HEK-Blue hTLR4细胞为弱贴壁细胞，细胞培养体系：DMEM高糖培养基+10％FBS+100U/mL-100μɡ/mL Pen-Strep双抗+100μɡ/mL Normocin多效抗生素，于37℃，5％CO2条件下培养，并隔代添加1×HEK-Blue筛选液进行筛选。细菌菌体收集后用无热源磷酸缓冲液(PBS)洗两次，再用PBS梯度稀释加入96孔板，每孔0.02mL，无菌PBS作为对照；HEK-BluehTLR4细胞收集计数后用HEK-BlueTM检测液重悬，将0.18mL细胞悬液接种到96孔板，每孔1.4×105个细胞，C.sakazakii BAA894和C.sakazakii BAA894ΔESA-03574细菌和HEK-BluehTLR4细胞混合培养12h检测OD630nm的吸光度，吸光度读数值与TLR4信号通路激起的强度成正比。
本发明的第三个目的是提供所述基因工程菌在阳离子抗性肽及疫苗佐剂方面应用。
本发明的有益效果：
本发明通过将Cronobacter sakazakii菌株的ESA-03574基因片段进行敲除，使Cronobacter sakazakii菌株对阳离子抗菌肽抗性降低了32倍、更容易被抗菌肽杀死，Cronobacter sakazakii突变株细胞在低pH下激活TLR4免疫通路的能力减弱，对TLR4的刺激能力减弱，对细胞毒性减弱，对后期免疫反应产生细胞因子开发疫苗佐剂有一定的帮助，有利于疫苗佐剂的开发。
附图说明
图1 pH 7.0和pH 5.0条件下Cronobacter sakazakii BAA894ΔESA-03574的类脂A的ESI/MS分析；
图2 pH 5.0条件下ESA-03574对ESA-02008基因转录的调控；
图3 BAA894野生型和突变株的外膜渗透性；
图4 C.sakazakii BAA-894和C.sakazakii BAA-894ΔESA-03574突变菌株对TLR4信号通路的激活能力。
具体实施方式
类脂A的的结构鉴定与分析：
ESI/MS分析：类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在WATERS SYNAPT Q-TOFMass Spectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用ESI离子源，阴离子检测模式，检测范围小于m/z 2500。
实施例1突变株C.sakazakii BAA894△ESA-03574的构建
1、ESA-03574基因敲除片段的获得
采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得ESA-03574基因敲除片段，其两端分别为ESA-03574基因上下游同源臂、中间为带有LoxP位点的kan片段。ESA-03574基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将ESA-02008和ESA-03574基因敲除片段分别克隆到pBlueScript II SK(+)，获得重组质粒pBlueScript II SK(+)-ESA-03574U-Lkan-ESA-03574D。以该质粒为模板，可以扩增获得敲除片段ESA-03574U-Lkan-ESA-03574D。
2、敲除感受态的制备及电转化
接种带有Red重组辅助质粒pKD46(Datsenko K A,Wanner B L.One-Stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.ProcNatlAcadSci USA,2000,97(12):6640-6645)的CronobactersakazakiiBAA894于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养。按2％接种量转接100mL LB液体培养基，30℃，200rpm培养至OD600＝0.2时加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导重组酶的表达，继续培养OD600＝0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4℃，4000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的10％甘油洗涤3次，最后用1mL 10％甘油悬浮，每管80μL分装至预冷的无菌EP管中。
将500-1000ng ESA-03574敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1.5kv电击5ms，30℃孵育2h，涂布30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，30℃培养，挑取转化子于含30μg/mL卡那霉素及100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，PCR验证结果。
3、突变株抗性标记的去除
将PCR验证阳性的菌株接种含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，42℃过夜培养，将培养液划线30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，37℃培养，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素的敏感性，将含有卡那霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为和C.sakazakiiBAA894△ESA-03574::kan并保藏。以此为出发菌株做感受态，转入pKD-Cre质粒，42℃热激表达FLP酶，将阳性菌株于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导Cre重组酶的表达，介导LoxP位点特异性重组，PCR验证挑选转化子。将PCR验证正确的菌株42℃热激后划线LB平板，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素及卡那霉素的敏感性，选取对两种抗生素均敏感的菌株命名为和C.sakazakiiBAA894△ESA-03574并保藏。
