CN100537772C - 一种指状青霉的根癌农杆菌介导的遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种指状青霉的根癌农杆菌介导的遗传转化方法，包括以下步骤：将质粒通过热激法转入根癌农杆菌，制得含有载体的根癌农杆菌；将含有载体的根癌农杆菌与指状青霉混合培养，以抗生素筛选，制得转化子。本发明方法再生率高，重复性好，操作简单，为指状青霉的基因表达和功能分析等分子操作奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种青霉菌的遗传转化方法，尤其涉及一种指状霉菌的根癌农杆菌介导的遗传转化方法。
背景技术
青霉属(Penicillium)真菌种类繁多，有的在医药和工业上具有重要的经济价值，如产黄青霉菌(P.chrysogenum Thom)和特异青霉(P.notatumWestling)能产生青霉素，为人类健康作出的重大贡献；灰黄青霉(P.griseofulvum)等可提取灰黄霉素等。然而，青霉属真菌中的一些种却是人类的重要病原菌，如马尔尼菲青霉菌(P.marneffei)为深部真菌感染性疾病的元凶，被认为是东南亚地区艾滋病患者最常见的机会性感染之一。
该属真菌中的不少种类则寄生或腐生在水果、蔬菜、粮食、肉类和其他食物上，不仅引起这些食品的腐烂和霉变，其产生的毒素还危急人类的健康。黄绿青霉(P.citreoviride Biourge)、桔青霉(P.citrinum Thom)和岛青霉(P.islandicum Sopp)能引起大米霉变，产生“黄变米”，它们产生的毒素如黄绿青霉素(citreoviridin)对动物神经系统有损害；桔青霉素(citrinin)能损害肾；岛青霉产生的黄天精、环氯素和岛青霉素均为肝脏毒。
指状青霉菌(P.digitatum)是引起贮藏期柑橘腐烂的最重要病原菌。通常采后柑橘因腐烂损失达20-30％，而其中的90％以上是由指状青霉菌或意大利青霉菌(P.italicum)所引起。为有效控制指状青霉菌对柑橘等水果造成的损失，有必要从分子水平上深入研究该病菌的致病机制、生长发育规律和杀菌剂的有效靶点，而一套有效的遗传转化体系则是开展指状青霉菌分子生物学研究的前提。指状青霉菌遗传转化体系的建立，不仅为指状青霉菌的分子生物学研究奠定基础，同时也为青霉属下的其他种的分子生物学、基因工程提供参考。
自从报道的遗传转化方法以来，所有国内外所报道的青霉菌的遗传转化体系均是利用通过制备原生质体，通过氯化钙-PEG介导技术来实现。原生质体的制备和再生繁琐、费时，而且受多种因素的影响，再生率低，重复性差。
根癌农杆菌是一种革兰阴性土壤杆菌，它能够在植物的受伤部位侵染植物细胞，将其Ti质粒上的T-DNA转入植物细胞并整合到植物的基因组，最终导致植物肿瘤的发生。因为这一机制，根癌农杆菌及其Ti质粒进行一系列的改造，成为植物细胞转化的载体，而且一直沿用至今。
Bundock等首次采用根癌农杆菌介导的方法进行了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的转化(Bundock，p.Dulk-Ras，A.Beijersbergen，A.G.M.，Hooykaas，P.J.J.(1995)Trans-kingdom T-DNA transfer fromAgrobacterium tumefaciens to saccharomyces cerevisiae.EMBO J.14，3206-3214)；de Groot等首先利用根癌农杆菌介导的方法成功地实现了丝状真菌的遗传转化(de Groot，M.J.A.，Bundock，p.Hooykaas，P.J.J.，A.Beijersbergen，A.G.M.(1998)Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation of filamentous fungi.Nat.Biotechnol.16，839-842)。这些开创性的工作为丝状真菌的遗传转化开辟了一条全新而有效的途径。根据Michiese等的统计，目前通过该方法实现转化的丝状真菌已有60余种。然而，迄今尚未有关根癌农杆菌介导的青霉菌的遗传转化方法。
