CN102586168A

CN102586168A - 病原真菌致病性新基因pcg16及其用途

Info

Publication number: CN102586168A
Application number: CN2012100482486A
Authority: CN
Inventors: 彭友良; 左玉山; 杨俊�; 王大伟; 赵文生; 张燕
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2012-02-28
Filing date: 2012-02-28
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2032-02-28
Also published as: CN102586168B

Abstract

本发明公开了一种病原真菌致病性新基因PCG16及其用途。该基因PCG16表达的蛋白质如序列表序列3所示，该蛋白可用于调控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子的产生。实验证明，蛋白Pcg16的编码基因PCG16被潮霉素磷酸转移酶基因(hph)置换后得到的敲除体X3产生分生孢子极少，且在菌丝块接种划伤的水稻叶片上不能形成病斑，而PCG16基因的互补体W6与野生型稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)菌株P131的分生孢子产生量相同，且在菌丝块接种划伤的水稻叶片上均能形成病斑。更进一步地说，基因PCG16的缺失即蛋白Pcg16不表达，可导致稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)的分生孢子产生量减少，对水稻的侵染能力丧失。本发明所提供的方法和应用在植物稻瘟菌病害的控制方面具有重要意义。

Description

病原真菌致病性新基因PCG16及其用途

技术领域

本发明涉及一种病原真菌致病性新基因PCG16及其用途。

背景技术

稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)是子囊菌亚门的真菌，能侵染水稻、小麦、大麦、粟以及其它多种禾本科植物，导致瘟病。一般情况下，稻瘟病的危害可使水稻减产5-10％，重病田可导致水稻绝收。稻瘟病是我国水稻的主要病害之一，也是世界性的水稻病害。

稻瘟菌以分生孢子作为侵染寄主植物的初侵染源和再侵染源。稻瘟菌的一部分菌丝在生长过程中分化为分生孢子梗。分生孢子梗顶端细胞膨大形成第一个分生孢子，此后，顶端的极性向一边偏移进而依次产生另外的分生孢子。稻瘟菌的分生孢子呈梨形，由三个细胞组成。一般5至9个分生孢子以合轴的方式从一个分生孢子梗的顶端产生。分生孢子释放后，在分生孢子梗上留下屈膝状的疤痕。释放后的分生孢子吸附到叶片上，经过萌发形成附着胞，成熟的附着胞内产生与累积膨胀压；然后，附着胞下产生侵染钉直接穿透植物表皮，并在植物细胞内形成侵染性菌丝；最后侵染性菌丝在植物细胞内和细胞间扩展、定植。稻瘟菌侵染感病寄主时，侵染性菌丝在植物组织内扩展形成直径2-3毫米以上的灰色或灰褐色病斑，这些病斑中的侵染菌丝穿透植物组织向空中分化形成分生孢子梗，进一步形成分生孢子。分生孢子在风、雨的冲刷下释放、附着，重新引起植物的再侵染。稻瘟菌从分生孢子附着到分生孢子再产生的周期一般所需时间为3-5天；在植物的生长季节，如果条件适宜，能够多次侵染，造成危害。综上所述，分生孢子的形成是稻瘟菌侵染植物所必需的过程，稻瘟病的严重度与稻瘟菌分生孢子的产生量呈正相关。如果能阻断稻瘟菌的分生孢子形成，就可以控制稻瘟病的发生。

发明内容

本发明的目的是提供病原真菌致病性蛋白Pcg16及其编码基因PCG16的新用途。所述蛋白Pcg16为序列表序列3所示的蛋白质，其编码基因PCG16为序列表序列1中第1991位至第2530位所示的核苷酸序列。

本发明所提供的新用途之一是序列表序列3所示的蛋白质可用于调控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子的产生，或调节序列表序列3所示的蛋白质表达量的物质用于调控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子的产生。

实验证明，病原真菌致病性蛋白Pcg16的表达量降低时，稻瘟菌(Magnaportheoryzae)分生孢子的产生量减少。基于该实验，本发明提供了一种调控稻瘟菌 (Magnaporthe oryzae)分生孢子产生的方法。

