CN104894156A - 大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的用途。将大丽轮枝菌野生型菌株V592菌株中的VdpdaA3基因敲除后获得的VdpdaA3基因敲除突变体产孢量明显低于大丽轮枝菌野生型菌株V592菌株，表明VdpdaA3基因参与了分生孢子的形成。本发明首次鉴定了与大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3及其基因，为进一步阐明大丽轮枝菌的致病机理提供基础，将野生型大丽轮枝菌的VdpdaA3基因敲除得到的大丽轮枝菌突变体为大丽轮枝菌与宿主的互作机理研究提供了病原菌资源，本发明对棉花黄萎病的防治及培育抗大丽轮枝菌的棉花新品种具有重要的应用价值。

Description

大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域中大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的用途。

背景技术

棉花黄萎病是一种土传的维管束系统病害，是由大丽轮枝菌引起的，其对棉花的生产造成了严重的危害。自1935年，棉花黄萎病随着棉花种子的引进而传入我国，随后便开始逐渐蔓延全国。尤其从20世纪90年代以后，棉花黄萎病在我国扩展蔓延极为迅速，其中1993年棉花黄萎病最为严重，发病面积达266.67万hm²，随后在1995、1996、1999、2000、2002、2003年全国范围内连续爆发，损失十分严重，棉花黄萎病已对我国棉花生产以及可持续发展构成极大威胁。

棉花黄萎病是由半知菌亚门(Deutermycotina)淡色菌科(Mmonilaceae)轮枝菌属(Verticillium)真菌引起，属内有若干个种，其中危害棉花的有大丽轮枝菌(V.dahliae)和黑白轮枝菌(V.albo-atum)两个种。我国棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌引起的。大丽轮枝菌没有寄主专化性，可以危害多种植物，从一年生的草本植物到多年生的木本植物。大丽轮枝菌可以形成一种叫做黑色微菌核的休眠结构，可以在缺乏寄主的土壤中存活长达数年。

大丽轮枝菌主要以微菌核的形式越冬，微菌核作为其最主要的初侵染来源，在受到植物根部分泌物的刺激时便会萌发。菌丝一般从植物根部侵入，随着植物的蒸腾作用向植物的茎叶中扩展、定植，最终侵染整个植株。一般被大丽轮枝菌侵染过的植株都会表现出萎蔫，干枯，叶脉失色，坏死等症状，维管束变褐是黄萎病最典型的症状。

田黎等的研究认为棉花黄萎病的发生发展与土壤中微菌核的数量密切相关。大丽轮枝菌微菌核的多少通常与其致病力和抗逆性相关。有研究显示，当土壤里棉花黄萎菌微菌核达到0.03个/g土时，就会导致棉花出现萎蔫症状，当土壤中微菌核含量达到0.3个/g土～1.0个/g土时，就会有20％～50％的棉花植株发病，当土壤中微菌核含量达到3.5个/g土以上，棉花植株都会发病。另有研究表明，当土壤中微菌核含量达到0.5个/g土为引起棉花发病的临界值。在田里面，当黄萎菌侵染莴苣后，土壤中的微菌核数量为至少50个/g土，而病害很重的田块，微菌核数目高达2400个/g土。

棉花是目前世界上种植面积最大的工业原料作物，在我国是仅次于粮食的第二大农作物。棉花黄萎病是目前我国棉花生产过程中最具毁灭性的真菌病害。由于至今尚未研制出效果显著的防治药剂和抗病品种，被称为棉花的“癌症”，因此如何控制黄萎病的猖獗危害，已成为棉花生产可持续发展的关键问题。在这种情况下，研究大丽轮枝菌的致病机理，了解大丽轮枝菌与寄主的互作机理就显得更为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3或其基因。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌的方法。

本发明所提供的一种制备分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌的方法，是抑制目的大丽轮枝菌中大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的基因的表达，得到分生孢子产量低于所述目的大丽轮枝菌的重组大丽轮枝菌；

所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3为a)或b)：

a)氨基酸序列是SEQ ID No.1所示的蛋白质；

b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3活性的由a)衍生的蛋白质。

其中，SEQ ID No.1由312个氨基酸残基组成。

上述b)中所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述b)中所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述b)中所述蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到的。