将来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的trpC启动子替代用于转化植物的双元载体pCAMBIA1301中的CaMV 35S启动子，获得含潮霉素B抗性基因的载体pTFCM(李模孝华中农业大学2004届硕士论文盾壳霉T-DNA标记插入突变体库的构建及其质量评估)。
中国专利申请200410084578.6公开了一种根癌农杆菌介导的顶头孢霉的转化方法，包括以下步骤：
(1)构件重组载体质粒；
(2)通过电激法和三亲杂交法将载体质粒导入根癌农杆菌中，构建含有双元载体系统的根癌农杆菌；
(3)将含有双元载体系统的根癌农杆菌与顶头孢霉共培养，得到转化子；
(4)获得的转化子以耐抗生素进行筛选。
该专利公开的转化方法所用受体为原生质体或菌丝体，一方面原生质体制备困难，菌丝体由于性状分离，容易造成转化子不稳定。
发明内容
本发明提供了一种制备简单、再生率高、转化子稳定的指状青霉的根癌农杆菌介导的遗传转化方法。
一种指状青霉的根癌农杆菌介导的遗传转化方法，包括以下步骤：
(1)将质粒通过热激法转入根癌农杆菌，制得含有载体的根癌农杆菌，其中质粒为含潮霉素B抗性基因的质粒pTFCM。
(2)将含有载体的根癌农杆菌与指状青霉混合培养，以抗生素筛选，制得待定转化子。
指状青霉为孢子形态，孢子浓度为1×104～1×107个/毫升。
抗生素为潮霉素B、头孢霉素和壮观霉素中的一种或多种
混合培养的培养基为IM固体培养基，培养基含乙酰丁香酮(AS)。
为了得到更为稳定的转化子，将制得的待定转化子传代培养若干次后，以潮霉素B筛选，制得稳定的候选转化子。
本发明方法利用质粒pTFCM所含有的的潮霉素B抗性基因，通过在培养基中加入潮霉素B成为选择性培养基，在这种培养基上对经转基因转化处理的指状青霉进行选择性培养，已转化的指状青霉菌因为含有潮霉素B抗性基因而可以正常生长形成菌落，而未转化的指状青霉菌无该抗性基因，对潮霉素B极其敏感，因而不能生长。
由于不同微生物体之间具有特异性，从而不同生物的遗传转化操作也具有差异，相对于其它根癌农杆菌介导的遗传转化方法，本发明方法具有以下优点：
(1)对受体要求简单，可将孢子直接用于转化。
(2)以分生孢子作转化受体，再生率高，重复性好。
(3)选择具有单核的分生孢子作为受体可以得到后代不发生性状分离的转化子，避免真菌菌丝的多核所造成的转化子不稳定的难题。
(4)常规的真菌转化方法(如PEG介导，REMI等)必须制备原生质体，由于分生孢子难以制备原生质体，因此只有采用多核的菌丝作为原料制备。
本发明转化技术简便，得到转化子稳定，从而为指状青霉的基因表达和功能分析等分子操作奠定了基础。
附图说明
图1为本发明质粒pTFCM的物理谱图。
具体实施方式
培养基配方：
MM培养基：10mM K2HPO4，10mM KH2PO4，4mM(NH4)2SO4，2.5mMNaCl，2mM Mg SO4·7H2O，0.45mM CaCl2·2H2O，9μMFeSO4，10mM葡萄糖，PH＝6.9。
IM培养基：10mM K2HPO4，10mM KH2PO4，4mM(NH4)2SO4，2.5mMNaCl，2mM MgSO4·7H2O，0.45mM CaCl2·2H2O，9μM FeSO4，10mM葡萄糖，40mM2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)，0.5％甘油，PH＝5.3-5.5。
指状青霉的分离纯化
挑选霉烂的桔子，用酒精将腐烂部位擦洗干净，用灭过菌的刀片在腐烂部位边缘位置切下小块组织，每个腐烂部位切下三块组织，将这三块腐烂组织以三角形方向放到土豆培养基(PDA)(氨苄青霉素100μg/ml，链霉素100μg/ml杀死细菌)上，25℃培养3-4天后，从无污染的菌斑边缘处挑取菌丝块接种于新的PDA培养基上，于25℃继续培养3-4d，将产生的新鲜孢子加入20％的甘油中，作为原始菌株于-20℃保存。