实施例2BAA894ΔESA-03574对ESA-02008基因转录的影响。
总RNA提取：利用Simply P Total RNA Extrection Kit(购自Bioflux公司)分别提取BAA894和BAA894ΔESA-03574在pH 5.0条件下的总RNA。以去除DNA污染的RNA为模板，利用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(购自Thermo Scientific)合成cDNA。以16S rRNA作为内参，每组三个平行，检测ESA-02008在低pH下的转录水平。
已有报道显示ESA-03574即pmrA，在E.coli和S.typhimurium中，pmrA位于pmrCAB操纵子中，调控pmrC的表达。然而，本发明发现C.sakazakii BAA894中ESA-02008(即pmrC)，在低pH条件下的转录水平依旧很高，说明ESA-03574的缺失，并不影响ESA-02008的表达，也就是说该基因不在调控ESA-02008。
本发明发现C.sakazakii BAA894中ESA-02008不属于pmrCAB操纵子中，并不受ESA-03574的调控。
实施例3突变菌株C.sakazakiiΔESA-03574的类脂A的结构进行ESI/MS分析。
类脂A的提取方法采用氯仿/甲醇/H2O溶液混合相萃取法。将过夜培养的菌液按初始OD600＝0.02转接到200mL LB液体培养基中，37℃培养至菌体对数期后期时，4000rpm离心30min收集菌体，ddH2O洗涤菌体一次后用Bligh-Dyer一相体系(氯仿/甲醇/水溶液，1:2:0.8，v/v/v)76mL悬浮菌体，磁力搅拌1h，2000rpm离心30min分相，使用一相体系洗涤细胞碎片2-3次；加入27mL 12.5mM的醋酸钠(PH4.5)溶液，超声震荡2min，100℃水浴30min裂解糖链。冷至室温后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成Bligh-Dyer二相体系(氯仿/甲醇/水，2:2:1.8，v/v/v)，2000rpm离心30min，取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发。加入氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)将lipidA洗出。类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在WATERS SYNAPT Q-TOFMass Spectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用ESI离子源，阴离子检测模式，检测范围小于m/z 2500。
质谱结果分析显示，ESA-03574基因缺失之后，ESA-02008修饰的峰值1868仍然存在，也就是说该基因的缺失不影响ESA-02008的表达。ESA-02008不再受ESA-03574的调控。
实施例4突变株细菌外膜渗透性
NPN是一种非极性荧光探针分子，它可以在疏水环境中表现出荧光吸收特性，因此这种物质可以作为研究细菌外膜渗透性的探针分子。
将过夜培养的菌液按照初始OD600＝0.02转接到50ml LB液体培养基中，37℃，200rpm/min培养至OD600＝1.0，离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤一次并重悬。将1.92ml重悬菌液和80μl 1mmol/l的NPN溶液加入石英比色皿中，混合之后测定荧光吸收值，这一数值的大小代表细胞外膜渗透性的大小。荧光分光光度计激发波长为350nm，发射波长为420nm，缝宽5mm。结果如图3所示，可知：该基因缺失之后，细胞膜的通透性变强，对一些抗生素的抵抗能力会减弱，更容易被杀死。
实施例5突变株对阳离子抗性肽的抗性
采用微量肉汤稀释法分别测定C.sakazakii BAA894菌株对阳离子抗性肽的MIC值。
粘菌素是由多粘芽孢杆菌产生的一组多肽类抗生素。其环形多肽部分的氨基与细菌外膜脂多糖的2价阳离子结合点产生静电相互作用，使外膜的完整性破坏，导致胞浆内的磷酸、核苷等小分子外溢，引起细胞功能障碍直至死亡。
抗生素用LB液体培养基倍比稀释，使浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.19μg/mL，而colistin浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625、1.8、0.9、0.45μg/mL加入96孔板中，留一排新型LB培养基作生长对照；另将等体积OD600＝0.01的稀释菌液加入96孔板中，盖上盖子，37℃静置培养12h，用酶标仪测定菌液OD600。将OD600小于0.15的点对应的抗生素浓度定义为菌株对多粘菌素的MIC值。突变株对多粘菌素的抗性均增强。结果如表1所示。由表1可知，该基因缺失之后对阳离子抗菌肽的抗性减弱，但是pH不同，抗性的强弱也不同。pH 5.0条件下野生型的抗性最强，pH 5.0条件下BAA894ΔESA-03574抗性有所降低但比pH 7.0条件下野生型高，说明ESA-03574在低pH条件下对阳离子抗菌肽的抗性起作用。