上述方法中，所述分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌的分生孢子产量低于所述目的大丽轮枝菌；所述目的大丽轮枝菌为含有所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的基因的大丽轮枝菌，如大丽轮枝菌野生型菌株V592。

上述方法中，所述抑制目的大丽轮枝菌中所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的基因的表达是通过将所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的基因敲除的方式实现的。

上述方法中，所述基因敲除可通过同源重组实现。

本发明提供的利用所述制备分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌的方法获得的分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌也属于本发明保护的范围。

本发明所提供的抑制所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3表达的物质、抑制所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的基因表达的物质或降低所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3活性的物质在培育抗大丽轮枝菌植物中的应用也属于本发明保护的范围。

上述应用中，所述抗大丽轮枝菌植物可为转基因植物。

上述应用中，所述植物可为大丽轮枝菌的寄主；所述大丽轮枝菌的寄主可为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物可为棉花、番茄、向日葵、黄瓜等；所述单子叶植物可为水稻、玉米、高粱、麦类、谷子等；所述大丽轮枝菌的寄主具体可为棉花。

本发明所提供的抑制所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3表达的物质、抑制所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的基因表达的物质或降低所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3活性的物质在制备大丽轮枝菌抑制剂中的应用也属于本发明保护的范围。

上述应用中，所述大丽轮枝菌抑制剂可通过所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3或所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的基因为靶点进行筛选。

上文中，所述抑制大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的基因表达的物质可为干扰大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的基因表达的物质，如microRNA、VdpdaA3的基因的反义基因表达的RNA。

本发明还提供了所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3，或所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3相关的生物材料在调控大丽轮枝菌分生孢子产量中的应用；

所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3相关的生物材料为下述A1)至A20)中的任一种：

A1)核酸分子；所述核酸分子为编码大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；

A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；

A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；

A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；

A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；

A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；

A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；

A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。

上述应用中，所述调控大丽轮枝菌分生孢子产量可为降低大丽轮枝菌分生孢子产量。

上述应用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

所述核酸分子为如下1)-5)中任一所示的基因：

1)其编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；

2)序列是SEQ ID No.3的cDNA分子或DNA分子；

3)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的cDNA分子或基因组DNA分子；

4)与2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的cDNA分子或基因组DNA分子；

5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的cDNA分子或基因组DNA分子。

上述用于编码所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的核酸分子，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的核酸分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的核酸分子的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且编码所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.2的第1-939位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。与本发明的SEQ ID No.3的第1-1205位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

其中，SEQ ID No.2由939个核苷酸组成，其编码序列是第1-939位，编码SEQ ID No.1所示的蛋白质。

上述与所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3相关的生物材料中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达相应蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动相关基因转录的启动子，还可包括终止相关基因转录的终止子，如A2)所述的含有编码所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3的DNA。

上述与所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3相关的生物材料中，A5)-A8)中任一所述重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。A9)-A12)中任一所述的转基因细胞系，A13)-A16)中任一所述的转基因植物组织，A17)-A20)中任一所述的转基因植物器官均不包括植物的繁殖材料。

实验证明，将大丽轮枝菌野生型菌株V592菌株中的VdpdaA3基因敲除后获得的VdpdaA3基因敲除突变体产孢量明显低于大丽轮枝菌野生型菌株V592菌株，表明VdpdaA3基因与分生孢子产量相关，VdpdaA3基因参与了分生孢子的形成。在实际应用中，可以在目的植物(如棉花)中表达干扰VdpdaA3基因表达的物质(如microRNA、VdpdaA3基因的反义基因表达的RNA)提高目的植物对大丽轮枝菌的抗性，具体可以将干扰VdpdaA3基因表达的DNA(如VdpdaA3基因的反义基因)导入受体植物中得到对大丽轮枝菌抗性提高的转基因植物。在实际应用中，也可以以大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3或其基因为靶点筛选防治大丽轮枝菌的药物。本发明首次鉴定了与大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA3及其基因，为进一步阐明大丽轮枝菌的致病机理提供基础，将野生型大丽轮枝菌的VdpdaA3基因敲除得到的大丽轮枝菌突变体为大丽轮枝菌与宿主的互作机理研究提供了病原菌资源，本发明对棉花黄萎病的防治及培育抗大丽轮枝菌的棉花新品种具有重要的应用价值。

