CN104974974B

CN104974974B - 一株刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株及其应用

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Publication number: CN104974974B
Application number: CN201510444997.4A
Authority: CN
Inventors: 夏立秋; 杨燕; 丁学知; 胡胜标
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Hongjian Biotechnology Co ltd
Priority date: 2015-07-27
Filing date: 2015-07-27
Publication date: 2018-02-13
Anticipated expiration: 2035-07-27
Also published as: CN104974974A

Abstract

一株刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株及其应用，所述刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株，即刺糖多孢菌S.sp‑△pepA，Saccharopolyspora spinosa S.sp‑△pepA,于2015年6月8日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2015362。本发明之刺糖多孢菌S.sp‑△pepA中多杀菌素产量提高到原始菌株的137%。

Description

一株刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株及其应用，采用基因工程技术，阻断刺糖多孢菌中亮氨酰氨肽酶同源基因表达，获得杀菌素高产菌株S.sp-△pepA。

背景技术

多杀菌素及其衍生物同时具有高效杀的虫活性及绿色安全的优良特性，成为近几年生物杀虫制剂研究领域的一大热点，而野生菌株极低的发酵产量是阻碍多杀菌素进一步研究的难题。多杀菌素通过与烟碱乙酰胆碱受体结合使昆虫神经细胞去极化，引起中央神经系统超活化，从而导致非功能性肌收缩、衰竭和麻痹，因此它对昆虫有快速触杀和摄食毒性。多杀菌素杀虫谱十分广泛，包括鳞翅目（Lepidoptera）、缨翅目（Thysanoptera）、鞘翅目（Coleoptera）、膜翅目（Hymenoptera）、双翅目（Diptera）等害虫，尤其对鳞翅目、缨翅目害虫有极强的选择性杀虫活性。多杀菌素具有诸多衍生物，到目前为止，由刺糖多孢菌所产生的多杀菌素共分离得到30多种，其中包括9种缺少福乐糖基的拟糖苷配基（Pseudoaglycone，PSA），多杀菌素拟糖苷配基也可用作进一步化学修饰的底物，并产生新的带有独特性质和活性谱的半合成多杀菌素。

目前国际上关于多杀菌素合成机制的研究仍处在起步阶段，野生型刺糖多孢菌菌株中多杀菌素产量极低，因此如何提高其发酵产量是亟待解决的一大难题。多杀菌素的合成量极低，采用各种途径如培养基优化、理化诱变和分子遗传改造等方法对其进行菌种改良是非常有必要的。利用基因工程技术对刺糖多孢菌基因组进行定向遗传修饰，有望成为提高多杀菌素产量有效方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，利用基因工程技术，提供一株刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株及其应用，通过定向遗传修饰刺糖多孢菌，获得多杀菌素高产菌株。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，

本发明之刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株，即刺糖多孢菌S.sp-△pepA，Saccharopolyspora spinosa S.sp-△pepA,于2015年 6月8日在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学）保藏，菌种保藏号为 CCTCC NO：M 2015362。

本发明之多杀菌素高产工程菌株的获得步骤如下：

（1）通过NCBI的在线Blast工具（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行搜索和比对亮氨酰氨肽酶基因（pepA），利用Cluster X软件对同源蛋白序列进行比对分析；

（2）PCR扩增含HindIII/ EcoR V酶切位点的1420 bp的pepA同源基因中间片段；

（3）利用HindIII/ EcoR V双酶切原始质粒pOJ260和同源基因片段后，通过连接酶作用获得敲除载体pOJ260-pepA；

（4）通过电转化方法将敲除载体pOJ260-pepA导入供体菌E. coli S17后与野生型刺糖多孢菌进行接合转移，构建工程菌株刺糖多孢菌S. sp-△pepA；

（5）设计引物鉴定pOJ260-pepA整合位点；

（6）HPLC分析工程菌多杀菌素的生物合成能力；

（7）比较蛋白质组学分析亮氨酰氨肽酶同源基因阻断对刺糖多孢菌蛋白表达水平的影响。

研究表明，亮氨酰氨肽酶(pepA; EC 3.4.11.1)是氨肽酶M17超家族中的一员，该家族成员均具有从蛋白质、多肽的N端将亮氨酸残基切割下来的作用。该家族胺肽酶在生物界普遍存在，其功能结构的研究仅在牛、大肠杆菌、土豆中开展过。