所述调控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生的方法，包括调控所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的表达水平，或调控所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质编码基因的转录水平的步骤。

所述调控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生的方法具体可为降低稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生的方法，包括降低所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的表达水平，或降低所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质编码基因的转录水平的步骤。

进一步的实验证明，稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子的产生量减少，所述稻瘟菌对寄主植物的致病力减弱。基于该实验，本发明提供一种降低稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)对植物致病力的方法。

该方法包括抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的编码基因表达的步骤。

本领域技术人员可根据实际需要，通过筛选或鉴定调控所述蛋白质表达量的物质来实现稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生量的调控，最终控制植物稻瘟菌病害的发生和危害。

下述以稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所示的蛋白质或其编码基因为靶点筛选或鉴定植物稻瘟菌杀菌剂的方法均属于本发明的保护范围：

本发明提供的筛选植物稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)杀菌剂的方法，包括以所述稻瘟菌中序列表序列3所示的蛋白质为靶点对待检测物质进行筛选，将得到的抑制序列表序列3所示蛋白质表达的待检测物质作为候选的植物稻瘟菌杀菌剂的步骤。

本发明提供的筛选植物稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)杀菌剂的方法，包括以所述稻瘟菌中序列表序列3所示的蛋白质的编码基因为靶点对待检测物质进行筛选，将得到的抑制序列表序列3所示蛋白质编码基因转录的待检测物质作为候选的植物稻瘟菌杀菌剂的步骤。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定植物稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)候选杀菌剂的方法，包括如下步骤：检测待测物质能否抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的表达，如所述待测物质能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示的蛋白质表达，则所述待测物质为候选的所述植物稻瘟菌杀菌剂；如所述待测物质不能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示的蛋白质表达，则所述待测物质为非候选的所述植物稻瘟菌杀菌剂。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定植物稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)候选杀菌剂的方法，包括如下步骤：检测待测物质能否抑制稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的编码基因的转录，如所述待测物质能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的编码基因的转录，则所述待测物质为候选的所述植物稻瘟菌杀菌剂；如所述待测物质不能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的编码基因的转录，则所述待测物质为非候选的所述植物稻瘟菌杀菌剂。

下述以物质在制备植物稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)杀菌剂中的应用均属于本发明的保护范围：

本发明保护具有如下1)-4)中至少一种功能的物质在制备植物稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)杀菌剂中的应用：

1)抑制序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质的表达；

2)抑制将序列表序列3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加、且具有调控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生功能的蛋白质的表达；

3)抑制序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因的转录；

4)抑制将序列表序列3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加、且具有调控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生功能的蛋白质的编码基因的转录。

本发明还保护具有如下5)-8)中至少一种功能的物质在制备植物稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)杀菌剂中的应用：

5)降低序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质的表达水平；

6)降低将序列表序列3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加、且具有调控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生功能的蛋白质的表达水平；

7)降低序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因的转录水平；

8)降低将序列表序列3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加、且具有调控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生功能的蛋白质的编码基因的转录水平。

本发明还保护具有如下功能的物质在制备植物稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)杀菌剂中的应用：使序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质失活或使将序列表序列3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加、且具有调控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生功能的蛋白质失活。

本发明提供一种敲除载体和重组稻瘟菌，所述敲除载体为敲除稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所示蛋白质编码基因的重组载体；所述敲除载体具体可按照包括如下步骤的方法得到：

将序列表序列1的第867位至第1864位核苷酸片段连接到质粒pKNH的BamHI和EcoRI位点间，并将序列表序列1的第2595位至第3469位核苷酸片段连接到质粒pKNH 的HindIII和KpnI位点间，得到的重组载体即为所述敲除载体；

所述重组稻瘟菌为将稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所示蛋白质编码基因敲除得到的重组菌，所述重组稻瘟菌具体可通过包括如下步骤的方法得到：将所述敲除载体导入所述稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)中，敲除所述稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所示蛋白质的编码基因。