指状青霉野生型菌株对潮霉素B的敏感性分析
随机挑选6株指状霉野生型菌株，将其接种于含有不同浓度潮霉素B(0、0.1、0.5、1、5、10、20、40μg/ml)的PDA培养基上，于25℃培养3-4天，测定指状青霉野生型菌株对潮霉素B的敏感程度。当潮霉素B浓度达到10μg/ml时，指状青霉的生长被完全抑制。
指状青霉的遗传转化
(1)挑取分离纯化后的野生型指状青霉菌株接种于PDA培养基上，于25℃培养3-4天，收集新鲜孢子。
(2)将含有潮霉素B抗性基因的质粒pTFCM(从华中农业大学获得)通过热激法转入根癌农杆菌AGL-1中。
(3)将含有pTFCM质粒的根癌农杆菌接种于含有卡那霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中28℃，180rpm过夜培养。用含有卡那霉素(100μg/ml)的MM液体培养基重新活化，28℃，180rpm培养24小时。吸取适量培养物7000rpm离心去上清，并用IM液体培养基洗涤两次，重新悬浮于含有AS200μg/ml的IM液体培养基中28℃，180rpm培养6h。最终用IM液体培养基稀释至OD600＝0.15。
(4)将第(1)步得到的新鲜孢子配制成1×104，1×105，1×106，1×107个/ml四种浓度的悬浮液。随后取上述孢子悬浮液与含有pTFCM质粒的根癌农杆菌AGL-1等体积混合，取200μl均匀涂到铺在IM固体培养基(含AS200μg/ml)上的滤纸上，25℃共培养2d。然后将滤纸转移到含有潮霉素B(75μg/ml，转化选择抗生素)、头孢霉素(50μg/ml，抑制农杆菌生长抗生素)、壮观霉素(50μg/ml，抑制农杆菌生长抗生素)的PDA培养基上25℃培养，直至长出的单菌落为转化子。然后挑选单菌落接种于于含有75μg/ml潮霉素B的PDA培养基上，继续生长的菌落保存为菌种。
再重复步骤(1)～(4)2次，且3次实验中均要有不含AS的实验对照，结果见表1。
稳定性分析
从上述得到的转化子中选取20株接种于不含有潮霉素B的PDA培养基上，传代培养5次后将其接种于含有100μg/ml潮霉素B的PDA培养基上，25℃培养3-4天后，将长出菌落的转化子作为稳定的候选转化子。对候选转化子进行计数，计算得到稳定性参数，结果如表1。
稳定性％＝候选转化子数/转化子数(20)
转化子假阳性鉴定
应用引物hph1(5’-TTC GAT GTA GGA GGG CGT GGAT-3’)和hph2(5’-CGC GTC TGC TGC TCC ATA CAA G-3’)对随机挑选6株候选转化子的基因组DNA进行PCR鉴定。
PCR体系：模板DNA溶解液1μl，1×PCR缓冲液(10mM Tris-HCI，pH8.3，50mMKCl，1.5mM MgCl2，0.001％明胶)，25μM dNTPs，0.15μM引物hph1和hph2以及0.8个单位的Taq酶。
PCR程序：94℃5min后，进入PCR循环，每个循环为94℃1min，55℃30s，72℃40s，共35个循环，然后72℃延伸10min。经1％琼脂糖凝胶电泳检测分析，观察记录结果。并对PCR产物进行测序分析，测试结果如表3所示。
将测序结果在NCBI官方网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行序列比对证实所扩增到的序列确属潮霉素B抗性基因的部分序列。
外源基因(T-DNA)插入方式分析
应用质粒pTFCM左右插入位点特异性引物(LB-1、LB-2、LB-3，RB-1、RB-2、RB-3)以及随机兼并引物(AD-1、AD-2、AD-3)对随机挑选的12株候选转化子进行热不对称交错PCR(TAIL-PCR)分析。
TAIL-PCR反应体系如下：
反应I：模板DNA溶解液1μl，1×PCR缓冲液(10mMTris-HCI，pH8.3，50mMKCl，1.5mM MgCl2，0.001％明胶)，0.2mM dNTPs，0.15μM的特异性引物(LB-1或者RB-1)，5μM随机兼并引物(AD-1AD-2AD-3)，以及0.8个单位的Taq酶。
反应II：1×PCR缓冲液(10mM Tris-HCI，pH8.3，50mMKCl，1.5mMMgCl2，0.001％明胶)，25μMdNTPs，0.2μM的特异性引物(LB-2或者RB-2)，5μM随机兼并引物(AD-1AD-2AD-3)，0.8个单位的Taq酶，将1μl反应I的PCR产物稀释100倍后取1μl作为模板。
反应III：1×PCR缓冲液(10mM Tris-HCI，pH8.3，50mM KCl，1.5mMMgCl2，0.001％明胶)，25μM dNTPs，0.15μM的特异性引物(LB-3或者RB-3)，5μM随机兼并引物(AD-1AD-2AD-3)，3.5个单位的Taq酶，将1μl反应II的PCR产物稀释100倍后取1μl作为模板。
TAIL-PCR程序见表4，将TAIL-PCR产物进行测序，T-DNA连接处序列如表5所示。其中，样品1为质粒pTFCM左右两臂插入位置的序列，2～13为12个随机挑选的指状青霉转化子。
由表5可以得出，T-DNA为随机插入指状青霉基因组序列中。
潮霉素B抗性基因拷贝数分析
以pTFCM来源的霉素B抗性基因为模板制作地高辛探针，以质粒pTFCM经限制性内切酶Hind III消化后的样品为阳性对照。随机挑选14株候选转化子，提取其基因组DNA，用限制性内切酶KpnI消化后进行琼脂糖凝胶电泳将DNA转移到尼龙膜上进行Southern杂交，结果发现14株候选转化子均出现一条条带，可见所选转化子中外源潮霉素B抗性基因为单拷贝。
表1(转化子数及稳定性)
| 引物名称 | 核苷酸序列 | 退火温度 |
| LB-1 | GGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATG | 64℃ |
| LB-2 | CATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCT | 60℃ |
| LB-3 | GAATTAATTCGGCGTTAATTCAGT | 56℃ |
| RB-1 | GGCACTGGCCGTCGTTTTACAAC | 64℃ |
| RB-2 | AACGTCGTGACTGGGAAAACCCT | 62℃ |
| RB-3 | CCCTTCCCAACAGTTGCGCA | 61℃ |
| AD-1 | WGTGNAGWANCANAGA | 45℃ |
| AD-2 | NGTCGASWGANAWGAA | 47℃ |
| AD-3 | NTCGASTWTSGWGTT | 45℃ |
表2(TAIL-PCR引物序列)
表3(PCR产物序列)
| 反应 | 文件号 | 循环次数 | 温度设定 |
| 反应I | 1 | 1 | 92℃(2min)，95℃(1min) |
| 2 | 5 | 94℃(15s)，63℃(1min)，72℃(2min) | |
| 3 | 1 | 94℃(15s)，30℃(3mm)，以0.2℃/s升至72℃，72℃(2min) | |
| 4 | 10 | 94℃(5s)，44℃(1min)，72℃(2min) | |
| 5 | 12 | 94℃(5s)，63℃(1min)，72℃(2min)94℃(5s)，63℃(1mini，72℃(2min)94℃(5s)，44℃(1min)，72℃(2min) | |
| 6 | 1 | 72℃(5min) | |
| 反应II | 7 | 10 | 94℃(5s)，63℃(1min)，72℃(2min)94℃(5s)，63℃(1mini，72℃(2min)94℃(5s)，44℃(1min)，72℃(2min) |
| 6 | 1 | 72℃(5min) | |
| 反应III | 8 | 20 | 94℃(10s)，44℃(1mini，72℃(2min) |
| 6 | 1 | 72℃(5min) |
表4(TAIL-PCR程序)
| 样品号 | T-DNA连接处序列(左臂) | T-DNA连接处序列(右臂) |