研究证明，大肠杆菌的pepA具有DNA结合活性，能与多种启动子序列结合，对pepA蛋白六聚体X射线三维结构分析发现其具有一个凹槽结构，该结构被认为是DNA结合位点。Song等在天蓝色链霉菌中将亮氨酰氨肽酶基因（pepA）敲除发现缺失突变株产孢子能力和抗生素合成能力明显提高，双向电泳和RT-PCR检测发现ftsZ、ssgA、和actII-ORF4的蛋白表达和转录水平也有较大幅度提高,这表明天蓝色链霉菌中的pepA在抗生素合成过程中作为负调控因子发挥作用。

本发明利用NCBI数据库和Cluster X软件从刺糖多孢菌基因簇中找到亮氨酰氨肽酶同源基因，PCR扩增该同源基因的中间片段，利用限制性酶切、连接的方法，将PCR产物克隆到大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pOJ260上，采用属间接合转移方法将功能载体pOJ260-pepA导入刺糖多孢菌中，获得亮氨酰氨肽酶基因被阻断的工程菌株S. sp-△pepA。PCR鉴定结果表明，该质粒已成功地整合至刺糖多孢菌基因组上，并设计引物对该功能载体在刺糖多孢菌基因组上的整合位点进行了鉴定。HPLC检测结果表明，工程菌S. sp-△pepA中多杀菌素产量提高到原始菌株的137%。光学显微镜观察表明，pepA基因阻断后刺糖多孢菌菌丝形态发生明显变化，其菌丝变短，分支增多且片段化程度提高；利用SDS-PAGE方法对工程菌株S.sp-△pepA和原始菌株S. spinosa的全蛋白进行比较分析，发现亮氨酰氨肽酶基因阻断后，工程菌株全蛋白条带减少尤其是66.4—97.2 kDa区域，且分子量超过100 kDa的蛋白表达均被抑制，但某些条带蛋白表达水平显著提高。1D-LC-MS/MS鉴定差异蛋白条带，结果表明pepA基因阻断后菌株的能量代谢和蛋白组装过程发生改变。

微生物保藏情况说明

附图说明

图1为基因编码蛋白同源性比对图；

图2-A和图2-B为功能载体pOJ260-pepA的构建图；A，同源基因片段的PCR扩增；B，功能载体pOJ260-pepA的酶切鉴定；

图3为接合子的PCR鉴定图；M，DNA Marker; 泳道1，阴性对照；泳道2，阳性对照；泳道3、4, 接合子基因组S. sp-△pepA为模板；

图4-A和图4-B为载体pOJ260-pepA整合位点的鉴定图；4－A，载体整合方式示意图；4－B，整合位点鉴定图；

图5为本发明工程菌刺糖多孢菌S. sp-△pepA与原始菌刺糖多孢菌S.spinosa（48h）菌丝形态观察图；

图6-A和图6-B为原始菌株刺糖多孢菌S. spinosa（6－A）与工程菌株刺糖多孢菌S. sp-△pepA（6－B）的HPLC分析图；

图7为SDS-PAGE分析原始菌与工程菌（72 h）全蛋白图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式结合附图进行详细说明。

本实施例之刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株，即刺糖多孢菌S.sp-△pepA，Saccharopolyspora spinosa S.sp-△pepA,于2015年 6月8日在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学）保藏，菌种保藏号为 CCTCC NO：M 2015362。

①具体培养基配方和培养条件

（1）S. spinosa种子活化采用SP-2培养基：葡萄糖9 g/L，胰蛋白胨大豆肉汤 30g/L，酵母提取物3 g/L，硫酸镁2 g/L。接种单克隆或1%菌种保藏液加入装有20 mL SP-2的250 mL摇瓶中，30℃，300 r/min培养48-72 h；

（2）转接采用胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基：胰蛋白胨大豆肉汤30 g/L；接种1%菌液加入装有20 mL SP-2的250 mL摇瓶中，30℃，300 r/min培养48-72 h；

（3）发酵培养采用SP-3培养基：葡萄糖60 g/L，可溶性淀粉10 g/L，玉米浆7 g/L，棉籽粉22.5 g/L，豆饼粉5 g/L，酵母提取物2 g/L，碳酸钙5 g/L，油酸甲酯42 mL/L，微量元素2.5 mL/L（氯化钴0.3 g/L，硫酸锌1.4 g/L，硫酸亚铁3.8 g/L，硫酸镍0.5 g/L，溶于0.5mol/L的盐酸中），pH 7.0；接种10%菌种保藏液加入装有20 mL SP-3的300 mL摇瓶中，30℃，300 r/min培养10-12 d；