本发明保护所述敲除载体在敲除稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所示蛋白质编码基因中的应用。

本发明提供一种DNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列是序列表序列1中的第1位至第1990位所示的核苷酸序列。

本发明保护所述DNA分子在作为启动子中的应用。

实验证明，蛋白Pcg16的编码基因PCG16被潮霉素磷酸转移酶基因(hph)置换后得到的敲除体X3产生分生孢子极少，且在菌丝块接种划伤的水稻叶片上不能形成病斑，而PCG16基因的互补体W6与野生型稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)菌株P131的分生孢子产生量相同，且在菌丝块接种划伤的水稻叶片上均能形成病斑。更进一步地说，基因PCG16的缺失即蛋白Pcg16不表达，可导致稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)的分生孢子产生量减少，对水稻的侵染能力丧失。本发明所提供的方法和应用在植物稻瘟菌病害的控制方面具有重要意义。

附图说明

图1为野生型稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)菌株P131及其突变体CD8069的菌落。其中，左图为野生型稻瘟菌菌株P131的菌落，右图为突变体CD8069的菌落。

图2为突变体CD8069中的T-DNA在PCG16启动子区域的插入位置示意图。其中，黑色矩形代表外显子，L和R分别代表T-DNA的左边缘和右边缘，Bg和H分别代表BglI和HindIII，各位置以PCG16的转录起始位点为基准，T-DNA片段大小为5kb。

图3为突变体CD8069的Southern杂交图。其中，从左至右的泳道依次为：HindIII酶切野生型稻瘟菌菌株P131的基因组、HindIII酶切突变体CD8069的基因组、BglI酶切野生型稻瘟菌菌株P131的基因组和BglI酶切突变体CD8069的基因组；第2泳道有杂交信号的条带大小为9.0kb，第4泳道有杂交信号的条带大小为7.0kb。

图4为敲除载体pZ2的构建示意图。其中，C、B、E、H、K分别代表限制性内切酶ClaI、BamHI、EcoRI、HindIII、KpnI，hph代表潮霉素磷酸转移酶基因，上方为野生型稻瘟菌菌株P131的基因组片段，下方为敲除载体pZ2的基因片段。

图5为PCG16基因敲除体X3的Southern杂交验证。其中，左侧泳道为ClaI酶切的野生型菌株P131的基因组，右侧泳道为ClaI酶切的敲除体X3的基因组，左侧杂交带大小为3,664bp，右侧杂交带大小为7,173bp。

图6为PCG16基因的敲除体X3和互补体W6的RT-PCR验证。其中，P131为野生型，X3为PCG16的敲除体，W6为PCG16敲除体X3的互补体，Actin为对照。

图7为野生型稻瘟菌菌株P131、敲除体X3和互补体W6的菌落生长外观。

图8为野生型稻瘟菌菌株P131、敲除体X3和互补体W6的菌落直径大小。

图9为野生型稻瘟菌菌株P131、敲除体X3和互补体W6的菌丝及分生孢子产生量。其中，A为野生型稻瘟菌菌株P131、敲除体X3和互补体W6的分生孢子梗以及分生孢子产生情况，标尺为50微米；B为野生型稻瘟菌菌株P131、敲除体X3和互补体W6的分生孢子产生量。

图10为野生型稻瘟菌菌株P131、敲除体X3和互补体W6对水稻侵染能力的比较。

图11为PCG16的表达情况。其中，左列DIC为相差视野下明视场下拍摄，右列GFP为荧光视野下暗视场蓝光下拍摄，标尺长度为20微米；A为含有PCG16-GFP融合载体的互补体W6的分生孢子，B为含有PCG16-GFP融合载体的互补体W6的附着胞。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的野生型稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)菌株P131、pKNH、pKNTG和水稻(Oryzae sativa)小种丽江新团黑谷(Lijiangxintuanheigu)与如下文献中所使用的相同，公众可从中国农业大学获得：Jun Yang et al.A Novel ProteinComl Is Required for Normal Conidium Morphology and Full Virulence inMagnaporthe oryzae.Mol Plant Microbe Interact.2010Jan；23(1)：112-23.

