CN108384779A - 微生物及其用途 - Google Patents

Abstract

真菌在生物技术中有广泛的应用。CRISPR/Cas9系统是一个强大的基因组编辑方法，已成功运用于多种基因组中，但在真菌中的应用还不广泛，本发明提供一种便捷、有效、适用性广泛的在真菌中利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的方法。

Description

微生物及其用途

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体的，本发明涉及微生物基因编辑方法及其用途。

背景技术

真菌在生物技术中有广泛的应用。CRISPR/Cas9系统是一个强大的基因组编辑方法，已成功运用于多种基因组中，但在真菌中的应用还不广泛，究其原因包括很多，在某些真菌中由于不能建立有效的遗传操作载体，Cas9蛋白不能正确表达，sgRNA没有正确转录等原因。因此，在真菌中应用该技术急需一种便捷、有效、适用性广泛的方法。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

CRISPR/Cas9系统是一个强大的基因组编辑方法，已成功运用于多种基因组中，但在真菌中的应用还不广泛，究其原因包括很多，在某些真菌中由于不能建立有效的遗传操作载体，Cas9蛋白不能正确表达，sgRNA没有正确转录等原因。

为此，本发明的目的在于提出了一种便捷、有效、适用性广泛的在真菌中的CRISPR/Cas9基因编辑方法，该方法通过转化体外纯化的CPP-Cas9蛋白和sgRNA进入宿主细胞体内实现基因编辑。

根据本发明的实施例，上述微生物还可以进一步包括如下附加技术特征之一：

所用基因敲除方法为的CRISPR/Cas9方法；

所述的CRISPR/Cas9方法通过转化体外纯化的CPP-Cas9蛋白和sgRNA进入宿主细胞体内实现。

所述的sgRNA是通过体外转录得到的。

所述的CPP-Cas9蛋白含有核定位序列，细胞穿透肽和Cas9切割活性蛋白。

所述的核定位序列和细胞穿透肽序列可以通过直接在微生物体内与Cas9切割活性蛋白共表达的方式连接在一起，也可以通过在体外通过化学相互作用连接在一起。

根据本发明的实施例，利用根据本发明实施例的方法能够高效实现基因敲除、基因灭活、基因敲入和基因替换。

附图说明

图1是纯化过程的Cas9蛋白SDS-PAGE图；

图2是纯化后的Cas9蛋白SDS-PAGE图；

图3是敲除桔霉素基因的敲除框；

图4是红曲霉原始菌株和突变株检测的LC-MS结果；以及

图5是桔霉素标准品和红曲霉原始菌株二级质谱结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

基因编辑方法

在本发明中，本发明提出了一种基因编辑方法。

根据本发明的具体实施例，所述微生物所用基因编辑方法为CRISPR/Cas9方法，所述的CRISPR/Cas9方法通过转化体外纯化的CPP-Cas9蛋白和sgRNA进入宿主细胞体内实现。所述的CPP-Cas9蛋白含有核定位序列，细胞穿透肽和Cas9切割活性蛋白。所述的核定位序列和细胞穿透肽序列可以通过直接在微生物体内与Cas9切割活性蛋白共表达的方式连接在一起，也可以通过在体外通过化学相互作用连接在一起。所述的sgRNA是通过体外转录得到的。

根据本发明的实施例，利用根据本发明实施例的方法能够高效实现基因敲除、基因灭活、基因敲入和基因替换。

需要说明的是，发明人通过实验，发现：通过转化体外纯化的CPP-Cas9蛋白和体外转录sgRNA进入宿主细胞体内实现基因编辑能够避免在某些真菌里不能体内建立有效的遗传操作载体、不能直接表达正确的Cas9蛋白及不能正确转录sgRNA等问题，使得更加容易实现真菌的基因编辑。