附图说明

图1为pRF-HU2载体结构示意图。

图2为重组载体pRF-HU2-PDA3的构建流程图。

图3为敲除载体的构建策略图。

图4为大丽轮枝菌VdpdaA3敲除突变体的表型及Southern杂交验证结果。其中，A为大丽轮枝菌VdpdaA3敲除突变体的表型；B为大丽轮枝菌VdpdaA3敲除突变体的Southern杂交验证图谱：泳道1为大丽轮枝菌野生型菌株V592，泳道2和3分别为大丽轮枝菌VdpdaA3敲除突变体△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b。

图5为VdpdaA3基因在大丽轮枝菌野生型菌株V592的菌核、菌丝和分生孢子中的转录水平。其中，1为分生孢子，2为菌丝，3为菌核。

图6为大丽轮枝菌VdpdaA3敲除突变体的生物学性状。其中，图A为表型结果；图B为分生孢子产量的测定结果；图C为菌丝形态结果；WT和V592均为大丽轮枝菌野生型菌株V592，△VdpdaA3为敲除突变体△VdpdaA3-a，EC3为敲除突变体△VdpdaA3的互补转化子。

图7为敲除突变体△VdpdaA3分生孢子的萌发。WT为大丽轮枝菌野生型菌株V592，△VdpdaA3为敲除突变体△VdpdaA3-a。

图8为以PDA3-s和PDA3-x为引物对对V592菌株的基因组DNA进行PCR扩增得到的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道M为marker2000；泳道1-4均为VdpdaA3基因全长的PCR扩增产物。

图9为载体pSULPH-mut-RG#PB的结构示意图。

图10为互补转化子的表型。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的棉花黄萎病菌株大丽轮枝菌(V.dahliae)野生型菌株V592(彭姗，吕学莲，高峰等.一种新的棉花黄、枯萎病快速接种方法的研究[J].棉花学报，2008，20(3):174～178.)公众可从石河子大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的载体pRF-HU2(Ronnie de Jonge，H.Peter van Esse，KarunakaranMaruthachalam，et al.Tomato immune receptor Ve1recognizes effector ofmultiple fungal pathogens uncovered by genome and RNA sequencing[J].PNAS,2012,4(27):5110～5115.)公众可从石河子大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。该载体上有任何真菌生物基因组中没有的两个酶切位点PacI和Nt.BbvCI，还含有真菌选择性标记—潮霉素标记和细菌选择性标记—卡那霉素(Kan)标记，该载体的示意图如图1所示。

下述实施例中的根癌农杆菌EHA105(Feng Gao，Bang-Jun Zhou，Guo-Ying Li，et al.A Glutamic Acid-Rich Protein Identified in Verticillium dahliae froman Insertional Mutagenesis Affects icrosclerotial Formation andPathogenicity[J].PLos One,2010,12(5)：e15319)公众可从石河子大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中棉花为棉花品种108夫(Gossypium hirsutum L.)(彭姗，吕学莲，高峰等.一种新的棉花黄、枯萎病快速接种方法的研究[J].棉花学报，2008，20(3):174～178.)公众可从石河子大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的USER enzyme mix为NEB公司产品。

下述实施例中的相关抗生素溶液的配制如下：

潮霉素(Hyg，罗氏公司)工作浓度100μg/mL，头孢霉素(Cef)工作浓度为300μg/mL，卡那霉素(Kan)工作浓度为50μg/mL，利福平(Rif)工作浓度为10μg/mL；

乙酰丁香酮(AS，10mM)：称取19.62mg乙酰丁香酮，用10mL蒸馏水溶解，采用浓度为5M的KOH溶液调节pH至8，过滤灭菌后-20℃保存。

2-N-玛琳乙磺酸(MES，1M)：称取19.52g MES，用80mL蒸馏水溶解，采用浓度为5M的KOH溶液调节pH至5.3，然后定容至100mL并用过滤器过滤灭菌，-20℃保存。

10％(v/v)的甘油：10mL纯甘油，90mL蒸馏水，混匀。

20％(v/v)的甘油：20mL纯甘油，80mL蒸馏水，混匀。

50mM的L-天冬酰胺：将6.6g L-天冬酰胺溶解到1L蒸馏水中，过滤灭菌。

200×Trace solution for Vogels salts:5g柠檬酸，5gZnSO₄·7H₂O，1g Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O，0.25g CuSO₄·5H₂O，0.05g MgSO₄·H₂O，0.05g H₃BO₃，0.05g Na₂Mo O₄·2H₂O，1000mL蒸馏水，过滤灭菌。

50×Vogels salts：125g C₆H₉Na₃O₉，250g KH₂PO₄，9.3g MgSO₄·6H₂O，5g CaCl₂·2H₂O，5mL 200×Trace solution，定容至1000mL，过滤灭菌。

1000×Trace elements for DFM medium：40mg Na₂B₄O₇·10H₂O，400mg CuSO₄·5H₂O，1.2g FeSO₄·7H₂O，700mg MnSO₄·H₂O，800mg Na₂MoO₄·2H₂O，10g ZnSO ₄·7H₂O，1000mL蒸馏水，过滤灭菌。

2.5×Salt solution：3.625g KH₂PO₄，5.125g K₂HPO₄，0.375g NaCl，1.160gMgSO₄·6H₂O，0.165g CaCl₂·2H₂O，0.0062g FeSO₄·7H₂O，1.250g(NH₄)₂SO₄，1000mL蒸馏水，过滤灭菌。每种组分需称取一个溶解一个避免形成不溶物。

RA培养基：50g丁二酸钠(C₄H₄O₄Na₂·6H₂O)，12.1g NaNO₃，20mL 50×Vogels salts(–N,–C)，950mL蒸馏水，高压灭菌，在用之前加上50mL灭过菌的浓度为20g/100mL的葡萄糖水溶液。

水琼脂IMAS培养基：将6g琼脂粉和146mL蒸馏水混合，高压灭菌保存。用的时候微波炉融化后加入IMAS培养基的其它成分。

IMAS固体培养基：将120.0mL 2.5×Salt solution(60℃预热),7mL浓度为20g/100mL的葡萄糖水溶液，7.5mL 20％(v/v)的甘油和146mL水琼脂IMAS培养基混合，使得混合液中琼脂粉的最终浓度2g/100mL。待混合液冷却至55℃时，再加入12.0mL MES(浓度为1M)，6.0mL乙酰丁香酮(浓度为10mM)。

IMAS液体培养基：120.0mL 2.5×Salt solution(60℃预热),7mL浓度为20g/100mL的葡萄糖水溶液，7.5mL 20％(v/v)的甘油,12.0mL MES(浓度为1M)，6.0mL乙酰丁香酮(浓度为10mM)。

水琼脂DFM培养基：将10g琼脂粉和358mL蒸馏水混合，高压灭菌保存。用的时候微波炉融化后加入DFM培养基的其它成分。

DFM固体培养基：将31.25mL浓度为20g/100mL的葡萄糖水溶液，100.0mL浓度为50mM的L-天冬酰胺(60℃预热)，5.0mL浓度为210mM的MgSO₄，5.0mL溶液A(溶液A的pH值为6，由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：1.12M的KH₂PO₄和0.7M的KCL)，0.5mL 1000×Trace elements和358mL的水琼脂DFM培养基混合，使得混合液中琼脂的终浓度为2g/100mL。待混合液冷却到55℃加入所要求的抗生素。

1％(w/v)水琼脂培养基:将1g的琼脂粉和99mL的蒸馏水混匀，高压灭菌保存。

查氏液体培养基：2g NaNO₃，1g K₂HPO₄，0.5g KCl，0.5g MgSO₄·7H₂O，0.01g FeSO₄·7H₂O，30g蔗糖，蒸馏水定容至1000mL；高压灭菌。

表1、引物序列(下划线代表酶切位点)

引物	序列(5’→3’)
		PDA3up-s	GGTCTTAAUGTTGAAAATCCCCACGCAATAGG
PDA3up-x	GGCATTAAUTAATTCTGGAAGATGCGGGGG
		PDA3down-s	GGACTTAAUTTAGTCCCGCGCCTGGTATTA
PDA3down-x	GGGTTTAAUGTAGGAGGCTGTGACGATTCC
		PDA3-s	ACGCGTCGACATGGGCAAGAAACGTGTCTTGGT
PDA3-x	GGACTAGTTTATAGCGTTGTAGACTCTTTCATG
		PDA3-qs	GCCGATTACGGGATTG
PDA3-qx	CTCGCTGGCTTTCTTT
		PDA3-ts	AGAAGATTCACCGAACGATATTAGCAG
PDA3-tx	GTCTTTGATGAACATCATTGGTGGGA
		β-tubline-f	TCACCAGCCGTGGCAAGGTTG
β-tubline-r	AGCAAAGGGCGGTCTGGACGTTG

实施例1、大丽轮枝菌VdpdaA3敲除突变体的制备

一、重组农杆菌pRF-HU2::PDA3的制备

以棉花黄萎病菌株大丽轮枝菌(V.dahliae)野生型菌株V592(简称V592菌株)的基因组DNA为模板，以PDA3up-s和PDA3up-x为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，将其命名为VdpdaA3基因左同源臂片段；

以V592菌株的基因组DNA为模板，以PDA3down-s和PDA3down-x为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，将其命名为VdpdaA3基因右同源臂片段。

采用PacI和Nt.BbvCI限制性内切酶双酶切pRF-HU2载体(图1)得到pRF-HU2载体的两个线性化片段。

将VdpdaA3基因左同源臂片段、VdpdaA3基因右同源臂片段与获得的pRF-HU2载体的两个线性化片段进行连接，连接体系如表2所示，在37℃孵育20min，然后在25℃孵育20min，即获得重组载体，命名为重组载体pRF-HU2-PDA3(图2)。将重组载体pRF-HU2-PDA3进行测序，结果正确，表明VdpdaA3基因左同源臂片段和VdpdaA3基因右同源臂片段分别插入到了pRF-HU2载体的。pRF-HU2-PDA3中的VdpdaA3基因左同源臂片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，VdpdaA3基因右同源臂片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

将重组载体pRF-HU2-PDA3转化入根癌农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌，将其命名为重组农杆菌pRF-HU2::PDA3。

表2、USER克隆体系

二、大丽轮枝菌VdpdaA3敲除突变体的制备

1、大丽轮枝菌分生孢子的获得

将培养好的V592菌株打菌饼若干，并接种于含有250mL RA培养基的1L三角瓶中，在26℃、200rpm的水平摇床上摇培5d，获得V592菌株的培养物。用灭过菌的微孔滤布过滤V592菌株的培养物至无菌的50mL离心管中，然后将过滤物在14000g、4℃条件下离心40min，弃上清，收集菌体沉淀。用10mL ddH₂0重新悬浮菌体沉淀，然后在14000g、4℃条件下再离心40min，弃上清，收集菌体沉淀；用5mL ddH₂0重新悬浮菌体沉淀，得到V592菌株的分生孢子悬浮液。使用光学显微镜和血球计数板测定V592菌株的分生孢子悬浮液中的分生孢子浓度，然后将V592菌株的分生孢子悬浮液在14000g、8℃条件下离心30min后，收集分生孢子沉淀，用10％(v/v)的甘油重新悬浮沉淀的分生孢子，最终得到的分生孢子浓度为1×10⁸cfu/mL的分生孢子悬浮液。将分生孢子悬浮液以每份1mL置于-80℃保存，可保存1年，待用时用IMAS液体培养基将分生孢子浓度调至1×10⁷cfu/mL。

2、重组农杆菌的培养

将步骤一制备的重组农杆菌pRF-HU2::PDA3的单菌落接种于50mL三角瓶中，装有10mL含有浓度为50μg/mL Kan(卡那霉素)和浓度为10μg/mL Rif(利福平)的LB液体培养基，在28℃、100rpm条件下培养1-2d，得到重组农杆菌pRF-HU2::PDA3的种子液；将100μL重组农杆菌pRF-HU2::PDA3的种子液接种于50mL锥形瓶中，装有10mL含有浓度为50μg/mL Kan的IMAS液体培养基，在28℃、100rpm条件下摇培至OD₆₀₀达到0.5-0.7(一般到第二天即可)，得到重组农杆菌pRF-HU2::PDA3菌液。