实施例1、稻瘟菌PCG16基因的克隆

一、突变体的筛选与鉴定

1、分生孢子的制备

使用涂菌产孢的方法制备分生孢子，具体方法如下：

将野生型稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)菌株P131的各根癌农杆菌介导(ATMT)的转化体的菌丝充分打断，均匀地涂布到西红柿汁燕麦片培养基平板上，26℃-28℃培养，当肉眼可见新生菌丝长出培养基表面时，用棉签轻轻将菌丝洗下，并用水冲洗干净，盖上单层纱布，于26℃-28℃光照培养48小时后，在培养基表面即可见大量的稻瘟菌孢子。

西红柿汁燕麦片培养基的配制：取150ml西红柿汁、30-50克燕麦片煮沸30分钟过滤后的滤液和20克琼脂，用水定容至1升。

2、分生孢子产孢量相关突变体的筛选

将各ATMT转化体通过步骤1的方法制备得到的分生孢子用30ml水洗、收集，利用血球记数板在显微镜下测定其分生孢子数；并以野生型稻瘟菌菌株P131为对照，筛选产孢量有显著差异的菌，结果获得一个产孢量显著降低的突变体CD8069。

取野生型菌株P131和突变体CD8069各6皿进行产孢量测定，结果发现：突变体CD8069的产孢量显著降低，只有野生型菌株的7％(见表1)，其菌落生长速度较野生型菌株P131也有了明显的下降，为P131的87％(图1)，图1为各菌株在西红柿汁燕麦片培养基平板上活化后，采用打孔器分别挖取大小一致的菌丝块，继续转移到西红柿汁燕麦片培养基板上，28℃培养120小时后照相。

表1.突变体与野生型菌分生孢子产量的区别

二、突变体表型变化与插入标记共分离分析

将突变体CD8069分别与不具有潮霉素抗性、产孢正常且交配型相反的稻瘟菌菌株S1528在西红柿燕麦片培养基上进行对峙培养。首先，于25℃培养至菌落边缘即将接触，然后将其移至20℃光照培养16天，在菌落的交界处形成黑色突起的子囊壳；然后，挑取成熟的子囊壳，于无菌水中轻轻挤破，释放壳内的子囊，将子囊悬浮液涂在水琼脂平板上，24小时后挑取子囊中子囊孢子萌发的单根菌丝到西红柿燕麦片培养基上培养。统计这些子囊孢子后代的潮霉素抗性和分生孢子产生情况，结果如表2所示。从该结果可知，在测定的子囊孢子后代中，对潮霉素敏感的后代产孢量都为正常野生表型，抗潮霉素的后代产孢量都为突变表型，说明此突变体的失去产孢能力的表型与插入标记潮霉素抗性基因是共分离的。

表2.S1528与突变体CD8069杂交后代的潮霉素抗性与突变性状分析

三、PCG16基因的克隆

通过TAIL-PCR方法，获得了突变体CD8069的T-DNA插入位点侧端的基因组序列，并确定了该突变体中T-DNA的插入位置。TAIL-PCR的具体方法如下：

用CTAB法抽提突变体CD8069的基因组DNA，将抽提的DNA定量为30ng/μl。取1μl的基因组DNA，用通过热不对称交错PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR)程序一扩增，将得到的一级产物稀释100倍后，吸取1μl作为模板进行 TAIL-PCR程序二扩增，将得到的二级产物稀释100倍后，吸取1μl作为三级反应的模板进行TAIL-PCR程序三扩增，将得到的三级产物于1.0％琼脂糖凝胶中进行电泳分析，电泳缓冲液为1×TAE。电泳结束后将凝胶于溴化乙锭(EB)中染色10-15min，于凝胶成像仪中观察并记录结果，将大于500bp且小于二级产物的三级产物切下，回收，送北京博迈德公司测序。测序结果与已公布的稻瘟菌基因组序列(http://www.riceblast.org/)进行比对确定T-DNA插入位占。