表1 BAA894野生型及突变株对多粘菌素B和colistin的MIC值
实施例6C.sakazakii突变菌株对TLR4信号通路激活的能力
HEK-Blue hTLR4细胞因转染表达了人类TLR4及NF-kB诱导分泌的SEAP报告基因，能够特异性地识别培养体系中活细菌体表明的LPS而分泌蓝色的SEAP激酶，实时监测LPS诱导的TLR4免疫通路的强弱，通过SEAP显色的深浅指示出菌体对TLR4的刺激能力和对细胞的毒性。吸光值越大，对细胞毒性越大。
基因工程菌成功构建后，菌体表明LPS结构均发生了较大的变化，通过用活菌体直接刺激HEK-Blue hTLR4细胞，能最直观地反映出菌体及其合成的LPS的细胞毒性变化趋势。
图4为野生型BAA894(对照组)与突变株(实验组)的显色结果。如图，对照组和实验组各菌株都能有效激起TLR4信号通路；在菌浓为在活菌浓度为104～106CFU/mL范围内，各菌株的HEK-Blue的显色反应线性最明显。在菌浓为105CFU/mL时，对TLR4通路的刺激能力BAA894＞BAA894ΔESA-03574，实验组菌株的TLR4的刺激能力比其对照组的出发菌略低约10％。由此可见lipidA部分的精细结构是决定菌体对TLR4的刺激能力和对细胞的毒性的主要因素。
由对TLR4通路的激活能力，ESA-03574基因对于开发减毒的疫苗佐剂有作用。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种Cronobacter sakazakii的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌缺失了ESA-03574基因片段；所述ESA-03574基因片段的核苷酸序列是SEQ ID NO:1的序列。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为无抗性C.sakazakii BAA894ΔESA-03574，以Cronobacter sakazakii BAA894为出发菌、缺失了核苷酸序列为SEQ ID NO:1的ESA-03574基因片段。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的构建方法如下：将人工构建的ESA-03574敲除片段电转化入含pKD46质粒的C.sakazakii BAA894，获得突变株C.sakazakii BAA894ΔESA-03574-loxPkan，再化转入pKD-Cre质粒，通过位点特异性重组敲除卡那霉素抗性基因；去除pKD-Cre质粒后获得无抗性lipid A的基因结构突变的基因工程菌。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述ESA-03574敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.一种降低Cronobacter sakazakii对阳离子抗菌肽抗性的方法，其特征在于，所述方法是敲除Cronobacter sakazakii菌的ESA-03574基因片段；所述Cronobacter sakazakii菌株为BAA894；所述ESA-03574基因片段的核苷酸序列是SEQ ID NO:1的序列；且敲除了ESA-03574基因片段的Cronobacter sakazakii菌在pH5.0条件下作用。
6.一种降低Cronobacter sakazakii对HEK-Blue HEK-4细胞刺激作用的方法，其特征在于，所述方法是敲除Cronobacter sakazakii菌的ESA-03574基因片段；所述Cronobactersakazakii菌株为BAA894；所述ESA-03574基因片段的核苷酸序列是SEQ ID NO:1的序列；且敲除了ESA-03574基因片段的Cronobacter sakazakii菌的菌浓度为105～106CFU/mL。
7.权利要求1-4任一所述基因工程菌在阳离子抗性肽及在疫苗佐剂上的应用。
CN201610065729.6A 2016-01-29 2016-01-29 一株产减毒类脂A的Cronobacter sakazakii突变株及其应用 Active CN105567620B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610065729.6A CN105567620B (zh) 2016-01-29 2016-01-29 一株产减毒类脂A的Cronobacter sakazakii突变株及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610065729.6A CN105567620B (zh) 2016-01-29 2016-01-29 一株产减毒类脂A的Cronobacter sakazakii突变株及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105567620A CN105567620A (zh) 2016-05-11
CN105567620B true CN105567620B (zh) 2019-03-19

Family

ID=55878254

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610065729.6A Active CN105567620B (zh) 2016-01-29 2016-01-29 一株产减毒类脂A的Cronobacter sakazakii突变株及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105567620B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006065139A2 (en) * 2004-12-17 2006-06-22 Nvi Nederlands Vaccininstituut Deacylation of lps in gram negative bacteria