（4）接合转移采用R6固体培养基：培养基（g/L）：蔗糖 200，糊精10，酪蛋白氨基酸1，，K₂SO₄0.1，FeSO₄·7H₂O 0.1，MnCl₂·4H₂O 0.001，ZnSO₄·7H₂O 0.001，BHI 13，Agar 12，加入678 mL蒸馏水，定容至1 L，115 ℃灭菌30 min；待培养基冷却至50 ℃加入以下三种经0.22 μm（微米）滤膜过滤除菌的物质，1 mol/L L-谷氨酸 65 mL, 1 mol/L CaCl₂·2H₂O 48mL及1 mol/L 丙磺酸5 mL；固体平板转接采用脑心浸膏（BHI）固体培养基。

②亮氨酰氨肽酶同源基因的确定及PCR扩增

以GenBank上公布的序列天蓝色链霉菌亮氨酰氨肽酶基因（pepA，sco2179）核苷酸序列为标准，利用Blast在线搜索刺糖多孢菌中该基因同源片段，而后利用Clustal X比对2个基因编码蛋白pepA的相似性，两者同源性高达50%（图1）。以刺糖多孢菌基因组作为模板，设计三对引物 pepA-F/pepA-R扩增pepA基因中间片段，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物（1200 bp）与预期大小一致（图2A）。将这段基因分别连接至pMD18-T载体上，挑取转化子进行质粒提取与酶切鉴定，将酶切结果正确的转化子送测序，测序结果与pepA同源基因序列一致。

③属间接合转移

首先将已构建好的质粒pOJ260-pepA电转至E.coliS17，经三甲氧苄二氨嘧啶、链霉素和阿伯拉霉素r三抗筛选阳性转化子，提取质粒酶切鉴定获得转化子E.coliS17（pOJ260-pepA）并进行菌种保藏。大肠杆菌-刺糖多孢菌属间接合转移方法如下：

（1）受体菌活化：将-80℃保藏的刺糖多孢菌400 μL接种至20 mL种子（CSM）培养基中，30℃ 220 r/min振荡培养48 h；

（2）受体菌第一次转接：按1：10的比例进行转接〔即2 mL培养了48 h菌液转接于18mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基中〕，相同条件下培养过夜；

（3）供体菌接种：挑取S17（pOJ260-pepA）的分别接种于10 mL添加了链霉素、甲氧苄氨嘧啶和阿伯拉霉素的TY液体培养基中，37 ℃培养过夜；

（4）受体菌第二次转接：按1：4的比例转接，即5 mL过夜培养的受体菌转接至15 mLTSB液体培养基中，同样条件下培养4-6 h；

（5）受体菌收集：将菌液分装至2 mL EP管中，5000 r/min离心10 min收集菌丝体，悬浮于450 μL TSB中；

（6）供体菌收集：2 mL EP管收集菌体，每个EP管加入1 mL 胰蛋白胨大豆肉汤培养基培养基，吹打混匀，5000 r/min离心5 min，重复洗一次，5000 r/min离心5 min后悬浮于1.8 mL 胰蛋白胨大豆肉汤培养基中；

（7）接合转移：供体菌与受体菌以3：1的比例混合，即取300 μL大肠杆菌悬液与100μL受体菌悬液充分混匀后，涂布于无抗生素的R6固体培养基上，30℃倒置培养16-20 h；

（8）抗生素覆盖：将抑制细菌生长的萘啶酮酸和筛选转化子的阿伯拉霉素加至1mL 胰蛋白胨大豆肉汤培养基液体培养基中，混匀后覆盖于R6平板，超净工作台中吹干，30℃恒温培养箱中倒置培养7-14 d。

④工程菌株S. sp-△pepA的构建及其PCR鉴定

以Apr-F/Apr-R为引物，将筛选得到的具有阿伯拉抗性的接合子基因组作为模板进行PCR扩增，同时以原始菌株基因组为模板作为阴性对照，琼脂糖凝胶电泳结果显示（图2A），所鉴定三个接合子均为阳性，说明功能质粒pOJ260-pepA已成功导入S. spinosa菌株中。