TAIL-PCR的引物如下：

T-DNA左边界嵌套引物为：

HS1：5’-GGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGA-3’；

HS2：5’-TGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGT-3’；

HS3：5’-TCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCG-3’；

T-DNA右边界嵌套引物为：

RHS-1：5’-CTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGT-3’；

RHS-2：5’-CAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTC-3’；

RHS-3：5’-TGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAA-3’；

随机引物为：

AD1：5’-NGTCGASWGANAWGAA-3’；

AD2：5’-GTNCGASWCANAWGTT-3’；

AD3：5’-WGTGNAGWANCANAGA-3’。

TAIL-PCR的反应体系及扩增条件见表3和表4。

表3.TAIL-PCR的反应体系

表4.TAIL-PCR的扩增条件

结果表明，在突变体CD8069中，T-DNA插入在MGG_04041.6(序列表中序列1中的第1991-2530位)上游的启动子区域(图2)，ATG上游96个碱基处(序列表中序列1所示的核苷酸序列的第1895位)，将基因MGG_04041.6命名为PCG16。PCG16的编码区有2个外显子，分别位于序列表序列1的第1991位至2143位、第2234位至2530位；序列表序列1的第1位至1990位为PCG16的启动子区；PCG16的编码序列为序列表中序列2所示的序列。

三、突变体的验证

为了验证CD8069是否为真正的单位点插入突变体，分别用限制性内切酶HindIII和BglI完全消解野生型P131和突变体CD8069的基因组DNA，以潮霉素为探针进行Southern杂交实验。利用随机引物标记试剂盒(Takara，D6045)和α-³²P-dCPT同位素标记探针。

结果：野生型菌株P131无杂交信号，突变体CD8069分别出现9.0kb和7.0kb的目的条带(图3)。由此表明，突变体CD8069是单位点插入的突变体。

实施例2、PCG16的功能验证

本发明采用基因敲除实验和基因互补实验证明PCG16在稻瘟菌分生孢子产生中的作用。首先构建敲除载体pZ2和基因互补载体pKNTG-PCG16，然后将前者导入野生型稻瘟菌P131获得敲除体X3，将后者导入敲除体X3中获得互补转化体W6。对得到的敲除体X3和互补转化体W6进行分生孢子产生量测定，以野生型稻瘟菌P131为对照。基因敲除载体的构建是将位于PCG16基因两侧的各一段DNA序列连入一个载体中，两者之间用潮霉素磷酸转移酶基因(hph)(该hph上无ClaI识别位点)隔开。该基因敲除载体通过PCG16基因两侧的侧翼序列与野生型稻瘟菌P131基因组的相应序列发生同源重组，从而将野生型稻瘟菌P131基因组中的PCG16基因与基因敲除载体上的潮霉素磷酸转移酶基因置换。互补载体的构建是将包含PCG16基因全长功能性序列的DNA片段与一个带有新霉素磷酸转移酶基因(nptII)的载体相连。

一、基因敲除载体的构建与转化

1、基因敲除载体的构建

设计PCR引物，以野生型稻瘟菌P131的基因组DNA为模板，分别扩增PCG16基因的左臂片段(序列表序列1的第867位至第1864位)和右臂片段(序列表序列1的第2595位至第3469位)，左臂正向引物5’-CATGGATCCGTCGCTGCTCTCAAC-3’，其5’端带有BamHI酶切位点，反向引物为5’-CATGAATTCGTGCGGGAACCTCTC-3’，其5’端带有EcoRI酶切位点；右臂正向引物5’-CATAAGCTTGGCACGGCACTGATTC-3’，其5’端带有HindIII酶切位点，反向引物为5’-CATGGTACCTTGGCGAGCCTAGATCC-3’，其5’端带有KpnI酶切位点。将扩增得到的左臂片段用BamHI和EcoRI酶切，右臂片段用HindIII和KpnI酶切，将含有BamHI和EcoRI粘性末端的左臂先连接到质粒pKNH的经BamHI和EcoRI双酶切后的大片段上，得到中间载体pKHN-左臂，再把含有HindIII和KpnI粘性末端的右臂连接到pKNH-左臂的经HindIII和KpnI双酶切后的大片段上，获得图4所示的PCG16基因的敲除载体pZ2，该载体可敲除野生型稻瘟菌P131中的序列表序列1的第1865位至第2594位所示的序列(该序列中包含序列表序列3所示蛋白质的编码序列)。