CN101245098A (zh) * 2007-07-10 2008-08-20 中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所 模拟md2的抗菌抗炎拮抗多肽
CN103713104A (zh) * 2013-12-26 2014-04-09 中华人民共和国淮安出入境检验检疫局 一种检测食品中阪崎肠杆菌的双抗体夹心法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006065139A2 (en) * 2004-12-17 2006-06-22 Nvi Nederlands Vaccininstituut Deacylation of lps in gram negative bacteria
CN101245098A (zh) * 2007-07-10 2008-08-20 中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所 模拟md2的抗菌抗炎拮抗多肽
CN103713104A (zh) * 2013-12-26 2014-04-09 中华人民共和国淮安出入境检验检疫局 一种检测食品中阪崎肠杆菌的双抗体夹心法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
病原微生物对抗菌肽抗性机制的研究进展;陈武 等;《中国生物工程杂志》;20120525;第32卷(第5期);第97-105页
陳顗峰.克雷白氏肺炎杆菌CG43对多粘菌素的抗性调控分析.《交通大学分子医学与生物工程研究所学位论文》.2014,

Also Published As

Publication number Publication date
CN105567620A (zh) 2016-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. Genome shuffling enhanced ε-poly-l-lysine production by improving glucose tolerance of Streptomyces graminearus
CN108486029B (zh) 肠炎沙门菌sufB基因缺失的应用
Tamura et al. Role of phaseolotoxin production by Pseudomonas syringae pv. actinidiae in the formation of halo lesions of kiwifruit canker disease
CN104974974B (zh) 一株刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株及其应用
CN111778216A (zh) 一种地毯草黄单胞菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用
CN102776220B (zh) 布鲁氏菌病a19分子标记疫苗株的构建及毒力和免疫原性的测定
CN105567620B (zh) 一株产减毒类脂A的Cronobacter sakazakii突变株及其应用
CN106119165A (zh) 双基因敲除的减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其制备方法
CN103820377B (zh) 一种产Kdo2-lipidA的基因工程菌及其构建方法和应用
CN102994436A (zh) 一种产减毒类脂a的大肠杆菌基因工程菌及其应用
CN106497829B (zh) 一种鲟源嗜水气单胞菌及其应用
CN106085936B (zh) 一种猪链球菌2型10基因缺失株及应用
CN104844665B (zh) 一种低毒含五条脂肪酸链的Kdo2‑单磷酸类脂A的制备与应用
CN108977457B (zh) 一种黄鳝抗菌肽的制备方法
CN106190943A (zh) 一种双基因缺失肠炎沙门氏菌、其构建方法及含有该双基因缺失肠炎沙门氏菌的疫苗
CN105483052A (zh) 鸡白痢沙门菌spiC-rfc双基因敲除减毒株及其DIVA疫苗应用
CN103343102B (zh) 猪链球菌2型htpsC基因敲除突变株及其应用
CN105647843B (zh) 一种Cronobacter sakazakii的类脂A结构突变株的构建及其应用
CN108395458A (zh) 减毒类脂a的制备与应用
CN104560854B (zh) 缺失phoP的禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株及其构建方法和应用
US20120015404A1 (en) Gene cluster for thuringiensin synthesis
CN106148387A (zh) 直接对扩展青霉休眠孢子转化外源脱氧核糖核酸的方法
CN106244616A (zh) 一种使外源dna穿透细胞屏障进入点青霉休眠孢子的方法
CN106148389A (zh) 一种直接转化外源dna进入尼琦青霉未萌发孢子的方法
CN108265020A (zh) 两株产减毒类脂A的Cronobacter突变株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant