CN103266109B

CN103266109B - 水稻抗病基因Xa23的分子标记与应用

Info

Publication number: CN103266109B
Application number: CN201310197351.1A
Authority: CN
Inventors: 赵开军; 王春连; 樊颖伦
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-05-24
Filing date: 2013-05-24
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2033-05-24
Also published as: CN103266109A

Abstract

本发明公开了一种水稻白叶枯病抗性基因Xa23的分子标记，所述分子标记与水稻白叶枯病抗性基因Xa23不仅紧密连锁而且在植株后代与所述抗性基因共分离，因而为筛选抗性水稻品种和分子标记辅助育种提供了一条很好的途径。

Description

水稻抗病基因Xa23的分子标记与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及水稻抗白叶枯病基因分子标记。

背景技术

由黄单胞杆菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)引起的水稻白叶枯病是水稻生产上主要病害之一，严重影响水稻的产量和品质。实践证明，利用水稻品种的抗病性是防治水稻白叶枯病最经济和有效的途径，发掘和利用抗白叶枯新基因一直是研究的热点之一。早期主要从栽培品种入手，后来又从野生资源中挖掘[Brar DS and Khush GS.1997, , Alien introgression in rice. Plant Mol. Biol. 1997,35:35-47； Natraj KP,2012，Identification and fine-mapping of Xa33, a novel gene for resistance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Phytopathology, 2012, 102:222-228]。到目前已报道的水稻抗白叶枯病基因达36个，其中有11个是隐形基因包括：xa5、xa8、xa13、xa15、xa19、 xa20、xa24、xa26b、xa28、xa32和xa34 [Shen C,2011，Genetic analysis and molecular mapping of a novel recessive gene xa34(t) for resistance against Xanthomonas oryzae pv. Oryzae. Theor Appl Genet, 2011, 122:1331–1338],其它为显性基因。在这些抗病基因中大多数已被定位到染色体上，其中有8个已先后被克隆，包括：Xa1 [Yoshimura S,1998，Expression of Xa1, a bacterial blight-resistance gene in rice, is induced by bacterial inoculation. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95:1663-1668]、Xa3/Xa26（同一基因）[Sun XL,2004, a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv oryzae in rice, encodes an LRR receptor kinase-like protein. The Plant Journal, 2004, 37:517-527; Xiang Y,2006, conferring resistance for rice bacterial blight and encoding a receptor kinase-like protein, is the same as Xa26. Theoretical and Applied Genetics, 2006,113:1347–1355]、xa5[Iyer AS, 2004, The rice bacterial blight resistance gene xa5 encodes a novel form of disease resistance. Molecular Plant Microbe Interactions, 2004, 17(12): 1348-1354; Jiang GH, 2006, Testifying the rice bacterial blight resistance gene xa5 by genetic complementation and further analyzing xa5 (Xa5) in comparison with its homolog TFIIAg1. Molecular Genetics and Genomics, 2006, 275: 354–366]、xa13[Chu ZH, 2006, Promoter mutations of an essential gene for pollen development result in disease resistance in rice. Genes Dev, 2006, 20:1250–1255]、Xa21[Song WY,1995]、xa25[Liu QS,2011, A paralog of the MtN3/saliva family recessively confers race-specific resistance to Xanthomonas oryzae in rice. Plant, Cell and Environment, 2011, 34:1958-1969]和Xa27 [Gu KY,2005, R gene expression induced by a type-III effector triggers disease resistance in rice. Nature, 2005, 435,23 June,1122-1125]。定位和克隆的这些抗病基因大多数抗谱狭窄、抗性弱、或为隐性，使其利用受到限制。在生产上被有效利用的只有Xa3、Xa4、Xa7和Xa21等少数几个。由于病原菌致病性的变异，少数抗白叶枯病基因的长期广泛利用总是面临抗性丧失的风险。为了长期控制水稻白叶枯病的危害，必须不断地挖掘新的抗性资源并从中寻找具有育种利用价值的新基因，为培育优良的水稻品种奠定基础。

在本发明人所在实验室前期工作中，从我国普通野生稻中鉴定发掘出一个对国内外白叶枯病鉴别菌系都表现为高抗、完全显性、全生育期抗病的Xa23基因，并已将Xa23基因转育到感病栽培品种金刚30中，育成了近等基因系CBB23（Zhang Q, 2002, Development of Near-Isogenic Line CBB23 with a New Resistance Gene to Bacterial Blight in Rice and Its Application. Chinese J Rice Sci, 2002, 16(3): 206-210）。本发明人通过分子标记将Xa23定位在水稻第11染色体长臂上的RFLP标记69B和EST标记CP02662之间，将Xa23基因框在1.7cM范围内[王春连等, 2006, 利用基因组文库加速Xa23基因定位的染色体步移.中国水稻科学，2006, 4（20）：355-360]。随后，获得了 Xa23基因的克隆（与本申请同一天提交了专利申请，发明名称为：植物抗病蛋白Xa23及其编码基因与应用）为了寻找与Xa23基因更紧密连锁的分子标记，我们拟利用国际水稻基因组计划测序完成的日本晴的基因组序列，开发Xa23基因所在区域的PCR分子标记，为利用Xa23基因的分子标记辅助育种提供依据。

发明内容

对此，本发明人经过大量的研究，获得了与水稻抗白叶枯病基因Xa23共分离的分子标记，因而本发明所要解决的技术问题是：提供一种水稻白叶枯病抗性基因Xa23的分子标记，及其鉴定方法，可以作为Xa23基因的分子标记辅助选择育种的工具。

本发明提供的技术方案是：一种水稻白叶枯病抗性基因Xa23的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO.4 所示。

一种水稻白叶枯病抗性基因Xa23的分子标记的鉴定方法，其特征在于以待测水稻基因组DNA为模板，采用Lj74引物对进行PCR扩增。

Lj74F：5’- AAGCCATTTGATGAGCAACC-3’，

Lj74R：5’-GGATCCATTTCAGCATAACCTT-3’。

本发明还提供一种水稻白叶枯病抗性基因Xa23的分子标记的获得方法，其特征在于对待测水稻基因组DNA为模板，采用Lj74引物对进行PCR扩增获得的基因片段。

进一步的，发明通过测序比较发现，含有Xa23基因的抗性品种，其基因组中含有两个拷贝的SEQ ID NO：6所示序列片段，而非抗性品种的基因中含有仅一个拷贝的SEQ ID NO：6所示序列片段。因而，本发明进一步提供如下技术方案：一种鉴定Xa23基因赋予的白叶枯病抗性水稻品种的方法，即以待测水稻植株或品种的基因组DNA为模板，通过基因扩增技术或杂交技术，如果发现基因组中含有两个拷贝的SEQ ID NO：6所示序列片段，则为抗性植株或品种；如果发现基因组中仅含有一个拷贝的SEQ ID NO：6所示序列片段，则为非抗性植株或品种。

本发明具有以下有益效果：本发明获得的分子标记与水稻白叶枯病抗性基因Xa23不仅紧密连锁而且在植株后代与所述抗性基因共分离，相应的鉴定方法具有很高的可靠性。因而，该分子标记对筛选抗性水稻品种和辅助育种提供了一条很好的途径，既可免除育种群体大量的田间接种鉴定工作，又可对育种材料进行早代选择并对目标基因进行精准的逐代跟踪。

附图说明

图1分子标记Lj74在F2群体中与Xa23基因的连锁分析，其中：1为JG30； 2为CBB23； M为分子量标记，其余为F2群体部分感病株。

图2分子标记Lj46在F2群体中与Xa23基因的连锁分析，其中：1为JG30； 2为CBB23；*为交换单株。

图3分子标记LJ13在F2群体中与Xa23基因的连锁分析，其中：1为JG30； 2为CBB23；*为交换单株。

图4分子标记A83B4在F2群体中与Xa23基因的连锁分析，其中：1-5为F2感病株； 6-22为F2抗病株；23为金刚30； 24为CBB23；*为交换单株。

图5 Xa23基因紧密连锁图谱。

图6分析标记Lj74检测含有不同抗病基因的品种及其代表品种。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1 Lj74分子标记的确定

1 植物材料

感病轮回亲本金刚30（JG30）为母本，携有抗白叶枯病基因Xa23的近等基因系CBB23作为父本。将JG30与CBB23杂交，F₁单株收获。F₁单株种子繁殖成F₂代分离群体，共获得2562个单株，种植在中国农业科学院作物科学研究所网室内，常规水肥管理。

水稻白叶枯病菌系

水稻白叶枯病广致病菌系PXO99（称为P6）引自国际水稻研究所（IRRI），真空保存于–70℃，使用前，在胁本哲氏培养基上复壮，置于28℃培养48h，以无菌水配制接种菌液，浓度调至OD=1.0。

植株抗病接种鉴定

亲本JG30、CBB23及F₂群体植株插秧缓苗后，长至5～6片叶时进行苗期接种鉴定，采用人工剪叶接种法，到分蘖期再接种1次，以保证各植株抗性反应的真实性。接种后2周左右，感病对照品种（JG30）病情趋于稳定时进行调查，用病斑面积占叶片面积的百分率作为抗感反应参数。抗感标准：以20%为抗感界限，>20%为感病，16%～20%为中感，10%～15%为中抗，<10%为抗病。

分子标记引物设计

依据国际水稻基因组计划测序的水稻品种日本晴的序列，寻找Xa23基因的紧密连锁分子标记。根据前期目的基因定位所在染色体区域范围，间隔取出日本晴基因组第11染色体上的3-6KB的DNA片段，通过NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/index.html) ，登陆GenBank，BLASTN，比对与其它染色体或区段的同源性，选取同源性无或较少的区段进行引物设计。同时基于使用的水稻材料JG30和CBB23是籼稻品种，为了使获得的水稻基因组DNA序列与JG30和CBB23的DNA序列同源性更高，对部分序列比对了中国水稻基因组（籼稻9311）数据库（http://rise.genomics.org.cn/rice/index2.jsp）。引物设计采用PRIMER3或SSRIT http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)，产物片段范围在100—1000bp左右，共设计了61对引物，部分引物序列见表1。

表1 部分引物序列及其扩增产物长度

5 基因组DNA提取

对JG30、CBB23及它们的F₂单株，参考McCouch等(McCouch et al,1988)的方法提取叶片总DNA。用分光光度计测定浓度，用于PCR反应的DNA浓度调至100ng·μl^-1左右。

反应及电泳

PCR反应体积20μl，反应液组成为：1×PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 每个引物0.3μM，100ng基因组DNA，1U Taq酶。PCR反应程序为：94℃预变性3min，然后每个循环：94℃变性40s，60℃复性40s，72℃延伸1min，共循环35次，最后72℃保温10min。用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

7 抗性遗传分析

将JG30与CBB23杂交，F₁单株收获，共获得2562个F₂单株。用P6进行接种鉴定，病斑面积占叶片面积的百分率≤10%为抗，≥20%为感。结果表明F₂代单株抗感界限分明，抗病株1930株，感病株632株，严格符合3﹕1抗感分离，可用于Xa23基因的分子标记定位。

亲本多态性筛选

61对引物扩增双亲DNA，琼脂糖凝胶电泳检测到6对标记在亲本间有多态性，其中包括引物Lj74。

2群体单株的分子检测

用61对引物对632株个F₂代感病单株进行分子检测。用Lj74标记扩增632株感株单株，所有单株扩出的DNA带型都与感病轮回亲本金刚30一致，没有CBB23带型，表明F₂感株单株中没有发生染色体交换事件（图1），表明此Lj74标记与Xa23基因共分离。用Lj46检测出3个感病单株出现了双亲带型即杂合带型，表明有3个单株发生了交换（图2）。Lj13引物检测出14个单株具有双亲带型，说明有14个单株发生交换（图3）。A83b4检测出4个感病单株具有双亲带型，说明有4个单株发生交换（图4）。

Xa23基因精细定位并构建其遗传连锁图谱

将筛选出的4个特异PCR标记用Mapmaker3.0软件进行连锁分析，Lj46与Xa23的遗传距离为0.3cM，A83B4、Lj13与Xa23的遗传距离分别为0.4cM、1.3cM，位于基因另一侧，Lj74与Xa23的遗传距离为0cM，说明与基因共分离。将所有与Xa23紧密连锁的标记包括SSR、RAPD、EST、RFLP以及特异PCR标记构建遗传连锁图谱（图5），从而将Xa23框在了0.6cM范围之内，Lj46与A83B4之间的物理距离为53Kb,为下一步克隆Xa23基因及分子标记辅助育种打下了非常好的基础。

实施例2 分子标记的验证

为了进一步验证分子标记Lj74是否只针对Xa23基因的分子标记，因此对含有不同基因的品种及目前推广的部分品种进行了分子检测。

由于引物Lj74是与Xa23基因共分离标记,只有含有Xa23基因的品种才能扩出与CBB23带型一致的DNA片段，不含有Xa23的品种扩出的DNA带型与CBB23带型不一致。因此我们选择了目前已经定位和克隆的含有不同白叶枯病抗性基因品种，共有25个，包括IR24（无抗性基因）、IRBB1（Xa1）、IRBB2（Xa2）、IRBB3（Xa3）、IRBB4（Xa4）、IRBB5（xa5）、IRBB7（Xa7）、IRBB8（xa8）、IRBB10（Xa10）、IRBB11（Xa11）、IRBB13（xa13）、IRBB14（Xa14）、M41（xa15）、Tetep（Xa16）、Asominori（Xa17）、Toyo（Xa18）、XM5（xa19）、XM6（xa20）、IRBB21（Xa21）、中武1号（Xa23）、DV85（xa24）、IRBB27（Xa27）、CBB30I（Xa30）、C4064(Xa32)、C4059(Xa36)，以及部分生产上推广的品种12个，包括IR26、南粳15、三江1号、农垦07、垦监稻，宁粳1号、新黄占（含有Xa23基因）、扬稻2号、吉粳88、日本晴、9311、农院238。

选择JG30（无抗性基因）、IR24（无抗性基因）及CBB23（含有Xa23基因）为对照。扩增结果表明只有含Xa23基因的品种中武1号和新黄占能扩出与CBB23带型一致的DNA片段，其它35个品种扩出的DNA带型与CBB23带型都不一致（图6A、B、C）。因此Lj74引物可作为筛选Xa23基因的分子标记。进一步说明Lj74标记与Xa23基因不仅是紧密连锁而且是共分离标记。

实施例3 分子标记Lj74的测序

为了进一步研究分子标记Lj74是抗性品种和非抗品种之间的序列差异，对实施例子中确定的分子标记Lj74，即用SEQ ID NO：1和2作为引物扩增片段进行了测序，当以抗性品种CBB23扩增的片段序列如SEQ ID NO：3所示，而以抗性品种CBB23扩增的片段序列如SEQ ID NO：4所示。

经过对比文件发现抗性品种具有两个拷贝的如SEQ ID NO：6所示的核苷酸片段即具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列片段，而非抗性品种仅具有一个拷贝的如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列片段。基于该发现，本领域技术人员可以根据该序列设计引物对或探针进行检测（并不局限于本申请提供SEQ ID NO：1和2引物对，其仅仅一个实例而已），因而本发明提供了基于该发现的鉴定Xa23基因赋予的白叶枯病抗性水稻品种的方法，即以待测水稻植株或品种的基因组DNA为模板，通过基因扩增技术或杂交技术，如果发现基因组中含有两个拷贝的SEQ ID NO：6所示序列片段，则为抗性植株或品种；如果发现基因组中仅含有一个拷贝的SEQ ID NO：6所示序列片段，则为非抗性植株或品种。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120>水稻抗病基因Xa23的分子标记与应用

<160> 6

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 1

AAGCCATTTG ATGAGCAACC 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 2

GGATCCATTT CAGCATAACCTT 22

<210> 3

<211> 983

<212> DNA

<400> 3

AAGCCATTTG ATGAGCAACC CTGTAATTTG GTTGAACAAG GTAAATTCAC 50

AAGATAATGA CAGCATGTAT ATTTGCGGAT CAGTTAGTGG AAACTTAAAA 100

AATAGAATAG AATAGACCAA AAAGCTGAGC AACCCTGTAA TTTGGTTGAA 150

CAAGGTAAAT TCACAAGATA ATGACAGCAT GTATATTTGC GGATCAGTTA 200

GTGGAAACTT AAAAAATAGA ATAGAATAGA CCAAAAAGCA TATTGATCTT 250

TTAAATGCTC TAATACTGAC ATAATTATTG CAATACGAGA AGTTAAATAT 300

AGCTGGTTAT GAGGTCTCCA AACAACAGAA GAAATAGGAG GTTTAATTTA 350

CCTTGCTCCA TTCTTCAATG ACACAAGTGA ATATTACATG AGAACAACCT 400

TTTCAAGTTCA TACTGGTGG TGCCAACTTT TCTGTTTGAA AGGCCCTGTA 450

AAGAAAAACA AGCTTAGACA AGCTATCAAT AACGCTGGAG CAATGGTAGA 500

CTTCAATTCA GATTTTAATC TCTTAGAGGA GAAGGCAGTG ACTCAGTTAT 550

TAGGACAACA TGAAACAACT AGTATTGAGA GAGCATGATA CAAGAACTAA 600

TATATGTGAT CTTAACAAAA ATACAGCTTG TTATCAAGAC AAAGGTCTTT 650

GTGACTACAG GGTAGCTCAA GCAGAGGTCC TGGTTGTGAT CCTCATCCAT 700

GCAGAGGTGA AAATGAAAAG CAAAGAAACC CTAGTTTTAA AAGCAAAATA 750

GAAAGGACAA TTTCTTTCTG CTGCTCTTGT AGATCAAAAT TATAGCTTCA 800

TCAAGATTTC ATTGACGTCC TCAACCGTTG ACACATACTC ATCGATCAAG 850

TTCTCAACAT GTACACCATT GCAAGCATTC TCTCTTATCT ATAATAATGG 900

AGTTGGAAAA GTTTACTGCA ATCCATTAGC AAACACCAAA TACAGGATTA 950

GAATATACCT AAAGGTTATG CTGAAATGGA TCC 983

<210> 4

<211> 869

<212> DNA

<400> 4

AAGCCATTTG ATGAGCAACC CTGTAATTTG GTTGAACAAG GTAAATTCAC 50

AAGATAATGA CAGCATGTAT ATTTGCGGAT CAGTTAGTGG AAACTTAAAA 100

AATAGAATAG AATAGACCAA AAAGCATATT GATCTTTTAA ATGCTCTAAT 150

ACTGACATAA TTATTGCAAT ACGAGAAGTT AAATATAGCT GGTTATGAGG 200

TCTCCAAACA ACAGAAGAAA TAGGAGGTTT AATTTACCTT GCTCCATTCT 250

TCAATGACAC AAGTGAATAT TACATGAGAA CAACCTTTTC AAGTTCATAC 300

TGGTGGTGCC AACTTTTCTG TTTGAAAGGC CCTGTAAAGA AAAACAAGCT 350

TAGACAAGCT ATCAATAACG CTGGAGCAAT GGTAGACTTC AATTCAGATT 400