2、基因敲除载体的转化

500毫升三角瓶装入150毫升液体CM培养基(酵母提取物0.1％，酶水解干酪素0.05％，葡萄糖1％，硝酸钙0.1％，磷酸二氢钾0.02％，硫酸镁0.025％，氯化钠0.015％)，接入野生型稻瘟菌P131的适量菌丝、孢子混和体，在26-28℃、100转/分条件下摇培30-32小时，三层灭菌擦镜纸过滤收集菌丝体，菌丝体用0.7M氯化钠溶液洗涤后转移至灭菌的50毫升离心管中，每1克菌丝加入1毫升的酶渗透液(含20毫克/毫升崩溃酶的0.7M氯化钠水溶液)，26-28℃、100转/分条件下酶解3-4小时后，用0.7M氯化钠洗涤菌丝体，经三层灭菌擦镜纸过滤，收集原生质体，4,000转/分离心15分钟，先用25毫升STC溶液(1.2M山梨醇，50mM氯化钙，10mM Tris-Cl，pH7.5)洗涤原生质体一次，然后分别用10毫升STC溶液洗2次，离心沉淀后用STC溶液将原生质体浓度调至0.5×10⁸-1×10⁸个/毫升。

将野生型稻瘟菌P131的原生质体分装于灭菌的50毫升离心管中，每管300微升，加入约2微克经限制性内切酶NotI线性化的敲除载体pZ2，冰上放置20分钟，逐滴加入2毫升/管PTC溶液(60％聚己二醇3350，5.50mM氯化钙，10mM Tris-Cl，pH7.0)，冰上静置20分钟，加入25毫升/管预冷的STC溶液，混匀后，4,000rpm、4℃离心15分钟，弃上清，每管加入3毫升的LR培养基(0.1％酵母提取物，0.1％酶水解干酪素，1M蔗糖)，26-28℃培养12-18小时，转入培养皿，加入15毫升冷却至50℃左右的SR培养基(LR+1.6％琼脂)，混匀，待其凝固后，上面铺15毫升的0.7％琼脂，里面含400微克/毫升的潮霉素(Roche)，28℃培养4-6天，出现的转化体即为野生型稻瘟菌P131的PCG16的敲除体X3。

3、敲除体的Southern杂交验证

用限制性内切酶ClaI完全消解野生型稻瘟菌P131和敲除体X3的基因组DNA，以步骤1得到的左臂为探针。利用随机引物标记试剂盒(Takara，D6045)和α-³²P-dCPT同位素标记探针。

结果：野生型稻瘟菌P131的泳道出现3664bp的杂交条带，敲除体X3出现7173bp的杂交条带(图5)。结果表明，敲除体X3的基因组中PCG16基因已被敲除。

二、互补载体的构建及转化

1、互补载体的构建

首先设计引物，扩增包含PCG16的启动子区和编码区的DNA片段，使用的正向引物为5’-ATAGGTACCTTGACCGTTGGGTCTTCT-3’，其5’带有KpnI酶切位点；反向引物为5’-CGGAAGCTTCAGTACTTGTTGAACCAG-3’，其5’带有HindIII酶切位点。以野生型稻瘟菌P131的基因组DNA为模板，扩增出包含序列表序列1的第1位至第2527位序列的片段，该片段可编码序列表中序列3所示的蛋白质。将该片段用限制性内切酶KpnI和HindIII双酶切后与质粒pKNTG的经限制性内切酶KpnI和HindIII双酶切后的大片段相连接，得到包含有融合基因PCG16-GFP和新霉素磷酸转移酶基因(nptII)的质粒pKNTG-PCG16。质粒pKNTG-PCG16可以用来互补基因PCG16的敲除体X3，还可以用于转化制备PCG16基因的亚细胞定位转化体。