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1.构建纯化Cas9蛋白的克隆

利用引物1：ATATCATATGCCCAAGAAGAAGCGCAAGGTC和引物2：AATTGGATCCTTAGCACTTCTTCTTCTTGGCCTGACCAGCCTTCTTGGTAGCAGCAGGACGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA扩增Cas9蛋白并在其末端加入核定位序列(NLS)及半胱氨酸。其中NLS序列便于Cas9蛋白进入细胞核，半胱氨酸便于Cas9蛋白与细胞穿透肽(CPP)接合。用上述引物扩增出的Cas9蛋白的片段通过NdeI、BamHI酶切后克隆与用同样酶切后的pET28质粒上，这样可以得到NLS与Cas9活性切割蛋白连接表达的Cas9蛋白。其中所包含的Cas9蛋白核苷酸如下所示：

ATGCCCAAGAAGAAGCGCAAGGTCGGTATCCACGGCGTTCCTGCCGCTGACAAGAAGTACTCCATCGGTCTCGACATCGGCACCAACTCCGTCGGTTGGGCTGTTATCACCGACGAGTACAAGGTCCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTTCTCGGCAACACCGACCGCCACTCCATCAAGAAGAACCTCATCGGTGCCCTCCTGTTCGACTCTGGCGAGACCGCTGAGGCTACCCGTCTCAAGCGTACCGCTCGCCGTCGCTACACCCGTCGCAAGAACCGCATCTGCTACCTCCAGGAGATTTTCTCCAACGAGATGGCCAAGGTCGATGATTCTTTCTTCCACCGCCTGGAGGAGAGCTTCCTGGTTGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGCCACCCCATCTTCGGTAACATCGTCGATGAGGTTGCCTACCACGAGAAGTACCCTACCATCTACCACCTCCGCAAGAAGCTCGTCGATTCCACCGATAAGGCTGACCTGCGTCTTATCTACCTCGCCCTGGCTCACATGATTAAGTTCCGCGGTCACTTCCTTATCGAGGGCGACCTCAACCCCGACAACTCTGACGTTGACAAGCTCTTCATCCAGCTCGTTCAGACCTACAACCAGCTTTTCGAGGAGAACCCTATCAACGCCTCTGGTGTCGATGCCAAGGCTATCCTGAGCGCTCGTCTTAGCAAGTCCCGCCGCCTGGAGAACCTCATCGCCCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAGAACGGTCTCTTCGGCAACCTCATCGCCCTTTCCCTCGGCCTGACCCCTAACTTCAAGTCTAACTTCGACCTCGCCGAGGACGCTAAGCTCCAGCTCTCCAAGGACACCTACGACGATGACCTCGATAACCTTCTCGCCCAGATTGGCGACCAGTACGCTGACCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACCTTTCTGACGCCATCCTGCTTAGCGACATCCTCCGCGTCAACACCGAGATTACCAAGGCCCCCCTCTCTGCCTCCATGATTAAGCGTTACGACGAGCACCACCAGGACCTCACCCTCCTGAAGGCTCTGGTCCGCCAGCAGCTTCCTGAGAAGTACAAGGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGTTACGCCGGCTACATCGACGGTGGCGCTTCCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTTCTCGTCAAGCTCAACCGCGAGGACCTGCTTCGCAAGCAGCGTACCTTCGATAACGGTTCCATCCCCCACCAGATTCACCTTGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGTCGCCAGGAGGACTTCTACCCTTTCCTTAAGGATAACCGCGAGAAGATTGAGAAGATTCTCACCTTCCGTATCCCCTACTACGTCGGTCCTCTCGCCCGCGGCAACAGCCGTTTCGCTTGGATGACCCGCAAGTCCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTCGTTGACAAGGGCGCCTCCGCTCAGTCTTTCATCGAGCGCATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTCCTTCCTAAGCACAGCCTCCTGTACGAGTACTTCACCGTTTACAACGAGCTGACCAAGGTCAAGTACGTTACCGAGGGTATGCGTAAGCCTGCCTTCCTCTCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTTGACCTCCTCTTCAAGACCAACCGCAAGGTCACTGTTAAGCAGCTCAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATTGAGTGCTTCGATTCCGTCGAGATTTCCGGTGTTGAGGACCGCTTCAACGCCTCCCTCGGCACCTACCACGACCTCCTTAAGATTATCAAGGATAAGGACTTCCTCGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTCCTCACCCTGACCCTTTTCGAGGACCGCGAGATGATTGAGGAGCGTCTCAAGACCTACGCCCACCTGTTCGATGACAAGGTCATGAAGCAGCTCAAGCGTCGCCGTTACACCGGTTGGGGCCGCCTTTCCCGTAAGCTCATCAACGGTATCCGTGACAAGCAGTCTGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTTAAGAGCGATGGTTTCGCTAACCGCAACTTCATGCAGCTTATCCACGATGACTCTCTCACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTCTCTGGTCAGGGCGACAGCCTCCACGAGCACATCGCCAACCTGGCTGGTAGCCCCGCTATCAAGAAGGGCATCCTTCAGACCGTCAAGGTCGTTGACGAGCTGGTCAAGGTTATGGGTCGCCACAAGCCTGAGAACATCGTCATCGAGATGGCCCGTGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGCGAGCGTATGAAGCGCATCGAGGAGGGTATCAAGGAGCTGGGCTCTCAGATTCTCAAGGAGCACCCCGTCGAGAACACCCAGCTCCAGAACGAGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCAGAACGGTCGCGATATGTACGTTGACCAGGAGCTTGACATCAACCGTCTCAGCGATTACGACGTTGACCACATCGTTCCCCAGTCCTTCCTTAAGGATGACTCTATCGACAACAAGGTCCTCACCCGCTCCGACAAGAACCGTGGCAAGTCCGATAACGTTCCTTCTGAGGAGGTCGTTAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGCCAGCTCCTGAACGCCAAGCTCATCACCCAGCGCAAGTTCGACAACCTTACCAAGGCCGAGCGTGGTGGCCTCTCTGAGCTGGACAAGGCTGGTTTCATCAAGCGCCAGCTCGTCGAGACCCGTCAGATTACCAAGCACGTTGCTCAGATTCTCGACTCCCGCATGAACACCAAGTACGATGAGAACGACAAGCTCATCCGCGAGGTCAAGGTTATCACCCTGAAGAGCAAGCTCGTCTCCGACTTCCGCAAGGATTTCCAGTTCTACAAGGTTCGTGAGATTAACAACTACCACCACGCCCACGACGCTTACCTCAACGCCGTCGTTGGCACCGCTCTTATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGTCCGAGTTCGTCTACGGCGACTACAAGGTCTACGATGTTCGCAAGATGATTGCCAAGTCTGAGCAGGAGATTGGTAAGGCCACCGCTAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATTACCCTCGCCAACGGCGAGATTCGCAAGCGTCCTCTCATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATTGTCTGGGACAAGGGCCGCGATTTCGCTACCGTCCGTAAGGTTCTCTCCATGCCCCAGGTCAACATCGTTAAGAAGACCGAGGTCCAGACCGGTGGCTTCAGCAAGGAGTCCATCCTGCCTAAGCGCAACTCTGACAAGCTCATCGCCCGTAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGTGGCTTCGACAGCCCTACCGTCGCCTACTCCGTTCTCGTCGTTGCTAAGGTCGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTCAAGTCCGTTAAGGAGCTTCTCGGCATCACCATCATGGAGCGCTCCTCTTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCTAAGGGTTACAAGGAGGTCAAGAAGGACCTCATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCTCTTTTCGAGCTGGAGAACGGTCGTAAGCGTATGCTGGCCAGCGCTGGCGAGCTTCAGAAGGGCAACGAGCTTGCCCTCCCCTCCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTTGCTTCCCACTACGAGAAGCTCAAGGGTTCTCCTGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTCTTCGTCGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATTATCGAGCAGATTTCCGAGTTCAGCAAGCGCGTCATCCTCGCCGACGCTAACCTTGATAAGGTTCTCTCCGCCTACAACAAGCACCGCGACAAGCCCATCCGTGAGCAGGCTGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTTACCAACCTCGGCGCCCCTGCTGCTTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGCAAGCGTTACACCTCCACCAAGGAGGTCCTGGACGCTACCCTTATCCACCAGTCCATCACCGGTCTCTACGAGACCCGCATCGACCTGTCTCAGCTTGGTGGCGATAAGCGTCCTGCTGCTACCAAGAAGGCTGGTCAGGCCAAGAAGAAGAAGTGCTAA(SEQ ID NO:1)