3、将步骤2获得的重组农杆菌pRF-HU2::PDA3菌液与步骤1的分生孢子浓度为1×10⁷cfu/mL的分生孢子悬浮液等体积混合均匀，得到混合液。吸取200μL混合液并使用涂布器将其均匀的涂布于铺有NC膜的IMAS固体培养基上，然后在26℃暗培养36小时。培养结束后在无菌条件下将NC膜从IMAS固体培养基上转移到DFM(潮霉素浓度为150mg/mL，头孢霉素浓度为300mg/mL)固体培养基上培养6-8d，待长出转化子后再将转化子转移至PDA(潮霉素浓度为150mg/mL，头孢霉素浓度为300mg/mL)培养基中继续培养，其构建策略如图3。挑选2个转化子分别命名为△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b，其表型如图4中A所示。△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b是将V592菌株中的大丽轮枝菌致病性相关蛋白VdpdaA3的基因(简称VdpdaA3基因)敲除得到的重组大丽轮枝菌。大丽轮枝菌致病性相关蛋白VdpdaA3的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，大丽轮枝菌致病性相关蛋白VdpdaA3的基因组基因如SEQ ID No.3所示，大丽轮枝菌致病性相关蛋白VdpdaA3的cDNA基因如SEQ ID No.2所示。

三、大丽轮枝菌VdpdaA3敲除突变体的验证

以V592菌株的基因组DNA为模板，以PDA3-ts和PDA3-tx为引物进行PCR扩增，获得V592菌株的PCR产物，将V592菌株的PCR产物(SEQ ID NO.3中的第86位至687位所示的核苷酸序列)作为探针DNA，参照Riboprobe Systtem-SP6探针标记试剂盒(为Promega产品，产品目录号为P1420)的说明书，使用α-[³²P]dCTP进行探针DNA的标记。分别提取步骤二得到的转化子(△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b)的基因组DNA，以PDA3-ts和PDA3-tx为引物，进行Southern杂交验证，检测转化子中的VdpdaA3基因是否被敲除。

图4中B的结果表明，V592菌株中可杂交得到一条明亮的条带，即VdpdaA3基因的目的片段，而两个敲除突变体△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b中在相应的位置没有杂交出相应的条带，此结果说明敲除突变体△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b中的VdpdaA3基因已经被敲除。

四、VdpdaA3基因在V592菌株中的表达分析

分别提取V592菌株的菌核、菌丝和分生孢子的RNA，并反转录为cDNA，分别以cDNA为模板，以PDA3-qs和PDA3-qx为引物，进行荧光定量qRT-PCR。以β-tubline基因(DQ266153)作为内参基因，β-tubline-f和β-tubline-r作为引物。

图5中结果表明，VdpdaA3基因在V592分生孢子的菌丝中的转录水平明显高于在菌丝和菌核中的转录水平，在菌丝中的转录水平最低，表明VdpdaA3基因在V592菌株中的表达具有组织特异性。

五、大丽轮枝菌VdpdaA3敲除突变体的生物学性状

首先将步骤二获得的大丽轮枝菌VdpdaA3敲除突变体△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b分别移植到普通PDA培养基上，在26℃培养10d，然后分别对各菌株进行下述生物学特性的观察和测定，以V592菌株为对照。

1、培养性状观察

用打孔器在菌株菌落边缘打取直径为1cm的菌饼，将菌饼接种于PDA培养基平板中央，在26℃暗培养10d，根据突变菌株的菌落形态和黑色微菌核的多少等特征对突变菌株进行表型类型分类，分类标准参考文献：彭姗，吕学莲，高峰等.一种新的棉花黄、枯萎病快速接种方法的研究[J].棉花学报，2008，20(3):174～178。结果如图6中A，表明敲除突变体△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b在PDA培养基上的表型均为菌核型，在培养基的正面和背面都产生黑色的微菌核，与V592菌株没有明显的差异。

2、菌落生长速度测定

用打孔器在菌株菌落边缘打取直径为1cm的菌饼，将菌饼接种于PDA培养基平板中央，26℃暗培养，用十字交叉法测量各菌株的菌落直径，从第三天到第九天每天测量一次菌落直径，共测7次，每个菌株设三个重复，每种菌株每次的菌落直径是其三个重复的平均值，菌落生长速度＝(第九天直径-第五天直径)÷4。