2、互补载体的转化

将互补载体pKNTG-PCG16按照步骤一中2的方法转入敲除体X3中，用含250微克/毫升新霉素(Amresco)的培养基筛选转化体，得到敲除体X3的互补体W6。

3、敲除体与互补体的RT-PCR验证

使用TaKaRa的反转录试剂盒(TaKaRa，DRR014A)分别以野生型、敲除体和互补体菌株P131、X3和W6的总RNA为模板进行反转录，再用1μl反转录产物为模板，以PCG16的引物5’-GAGAAGCGCAACAGGGAACG-3’，5’-TGAACCAGCTCCAGGACATC-3’和对照Actin的引物5’-ACGGTGTTACTCACGTTGTTC-3’，5’-ATCTCCTTCTGCATACGGTC-3’分别进行PCR扩增。将扩增后得到的产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳。结果如图6所示：野生型稻瘟菌菌株P131和互补体W6均可扩出393bp的目的条带，而敲除体X3不能扩出该目的条带，表明野生型稻瘟菌菌株P131以及互补体W6中PCG16能够表达，而敲除体X3中PCG16不能表达。

三、野生型、敲除体和互补体的菌丝生长及分生孢子产生量测定

将野生型、敲除体和互补体菌株P131、X3和W6分别在西红柿汁燕麦片培养基平板上活化后，采用打孔器分别挖取大小一致的菌丝块，继续转移到西红柿汁燕麦片培养基板上，28℃培养120小时后照相，结果如图7所示，分别取3种菌的培养皿各3个，测量菌落直径(mm)，计算平均值，结果如图8所示。将在西红柿燕麦培养基上培养的新鲜菌落用无菌水洗去菌丝，将洗去菌丝的菌落切成薄片置于载玻片上，28℃保湿光照培养，2天后于20倍体式显微镜下拍照，结果如图9A所示；按照实施例1中的涂菌产孢法，将稻瘟菌菌株P131、敲除体X3和互补体W6的菌丝充分打断，分别均匀地涂布到6cm的西红柿汁燕麦片培养基平板上，26℃-28℃培养，当肉眼可见新生菌丝长出培养基表面时，用棉签轻轻将菌丝洗下，并用水冲洗干净，盖上单层纱布，于26℃-28℃光照培养48小时后，在培养基表面即可见大量的稻瘟菌孢子。用30ml无菌水将每一皿孢子洗下，使用血球计数板计数后计算该皿的孢子总数，每种菌取3皿的平均值，结果如图9B。

图7-8的结果表明，hph置换PCG16后，敲除体X3菌落的生长速度与野生型菌株P131相比明显降低，互补体W6恢复了野生型菌株P131菌落的生长速度；

图9的结果表明，hph置换PCG16后，敲除体X3的分生孢子产生量为野生型P131的4％，互补体W6恢复了野生型菌株P131的分生孢子产生量。

实施例3、野生型、敲除体与互补体的菌株对水稻的侵染能力比较

为验证PCG16基因在对水稻侵染能力中的作用，将野生型稻瘟菌菌株P131、敲除体X3与互补体W6分别接种在划伤的水稻(Oryzae sativa)小种丽江新团黑谷(Lijiangxintuanheigu)叶片上，具体操作如下：

1、将野生型稻瘟菌菌株P131、敲除体X3与互补体W6分别在西红柿汁燕麦片培养基上培养120小时，用手术刀切取西红柿汁燕麦片培养基上相同大小(3mm×3mm)的新鲜菌丝块。