为了进一步确定重组载体pOJ260-pepA是否以单交换同源重组的方式整合至染色体上，设计了2对引物，对获得的阳性接合子进行PCR扩增，以鉴定同源重组整合位点。PCR鉴定结果表明（图2B），功能质粒插入到刺糖多孢菌染色体上的位置与预想一致。

⑤pepA基因阻断表达对刺糖多孢菌菌丝形态的影响

菌体活化：将200 μL菌种保藏液接种于装量为20 mL 液体种子培养基的250 mL摇瓶中，30℃、160 r/min培养2 d。接种等量的活化后的原始菌与工程菌菌液至20 mL 胰蛋白胨大豆肉汤培养基，165 r/min振荡培养2 d，利用光学显微镜（Olympus BH-2型显微镜，日本Olympus公司）观察其菌丝形态。结果显示原始菌株菌丝细长且分枝少，而工程菌株S.sp-△pepA菌丝较粗短、分枝少且片段化程度高，此外，原始菌结团较工程菌严重（图 3）。

⑥工程菌株多杀菌素的HPLC分析

将原始菌株和工程菌株保藏液500 μl分别接种至20mL液体种子培养基，30℃，280r/min培养48 h，按10 %接种量转接至50 mL发酵培养基中，30℃ 280r/min培养培养过程中每3天补一次水；10天后取600 μl发酵液，加入600 μl丙酮，4℃冰箱放置24 h后13000r/min离心10min，取上清，经0.22 μm滤膜过滤，滤液用安捷伦 1290反相高效液相色谱（HPLC）检测分析多杀菌素含量。ZORBOX SB-C18柱，4.6×150 mm，5-µm；流动相：甲醇/乙腈/2%醋酸铵溶液（体积比9/9/1）；上样体积：5 μL；柱温：室温；流速：1.0 mL/min；检测波长：250 nm；经系统自带的分析软件分析得到多杀菌素A、D响应峰面积，通过公式计算得到发酵液中多杀菌素的含量。

分析发现，本发明之工程菌株刺糖多孢菌S. sp-△pepA保留时间在6.6 min和8.7min左右的多杀菌素色谱峰相对产量提高最明显，经过多次发酵及色谱分析(图4)，其稳定性良好，原始菌株多杀菌素A+D平均峰面积为213.9 mAU*s，工程菌株S. sp-RM平均峰面积为294 mAU*s，工程菌株刺糖多孢菌S. sp-△pepA所产多杀菌素相比原始菌株，提高到原来的137.44%。

⑦SDS-PAGE分析菌体全蛋白及1D-LC-MS/MS鉴定差异蛋白

为了分析亮氨酰氨肽酶基因阻断对刺糖多孢菌全蛋白质组的影响，采用SDS-PAGE方法对工程菌刺糖多孢菌S. sp-△pepA和原始菌刺糖多孢菌S. Spinosa 菌体全蛋白进行检测，通过1D-LC-MS/MS鉴定检测到的差异蛋白。

首先，将等量活化好的原始菌株与工程菌株转接至合成发酵培养基中，30℃，280r/min培养60 h、72 h；利用超声破碎法分别提取原始菌株S. spinosa和工程菌株S.sp-△pepA的菌体总蛋白，Bradford法对所提蛋白定量后进行SDS-PAGE（12%）电泳分析。结果发现工程菌株全蛋白条带减少(图5)，尤其是分子量超过100 kDa的蛋白；另外，工程菌株中出现了表达明显增强的蛋白条带B、C(图5)。差异蛋白条带1D-LC-MS/MS鉴定为核糖体蛋白亚基和醛基脱氢酶（参见表2），核糖体蛋白亚基通过影响蛋白质代谢对菌体生长产生影响；醛基脱氢酶则可与乙醇脱氢酶、乙酰辅酶A合成酶相互作用影响辅酶A合成，而辅酶A合成多杀菌素的重要底物。

表2差异蛋白1D-LC-MS/MS鉴定

Claims

1.一株刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株，其特征在于，所述刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株，即刺糖多孢菌S.sp-△pepA，Saccharopolyspora spinosa S.sp-△pepA,于2015年 6月8日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为 CCTCC NO：M 2015362。

2.根据权利要求1所述的刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株，其特征在于，刺糖多孢菌染色体上整合功能质粒pOJ260-pepA导致其亮氨酰氨肽酶基因被阻断。

3.如权利要求1或2所述的刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株在生物合成多杀菌素中的应用。