菌落生长速度测定结果显示：

A.在普通PDA培养基平板上，V592菌株的生长速度为3.667mm/d，敲除突变体△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b的分别为3.83mm/d、3.82m/d，敲除突变体△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b的菌落生长速度要比野生型菌株的菌落生长速度快。

B.V592菌株在第九天时的菌落直径为37mm，敲除突变体△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b的分别为38mm、39mm，与V592菌株的菌落直径没有明显差异。

3、产孢量测定

用打孔器在菌株菌落边缘打取10个直径为1cm的菌饼，将菌饼接种于装有查氏液体培养基的锥形瓶中，在26℃、200rpm条件下摇培5天，用无菌的微孔滤布过滤培养物至无菌的离心管中，再用250mL超纯水洗锥形瓶并用微孔滤布过滤至新的无菌离心管中，收集分生孢子。将收集的分生孢子在4℃、1200rpm条件下离心30分钟，弃上清，用10mL超纯水重新悬浮沉淀，转移至无菌离心管，在4℃、1200rpm条件下离心30分钟，弃上清，收集沉淀，获得分生孢子。用无菌水将收集的分生孢子浓度调至1×10⁶cfu/mL，然后准确吸取1mL分生孢子悬浮液，接种至装有100mL查氏液体培养基的150mL的三角瓶中，在26℃，200rpm条件下暗培养。在显微镜下用血球计数板测量分生孢子浓度，从第二天到第九天每24h测量1次分生孢子浓度，共测8次，每个菌株设三个重复，每种菌株每次的分生孢子浓度是其三个重复的平均值。

结果表明从第三天开始，敲除突变体△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b的产孢量均明显低于V592菌株(图6中B)，敲除突变体△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b在各个检测时间点的产孢量没有显著差异，这表明VdpdaA3基因与分生孢子产量相关，VdpdaA3基因参与了分生孢子的形成。

4、分生孢子和菌丝形态观察

分生孢子形态观察：收集同一时期相同培养条件下敲除突变体△VdpdaA3-a、△VdpdaA3-b和V592菌株的分生孢子在显微镜下观察，以V592菌株为对照，观察敲除突变体的分生孢子与V592菌株之间的差异。

分生孢子形态观察结果：敲除突变体△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b的分生孢子形态多为椭圆形，大多数里面有油滴，与V592菌株相比没有差异。

菌丝形态观察：采用小室培养的方法(载玻片培养法)，对菌株菌丝的形态进行观察，即用灭菌的牙签在菌株菌落边缘打取直径约为5mm的菌饼，倒置放在无菌的载玻片上，将载玻片置于保湿的培养皿内，26℃暗培养3天，取出载玻片在显微镜下观察敲除突变体的菌丝与V592菌株的菌丝微观结构。

结果表明在保湿的培养皿中培养3天之后，敲除突变体△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b形成的菌丝形态和V592菌株的菌丝形态无明显差异(图6中C)。

5、显微观察敲除突变体分生孢子的萌发情况

将敲除突变体△VdpdaA3-a、△VdpdaA3-b和V592菌株的菌饼分别接种在查氏培养基中，在26℃、200rpm的摇床中培养24h，用无菌的滤布收集分生孢子悬浮液，用移液枪吸取定量的分生孢子悬浮液，在显微镜下观察分生孢子萌发的情况。

结果表明，V592菌株与敲除突变体△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b的分生孢子萌发并没有明显差异(图7)。

实施例2、互补突变体的表型

一、互补载体的构建

1、以V592菌株的基因组DNA为模板，以PDA3-s和PDA3-x为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为VdpdaA3基因(图8)，包含起始密码子ATG和终止密码子TAA，大小为989bp。以水为模板，进行上述实验，作为阴性对照。该PCR产物的核苷酸序列是SEQ ID No.3的第8位-第996位所示的核苷酸序列。

2、使用限制性内切酶SalI和SpeI双酶切步骤1得到的VdpdaA3基因的PCR扩增产物，得到目的基因片段；将目的基因片段插入载体pSULPH-mut-RG#PB(其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示)的SalI和SpeI识别位点间，得到重组载体，将其命名为重组载体VdpdaA3::pSULPH-mut-RG#PB。将重组载体VdpdaA3::pSULPH-mut-RG#PB进行测序，结果表明重组载体VdpdaA3::pSULPH-mut-RG#PB上自5’末端起第12617bp至第13607bp位为VdpdaA3的基因序列(编码SEQ ID No.1所示的VdpdaA3)，该基因位于ToxA启动子和其终止子之间，目的基因片段插入成功。