实施例2：纯化Cas9蛋白

将pET28-Cas9转化到BL21中，从平板上各划取大约50-60个单克隆分别接种到10mL带卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃摇床培养2-3h。按1％的接种到500mL带卡那霉素抗性的LB培养基中，放入37℃摇床220rpm培养至OD值在0.6-0.8之间(大约2h)。加入终浓度为0.5mM的IPTG后温度变为30℃,220rpm摇床培养18h左右。

将养好的菌液放入收集瓶中，3500转离心15min，去上清，重复多次，直到菌体收集完，再用无菌水将菌体重悬清洗一次，3500rpm离心15min，去上清，将细胞匀浆后收集上清，用0.45μm滤膜进行过滤。用标准HIS标签蛋白纯化方法过镍柱纯化蛋白，取不同浓度下的洗脱液10μL进行SDS-PAGE检测。结果如图1所示，30％和60％的洗脱液里含有较纯的Cas9蛋白。

对于含目标蛋白的收集组分，4℃，4,000g条件下用50kDa蛋白离心浓缩柱(millipore)离心浓缩后换为磷酸缓冲液得到纯化的蛋白，分装保存于-80℃。取适量纯化的蛋白测蛋白浓度并进行SDS-PAGE检测。并用BCA方法测定蛋白浓度。

实施例3将Cas9与细胞穿透肽相连形成CPP-Cas9蛋白

将纯化后的1mg的Cas9蛋白与50mg的细胞穿透肽

(4-maleimidobutyryl-GGGRRRRRRRRRLLLL，中肽)室温混合，颠倒混匀2小时后，用50kDa蛋白离心浓缩柱(millipore)离心浓缩去除未结合的多肽后，收集链接后的CPP-Cas9蛋白，测蛋白浓度。

实施例4反转录得到sgRNA

设计敲除红曲霉尿嘧啶合成基因pyrG的sgRNA的引物，其正向引物为GATCACTAATACGACTCACTATAGCAGTTACATCCTCAAATCCGTTTTAGAGCTAGAAA,反向引物为AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC以及敲除红曲霉桔霉素基因的sgRNA引物，其正向引物为：GATCACTAATACGACTCACTATAGCACTCAAATCTGAGATCAAAGGGTTTTAGAGCTAGAAA，反向引物为AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC。利用上述设计的扩增引物，扩增得到所需DNA模板。体系如表1，扩增程序为：98℃预变性15s，98℃变性10s，58℃退火10s，72度延伸10s，10个循环，72度延伸2min，12度保持。

表1扩增得到DNA模板的PCR体系

利用转录试剂盒转录sgRNA,转录体系如表2所示，37℃温育约2h，体系呈乳白色；加入2μL DNA酶，37℃温育10min；加入2μL EDTA，65℃温育15min，后加入3μL NaAc,加入500μL的酸性酚：氯仿：异戊醇(25:24:1，PH<5.0)，混合，12000g离心3min，尽量吸净上层液；加入等体积氯仿，重复上述操作。加入2.5倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，低温放置约30min，12000g离心5min；加入1ml 75％乙醇，颠倒混匀，12000g离心3min，重复两次；加入50μLddH₂O，静置片刻，置于95℃干浴锅10min，冷却至室温，测浓度，得到sgRNA。其中用于敲除pyrG基因sgRNA命名为sgRNA1，用于敲除桔霉素基因的sgRNA命名为sgRNA2。