TTAATCTCTT AGAGGAGAAG GCAGTGACTC AGTTATTAGG ACAACATGAA 450

ACAACTAGTA TTGAGAGAGC ATGATACAAG AACTAATATA TGTGATCTTA 500

ACAAAAATAC AGCTTGTTAT CAAGACAAAG GTCTTTGTGA CTACAGGGTA 500

GCTCAAGCAG AGGTCCTGGT TGTGATCCTC ATCCATGCAG AGGTGAAAAT 600

GAAAAGCAAA GAAACCCTAG TTTTAAAAGC AAAATAGAAA GGACAATTTC 650

TTTCTGCTGC TCTTGTAGAT CAAAATTATA GCTTCATCAA GATTTCATTG 700

ACGTCCTCAA CCGTTGACAC ATACTCATCG ATCAAGTTCT CAACATGTAC 750

ACCATTGCAA GCATTCTCTC TTATCTATAA TAATGGAGTT GGAAAAGTTT 800

ACTGCAATCC ATTAGCAAAC ACCAAATACA GGATTAGAAT ATACCTAAAG 850

GTTATGCTGA AATGGATCC 869

<210> 5

<211> 228

<212> DNA

<400> 5

TGAGCAACCC TGTAATTTGG TTGAACAAGG TAAATTCACA AGATAATGAC 50

AGCATGTATA TTTGCGGATC AGTTAGTGGA AACTTAAAAA ATAGAATAGA 100

ATAGACCAAA AAGCTGAGCA ACCCTGTAAT TTGGTTGAAC AAGGTAAATT 150

CACAAGATAA TGACAGCATG TATATTTGCG GATCAGTTAG TGGAAACTTA 200

AAAAATAGAA TAGAATAGAC CAAAAAGC 228

<210> 6

<211> 114

<212> DNA

<400> 6

TGAGCAACCC TGTAATTTGG TTGAACAAGG TAAATTCACA AGATAATGAC 50

AGCATGTATA TTTGCGGATC AGTTAGTGGA AACTTAAAAA ATAGAATAGA 100

ATAGACCAAA AAGC 114

Claims

1.一种水稻白叶枯病抗性基因Xa23的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4 所示。

2.按照权利要求1所述的分子标记的获得方法，其特征在于：所述以具有Xa23基因的水稻基因组DNA为模板，采用如SEQ ID NO. 1和 2所示序列的引物对进行PCR扩增，其所获得的分子标记为SEQ ID NO. 3。

3.按照权利要求1所述的分子标记鉴定抗水稻白叶枯病的抗性水稻的方法，其特征在于：以待测水稻植株或品种的基因组DNA为模板，采用如SEQ ID NO. 1和 2所示序列的引物对进行PCR扩增，其中具有983bp条带的为抗性植株或品种，所述抗性水稻具有Xa23基因。

4. 权利要求1所述的分子标记在培育水稻抗白叶枯病抗性品种的辅助育种中的应用。

5.一种用于获得如权利要求1所述的分子标记的引物对，其特征在于：如SEQ ID NO. 1和 2所示序列的引物对，其中所述分子标记为SEQ ID NO. 3。

6.一种鉴定Xa23基因赋予的白叶枯病抗性水稻植物或品种的方法，其特征在于：

以待测水稻植株或品种的基因组DNA为模板，通过基因扩增技术或杂交技术，如果发现基因组中含有两个拷贝的SEQ ID NO：6所示序列片段，则为抗性植株或品种；如果发现基因组中仅含有一个拷贝的SEQ ID NO：6所示序列片段，则为非抗性植株或品种；

其中，所采用的引物是如SEQ ID NO. 1和 2所示序列的引物对；并且，如果扩增片段包括了两个拷贝的SEQ ID NO：6所示序列片段因而具有983bp条带的为抗性植株或品种；如果扩增片段包括仅一个拷贝的SEQ ID NO：6所示序列片段因而具有869bp条带的为非抗性植株或品种。

7. 按照权利要求6所述的方法在培育水稻抗白叶枯病抗性品种的辅助育种中的应用。