二、互补突变体的获得及表型鉴定

将步骤一获得重组载体VdpdaA3::pSULPH-mut-RG#PB通过电击法转化导入根癌农杆菌EHA105，获得重组农杆菌pSULPH-mut-RG#PB::PDA3。按照实施例1的方法，将重组农杆菌pSULPH-mut-RG#PB::PDA3与实施例1中的敲除突变体△VdpdaA3-a共培养，得到敲除突变体△VdpdaA3-a的互补转化子(以下简称互补转化子)。将互补转化子和敲除突变体△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b分别在PDA固体培养基上进行培养，进行表型观察。结果如图10所示，与敲除突变体△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b相比，互补转化子的表型和敲除突变体△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b的表型没有明显的差异，都与V592菌株的表型基本一致。

三、产孢量测定

用打孔器在菌株菌落边缘打取10个直径为1cm的菌饼，将菌饼接种于装有查氏液体培养基的锥形瓶中，在26℃、200rpm条件下摇培5天，用无菌的微孔滤布过滤培养物至无菌的离心管中，再用250mL超纯水洗锥形瓶并用微孔滤布过滤至新的无菌离心管中，收集分生孢子。将收集的分生孢子在4℃、1200rpm条件下离心30分钟，弃上清，用10mL超纯水重新悬浮沉淀，转移至无菌离心管，在4℃、1200rpm条件下离心30分钟，弃上清，收集沉淀，获得分生孢子。用无菌水将收集的分生孢子浓度调至1×10⁶cfu/mL，然后准确吸取1mL分生孢子悬浮液，接种至装有100mL查氏液体培养基的150mL的三角瓶中，在26℃，200rpm条件下暗培养。在显微镜下用血球计数板测量分生孢子浓度，从第二天到第九天每24h测量1次分生孢子浓度，共测8次，每个菌株设三个重复，每种菌株每次的分生孢子浓度是其三个重复的平均值。

结果表明从第四天开始，互补转化子的分生孢子产量明显高于敲除突变体△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b(图6中B)，说明VdpdaA3基因与分生孢子产量相关，VdpdaA3基因参与了分生孢子的形成。

Claims (9)

1.一种制备分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌的方法，是抑制目的大丽轮枝菌中VdpdaA3的基因的表达，得到分生孢子产量低于所述目的大丽轮枝菌的重组大丽轮枝菌；

所述VdpdaA3为a)或b)：

a)氨基酸序列是SEQ ID No.1所示的蛋白质；

b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有VdpdaA3活性的由a)衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抑制目的大丽轮枝菌中VdpdaA3的基因的表达是通过将所述VdpdaA3的基因敲除的方式实现的。

3.利用权利要求1或2所述方法获得的分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌。

4.抑制权利要求1所述VdpdaA3表达的物质、抑制权利要求1所述VdpdaA3的基因表达的物质或降低权利要求1所述VdpdaA3活性的物质在培育抗大丽轮枝菌植物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为大丽轮枝菌的寄主。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述大丽轮枝菌的寄主为棉花。

7.抑制权利要求1所述VdpdaA3表达的物质、抑制权利要求1所述VdpdaA3的基因表达的物质或降低权利要求1所述VdpdaA3活性的物质在制备大丽轮枝菌抑制剂中的应用。

8.权利要求1所述VdpdaA3，或权利要求1所述VdpdaA3相关的生物材料在调控大丽轮枝菌分生孢子产量中的应用；

所述VdpdaA3相关的生物材料为下述A1)至A20)中的任一种：

A1)核酸分子；所述核酸分子为编码权利要求1所述VdpdaA3的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；

A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；

A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；

A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；

A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；

A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；

A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；

A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下1)-5)中任一所示的基因：

1)其编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；

2)序列是SEQ ID No.3的cDNA分子或DNA分子；

3)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述VdpdaA3的cDNA分子或基因组DNA分子；

4)与2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述VdpdaA3的cDNA分子或基因组DNA分子；

5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述VdpdaA3的cDNA分子或基因组DNA分子。