表2转录体系

实施例5敲除红曲霉中的pyrG基因

将红曲霉在PDA平板上30℃培养箱中培养5天，取其菌丝体于100mL的PDA液体培养基中，30℃，220rpm培养1天。用无菌的50mL离心管中收集菌丝体，8000rpm离心8min，用0.9％NaCl洗两遍，每次20mL，8000rpm离心8min，去上清。加入30mL Osmotic Medium，含90mg Lysing Enzymes和60mg Yatalase，30℃，80rpm培养3-4hrs，期间不时地检查原生质体是否已形成。待原生质体形成后，用双层的500目尼龙布过滤收集原生质体，轻轻加入等体积的Trapping buffer，在4000rpm和4℃的条件下离心10min。缓慢升速，缓慢降速。加入2倍体积的STC buffer，离心，4℃，4,000rpm离心5-8min。用血球计数板计数，加入适量的STCbuffer，使其浓度达到108-109。将原生质体分装至无菌的预冷50mL离心管中，每管200μL。

向200μL原生质体中加入2mM的CPP-Cas9蛋白和50mg的sgRNA1，轻轻混匀，放在冰上孵育1hrs。加入1.25mL的PEG6000溶液，轻轻旋转混匀，室温孵育30min。加入4mL的STCbuffer，轻轻混匀。取0.5mL涂板至不加抗性的含1.2mol/L山梨醇的GYM培养基上，正面向上，放置30℃生化培养箱中，待固体培养基表面的液体挥发完后倒放。第二天，待原生质体长出细胞壁，在红曲霉的表层覆盖含有0.5g/L的5FOA和2g/L的尿嘧啶的基础培养基。三天后观察生长状态，将长出的转化子分别挑取在全营养性的培养基和尿嘧啶缺陷型的培养基中，选出在尿嘧啶缺陷型培养基中不能生长而在全营养培养基中能够正常生长的转化子，将其基因组提取用PCR扩增pyrG片段送测序验证其pyrG基因被破坏。

实施例6扩增桔霉素基因的替换片段

通过PCR扩增，扩增出桔霉素合成相关基因的上游同源序列及下游同源序列，同时扩增出pyrG表达框，将其插入上下游序列间形成敲除框，如图3所示。敲除框的核苷酸序列如下：