| 1 | CCGTCCTATATAACACCACA | TTTAAACTATCAGTGTTTGACAG |
| 2 | ttagacctatgacgtgtaGTCCTATATAACACCACA | TTTAAACTATCAGTGTTTGAattatccgttgtgttgacag |
| 3 | actaccttcttttacttggtGTCCTATATAACACCACA | TTTAAACTATCAGTGTTTGAccggaagatgtcgatgaag |
| 4 | gaggaccgagaggaggGTCCTATATAACACCACA | TTTAAACTATCAGTGTTTGAacggcaaacaacccgagc |
| 5 | tcgacccatacccgttagGTCCTATATAACACCACA | TTTAAACTATCAGTGTTTGActcttaaaaggtcttccggt |
| 6 | tagagctcgaactatagtGTCCTATATAACACCACA | TTTAAACTATCAGTGTTTGActgtcgaactgtccaccgg |
| 7 | tgtggatactgaagagtcGTCCTATATAACACCACA | TTTAAACTATCAGTGTTTGAcaggggggctctggatga |
| 8 | aactctttcccttacacagGTCCTATATAACACCACA | TTTAAACTATCAGTGTTTGAgacggaatcattgccgcaa |
| 9 | aaggctgccacgaaggGTCCTATATAACACCACA | TTTAAACTATCAGTGTTTGAtcgatcagcgttacagtcag |
| 10 | gcccgttatcttgacctaaGTCCTATATAACACCACA | TTTAAACTATCAGTGTTTGAgcgacaggaagtcttttcaa |
| 11 | gtcttgtctagtttattataGTCCTATATAACACCACA | TTTAAACTATCAGTGTTTGAacataggccatcaacataa |
| 12 | acctacccgtggtataacGTCCTATATAACACCACA | TTTAAACTATCAGTGTTTGAagaaggacgaagagaaat |
| 13 | aaactcgtgctgattgggGTCCTATATAACACCACA | TTTAAACTATCAGTGTTTGAacgttgaggctggaagaaa |
表5(T-DNA连接处序列)
Claims (6)
1.一种指状青霉的根癌农杆菌介导的遗传转化方法，包括以下步骤：
(1)将质粒pTFCM通过热激法转入根癌农杆菌，制得含有载体的根癌农杆菌，所述的质粒pTFCM如图1所示；
(2)将含有载体的根癌农杆菌与指状青霉在含有诱导剂乙酰丁香酮的培养基中混合培养，以抗生素筛选，制得转化子。
2.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：所述的步骤(2)中混合培养的培养基为IM固体培养基。
3.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的指状青霉为孢子状指状青霉。
4.根据权利要求3所述的遗传转化方法，其特征在于：所述孢子状指状青霉浓度为1×104～1×107个/毫升。
5.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：步骤(2)中所述的抗生素为头孢霉素和壮观霉素中的至少一种与潮霉素B的混合物。
6.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：步骤(2)中的转化子传代培养若干次后，以潮霉素B筛选，制得稳定的转化子。
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