2、取完全展开的第五片水稻叶片的中间部分，剪成长约5cm的片断，用细针划伤表面，1cm间距接种新鲜菌丝块，0.025％的吐温喷于叶片表面保湿，28℃黑暗培养36小时，再光照保湿培养72小时，观察菌株对水稻叶片侵染情况。

结果：野生型稻瘟菌菌株P131和互补体W6在划伤的水稻叶片上均能形成病斑；而敲除体X3在划伤的水稻叶片上不能形成病斑(如图10所示)。结果表明，由于PCG16基因的缺失，导致敲除体X3中无序列表序列3所示的蛋白质的表达，分生孢子的产生量减少，最终导致稻瘟菌对水稻侵染能力丧失。

实施例4、基因PCG16的表达

用灭菌蒸馏水洗脱互补转化体W6的分生孢子，擦镜纸过滤后，点接到载玻片上，制备简易玻片，Nikon Eclipse 800观察和拍摄分生孢子中GFP的表达(图11A)。将以上得到的分生孢子液点接在疏水玻片上，保湿培养8小时后，可观察拍摄到附着胞中GFP的表达(图11B)。

结果表明，PCG16在互补体W6的分生孢子、附着胞阶段都有表达。

Claims

1.序列表序列3所示的蛋白质在调控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生中的应用。

2.调控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生的方法，包括调控所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的表达水平，或调控所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质编码基因的转录水平的步骤。

3.降低稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)对植物致病力的方法，包括抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的编码基因表达的步骤。

4.一种筛选植物稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)杀菌剂的方法，包括以所述稻瘟菌中序列表序列3所示的蛋白质为靶点对待检测物质进行筛选，将得到的抑制序列表序列3所示蛋白质表达的待检测物质作为候选的植物稻瘟菌杀菌剂的步骤；

或，包括以所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的编码基因为靶点对待检测物质进行筛选，将得到的抑制序列表序列3所示蛋白质编码基因转录的待检测物质作为候选的植物稻瘟菌杀菌剂的步骤。

5.一种鉴定或辅助鉴定植物稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)候选杀菌剂的方法，包括如下步骤：检测待测物质能否抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的表达，如所述待测物质能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的表达，则所述待测物质为候选的所述植物稻瘟菌杀菌剂；如所述待测物质不能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的表达，则所述待测物质为非候选的所述植物稻瘟菌杀菌剂；

或，检测待测物质能否抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的编码基因的转录，如所述待测物质能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的编码基因的转录，则所述待测物质为候选的所述植物稻瘟菌杀菌剂；如所述待测物质不能抑制所述稻瘟菌中序列表序列3所示蛋白质的编码基因的转录，则所述待测物质为非候选的所述植物稻瘟菌杀菌剂。

6.具有如下1)-4)中至少一种功能的物质在制备植物稻瘟菌(Magnaportheoryzae)杀菌剂中的应用：

1)抑制序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质的表达；

7.具有如下5)-8)中至少一种功能的物质在制备植物稻瘟菌(Magnaportheoryzae)杀菌剂中的应用：

8)降低将序列表序列3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加且、具有调控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生功能的蛋白质的编码基因的转录水平。

8.具有如下功能的物质在制备植物稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)杀菌剂中的应用：使序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质失活或使将序列表序列3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加、且具有调控稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分生孢子产生功能的蛋白质失活。

9.敲除载体、重组稻瘟菌或应用，所述敲除载体为敲除稻瘟菌(Magnaportheoryzae)中序列表序列3所示蛋白质编码基因的重组载体；所述重组稻瘟菌为将稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所示蛋白质编码基因敲除得到的重组菌；所述应用为所述敲除载体在敲除稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)中序列表序列3所示蛋白质编码基因中的应用。

10.DNA分子或应用，所述DNA分子的核苷酸序列是序列表序列1中的第1位至第1990位的核苷酸序列；所述应用为所述DNA分子在作为启动子中的应用。