CACCCGCCAGTTTTCCTCCAAGCGCATCTGCTATATTGATTTGAAGACTCCATTTCTAACCATAACAATATTTATATGCAAAAACTTAATTCGCAGCACAATCAGGGCCTTGACTCCTTCTATGCCCAAGAATATTACAGTCACTGCAGCGAAATCTGCGTCGTACAAGTGATTGAGAGGCACGAAGCCCAGCCCGGACTGGAGTAGCAATAACAGGCTGAGATGCTTCAACTTGACTCTCTATAAGTGCCTGAGCTTCTTCCCTGGTAAGGCTTGGCCCATGAGAATAACGAGATATCTGGGATCTAGATCGTTGACTATTTACACTGATGCTGACTAATATGGGCTATCCTAAATAGGAAGGAGATAAACAGTGAGAGCCACCAACATCTATAGATCTGTCATGGGTTCAGCGCCGATCACATGCTTCTTACCAACTTCCCTTTTTTCTTCAGCCAGTGCTTTTGTACTTTCTCTTCTCCAGCGATTCCTTCGTATACATAAGTGCCACCCAATTGAACAAAGTTGCGTCCAACCTCTTACATGATCCAGTATCCACTTGGCAAGTGATTCCTCTTCAAATTCTGAAAGTTTGAGTCCATTTGCAAAAGGAATTTTGCAGTTGCAGCATGATTGATATGGGGATTTTCCCATTTTTTAAATCAGAAATGGCTAATAAGACTCGACCCTCGTGCTCAGCGAGATTATTTAAAGGTCCATCGCGAATTGGTGGCATTATGGCGCGTCGAATTGTATGGAATCAATATAGTGGACGTTTTTTCCGAGTATGGTATATCCGGCGACCACTATGCACCATGAATAGATGCAACCTTACACCCTTGTCAGATGCAAGATTACTCTATATAAGCTGGCATGCCGATGTGATTCGCAACCACTCATTTGAACTTGGCTAAAGATCGGCAAACAGTATTCTTGAAGAAAGGACGTGCGCCGACACGCATTCTGGTCCAAGCTCGTACAGCAGGGTTGGGGACCGTCCGTACTTCTACACGCTAGCCTACATCTCATCAACGCCTGTTGTTGGAGGCAGAAGCTAGGCGCTGAGGTGCAAGCTTTCGGGATTATTTATCGGAGTAACTTCATCCTTGCGAAGTAAATCCTTCAGGATCTGTACTTCCGCAGCCCATATCATCTATGAAGCCCGTATAGCGGAAGCACAAGCGAGCGGGACGGCTGGCGAATACCAACATCTGAGAATATCCGACACAAGCAAGAAGAGTGGGGAGGGGCGCGAGGTAACTGTCCGGAATAATGTTCTGCTGTGGATTTTCAGTTCAGCCTCACAGGCAGGTGCAGTGGGCACTCCATCAGACTCATATATAGTTGCTACTATCCACGAGATCAGCAAACGGTCTCGCATGGCAGTATATACCGTGTTTGTGTGATATACCTACCAGTACCCTATCATTTTCAATACGATTTCCCATCGGTCAGCTTCAACGTGACCAAGGACGGCAGTTTCAATTGCGGCTATAAGTTTTTGGATGGGATCGATCGAAGGATCCTGGGGTTCAGGGGCCGATTGTTGGCGGTCCTGGTGTTCAGAGTCGCTTAGAAGCGCTCGATTTCTGGTTTGACCAATGAGAGGTCACAATTTAGCCTATCTGAAAGGCTTTTTTTTTAAGCTCAATATCGTAGAGCTAAAACGGGCTCATAACCTAATGGATAGGCGCATGTATGGTCGTATTACTAGGTAGGCCTGCCTGTGCCGTGAGATAGGTAGCGAGGGCGGTCTAGGACGGCAGAACCTCACGTGTACTAACAGTCTGAGAGCGGGGCACGTGTTTAAACAGCACAGACGGCCTCAATTCCCACCTGGAGAGAGCTGGAGCATCAAGGGTGTAGTGCTGGCGCTTGTAATGAGTTTCTTATCCTCTTGAGATGGAGCAGACACAAGAAACGGCCAGAAAATAACTGCGAGTACAAGAGAACCTTTGCTGACGGTGATGCCGTTGGCATTTCTTCCTCCGCCTTTTGCCCCTCCGATTTGCCTTTCGGAGAGGGGCGCTTCGAGAAAAATTCTTTATCATTGCCAGCGTCACTTCCAGAATACATTCATTTTATCAGTTTTCGCATTGATACACGAAGAACCATTGAGAATATAAAGAGATAAAAGGAGATTCATAAATAACGATCAAAATGTCACCCATCGCCGATCAAGACTACAAAGCAGCCCTGCTCCCACTGCTGATCTCGAACAAAGTCCTCTCATTCGGCAGTTACATCCTCAAATCCGGGCGCGAATCGCCGTACTTCTTCACCTCCTCCCTGCTTCACTCCGCTCCTACGCTGCGCGCCACGGCAGCCGCATACGCCAGTGTCCTGTCCGCGCCGCCGTTCGTCACGACCGCAGCGGACGGAACAACGACGCCGAGCTTCGACATCATCTTCGGCCCGGCATACAAGGGTATCCCGCTGTGCGCAGCAGTGACGACCGAACTCGCCGTCCGGGACGCGCTATCGTCCAAGGGACAGGGACAAGCAGCTAAGGGTACATGGGATAATGTCAGCTACTCGTTCAACCGCAAGGAAGCCAAGGACCATGGAGAGGGCGGGAATATTGTCGGTGCTCCTGTGAAGGGGAAGCGGGTGGTCATCGTGGACGATGTCATTACGGCGGGCACGGCATTGCGTGAGGCCATTGGGATTATCGAGAAGGAGGGTGGTACGGTGGTGGGCGTGGTTATCCTGCTGGATCGAGAGGAGAGGGTCAGTGATACGGAGGCGAAGAGCGCGGTGGGCGTTGCGCAGAGGTCGCTGGGAGACAAGGTGCCTATTCGCGCCGTGCTTGGGCTGCATGATCTGATTGAGAAACTGGGGGATCAGATTGGGGAGGCGGAGCTGCAGCGACTGAAGGAGTATCGTGCTCGCTATGGAGCTGAGTAGGTGTATATTTATGCATATGACATGATACCAGATGTGTTGAGTTCTGAAGGTCTACTTTTCTACTGTGGTTGAAAGTACTGGGTACAAAAGGTGTATAATGTATCGAGTGCTCCGTACATGCCATGCCTTGTGATGGATGCATGGATTCCCCGTTGAAAAGCCGAGTCAGATATATGCAAGGTACACGAGCCGTTCGTGCCGGAGGATTGAATGGGATGGCTGAACTTCGTGTTGGAGCACGAGCTGTCCACCGCAGTGAGACTTACCCAATGTGCCAGCTGGAAGTAAGACAGTAATAATAATAAGCACTAGGGCAAAGTCATGAGCCCACACATAGGTATAACAGTAACATAATATGTAATGCGGAATACGCGGATTTTGCATTATTATTTGCCATGGACGATGATAAGATGATTGATGTGTCAAATAACAATCGGCCACGGCAGTCTATTATGGGTATATAATATAACTATATACCCAGCGAAAAGTCCCTGACGGCATCGTGGAACCTGGAAGAACCGGTAAACGGGCTGGGAATGGGCCCGAGCCTCATCTTTTTCTTTTCTTTTTCCCCTTCCATTTTATGAGGGTCGCAGCCTCGTTCACTCGCATTAGAAGCATCAAGAAGCGAAGGAGGAAAAGCAAAAGCCCGCATCCAGCCTGGAGATTGTGTGATATTTATTATTATCATTGGATGCGAGTCAGACCTCTTGACTTATACGGGCCGTACAGCACGGATTCATCGAGCGTTCCGAAATTGCGTGGCTGGCTTTAGGTTTGAAGGTTCAACACCCTTATCGGGTTCTCATTACTTACTGTATACTGCACCTAAGTGACAGTACAGCATACAGCGTACGGTGTAATAACATAATCCGGTTTTCTCAGGAGGCGTATGAAAGGCAGGTGCTGCAATTGGATCGGGGTTATCGTGTGGACTTGGCAATGCTTGGCGGTGGCTTGAGGACAATGTATTCTCAGCGTCACCATTGGCAGATATTTGCAAACTGGTCTCTTCCCCAAGCCCTGGTATTCAGTGCCAGCACAAAGGAGGAGCTGAATAGGGCCCTTGCATCTTTTGAGAAAGGCAGCACGGATTTCCCATCTGTCCAGCTTCCGGATCCGAAGCCCGTCATCCTATGCTTTGGAGGGCAAGTTTCCACCTATGTTGGTTTGGATCAAGAGGTCTATAACAGCACTGCGATTTTGAGACATTACTTAGATCAGTGCGATGCCATGTGCCTTTCGCTAGGCCTGCAAAGTATCTACCCGGCTATTTTCCAACGGTCCCCAATCGAGGATATTGTTCAGCTTCAAACAGCGCTGTTTGCGATGCAGTATTCCTGCGCCAAGGCATGGATAGATAGCGGACTGAAGGTTGCCTCGGTCGTCGGGCACAGCTTTGGTGAGTTGATAGCTCTATGTGTCTCCAATGCTGTATCGTTGAAGGATGCTGTCAAGATGATTTCCGGTCGAGCCCGCCTTATTAAGGAGCGCTGGGGCGCTGACAAGGGGTCCATGATCGCTGTCGAGGCGGACCTTTCCGATGTGGAAGCTTTGTTGGCCAAGGTGAAATCACAGATGGGATCTGAAACGGGACTTGCAATCGCCTGCTATAATGCATCAAAAAGCTTCACATTGGCTGGGCCCACGAAAGACGTGGACCATGCCGAGAACTTGCTGAAAAATGACCCAGACTTCTCAGGAATAAGATATAAAAGACTGAACGTCACCAACGCCTTCCATTCGGTTCTCGTTGACGCGTTGATTGATGACCTAGAGAGTCTGGGACAAGGTATCAGGTTCAAGGAGCCGACGATTAAGCTTGAAAGAGCAACAGAGCAAGAGTCCACCAGCACATTAAATGCCAATTATGTGGCCACCCACATGAGAAAGCCAGTTTTCTTTGCCCAGGCAGTCAAGAGGTTGTCAGACAAATTCCCTGTTGCCATTTGGTTAGAGGCCGGATCGAACTCCACCATCACGGCCATGGCAAGCCGGGCTCTGGGTACATCAAACTCCTCTTTCCAGGCCGTCAACATTACTAGCGAGGGTGCATTCCGGTTCCTCTGCGACACGACCGTGAAACTCTGGAAGGAAGGCCAGAAAGTCAGCTTCTGGGCTCATCACCGCCTGCAGACACCTATGTATACTCCAGTCCTATTACCCCCGTATCAATTCGAGAAGTCGAGGCACTGGATGGATCTGAAGGTACCCCCGAAGCCCGAAGCTTCTGTGCAGGTGGCAGAGCAGACAGCAATTATCGAGGCACCGAAGGGCCTGACGACTTTCGTTGGTTATCAAGACGCATCCCAGCGCTCTGTGAGGTTCAGAGTAAATGTCACGACAGAAAAGTTTAACCGTCTCCTGTCCGGCCATATCATGGCAAATG(SEQ IDNO:2)

实施例7以基因敲入的方法敲除红曲霉中的桔霉素基因

按照实施例5的方法制备出尿嘧啶缺陷型的红曲霉原生质体，将敲除框片段，sgRNA2以及纯化的Cas9蛋白按照实施例5的方法转入尿嘧啶缺陷型的红曲霉原生质体，用尿嘧啶缺陷型培养基作为筛选。三天后观察生长状态，将长出的转化子进行发酵培养。发酵液上清用盐酸调节pH为2.5后加入等体积乙酸乙酯，萃取得有机层。菌体研磨后用乙酸乙酯萃取得有机层。将有机层用LC-MS进行检测，检测条件为:C18hypergold 100×2.1mm，柱温35℃，流速200μL/min，进样体积5μL,液相条件如下表3所示。

表3：LC-MS检测液相条件

结果如图4、5所示，在挑取的6个转化子进行发酵后均未检测到桔霉素。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种真菌的基因编辑方式，其特征在于，所用的方式为CRISPR/Cas9基因编辑方式。

2.根据权利要求1所述的基因编辑，其特征在于，所用的基因编辑包括基因敲除、基因灭活、基因敲入、基因替换。

3.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑方式，其特征在于，该种编辑方式通过转化体外纯化的CPP-Cas9蛋白和sgRNA进入宿主细胞体内实现。

4.根据权利要求3所述的sgRNA,其特征在于，所述的sgRNA是通过体外转录得到的。

5.根据权利要求3所述的CPP-Cas9蛋白，其特征在于，所述的CPP-Cas9蛋白含有核定位序列，细胞穿透肽和Cas9切割活性蛋白。

6.根据权利要求5所述的核定位序列和细胞穿透肽，其特征在于，所述的核定位序列和细胞穿透肽序列可以通过直接在微生物体内与Cas9切割活性蛋白共表达的方式连接在一起，也可以通过在体外通过化学相互作用连接在一起。

7.根据权利要求6所述的含有核定位序列的Cas9蛋白，其特征在于，所述Cas9蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No:1。

8.根据权利要求1所述的真菌，优选为青霉、曲霉。