CN110272915B

CN110272915B - 一种通过基因编辑技术培育抗白叶枯病水稻的方法

Info

Publication number: CN110272915B
Application number: CN201811511143.3A
Authority: CN
Inventors: 赵开军; 卫正; 王春连; 高英; 纪志远
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-12-11
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2038-12-11
Also published as: CN110272915A

Abstract

本发明公开一种通过基因编辑培育抗白叶枯病水稻的方法。其是利用CRISPR/Cas9等基因编辑技术，将抗白叶枯病基因Xa23启动子的EBE _AvrXa23序列引入水稻xa23位点的上游启动子区，使xa23获得白叶枯病菌诱导表达的能力，从而提高水稻的白叶枯病抗性。所述xa23位点是Xa23的等位基因，其含有Xa23编码区但因其启动子区缺乏EBE _AvrXa23序列而不能转录表达。所述方法可以广泛应用于水稻抗病育种，对水稻遗传育种和生产具有重大应用前景。

Description

一种通过基因编辑技术培育抗白叶枯病水稻的方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及基因编辑技术提高水稻对白叶枯病抗性水稻的方法。

背景技术

水稻是我国最重要的粮食作物，约60％的人口以稻米为主食,水稻生产的可持续发展直接关系到我国的粮食安全。水稻白叶枯病(Bacterial blight,BB)是世界水稻生产中的主要病害之一,最早于1884年在日本福冈地区发现，从50年代开始,发病范围不断扩大,目前白叶枯病的发生范围已遍及世界各水稻产区(Mew T W.Current status andfuture prospects of research on bacterial blight of rice[J].Annu RevPhytopathol,1987,25:359-382；Ou S H.Rice disease,Commonwealth AgriculturalBereaux[M],England,1985,380pp.)。水稻白叶枯病在亚洲尤其严重，在我国，从南到北，除新疆外的各稻区都有分布。

水稻白叶枯病是由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae，Xoo)引起的一种维管束病害，感病后一般可造成水稻减产20％～30％，严重时甚至绝收。由于病原菌通过伤口或水孔侵入维管束产生危害，用药剂防治效果不佳，不仅费钱、费工且污染环境。实践证明，种植抗病品种是防治水稻白叶枯病最为经济和有效的方法。所以自20世纪60年代，发掘和利用抗白叶枯新基因一直是国内外研究的热点之一。目前已报道的水稻抗白叶枯病基因达42个，在这些抗病基因中大多数已被定位到染色体上，其中有11个已先后被克隆，包括：Xa1(Yoshimura S,Yamanouchi U,Katayose Y,etal.Expression of Xa1,a bacterial blight-resistance gene in rice,is induced bybacterial inoculation[J].Proc Natl Acad Sci.1998,95:1663-1668)、Xa3/Xa26(同一基因)(Sun X,Cao Y,Yang Z,et al.Xa26,a gene conferring resistance toXanthomonas oryzae pv oryzae in rice,encodes an LRR receptor kinase-likeprotein[J].The Plant Journal,2004,37:517-527；Xiang Y,Cao Y,Xu C,et al.Xa3,conferring resistance for rice bacterial blight and encoding a receptorkinase-like protein,is the same as Xa26[J].Theoretical and Applied Genetics,2006,113:1347–1355.)、Xa4(Hu K,Cao J,Zhang J.et al,Improvement of multipleagronomic traits by a disease resistance gene via cell wall reinforcement[J].Nat.Plants,2017,3,17009)、xa5(Iyer A S,McCouch S R.The rice bacterial blightresistance gene xa5 encodes a novel form of disease resistance[J].MolecularPlant Microbe Interactions,2004,17(12):1348-1354；Jiang G H,Xia Z H,Zhou Y L,et al.Testifying the rice bacterial blight resistance gene xa5by geneticcomplementation and further analyzing xa5(Xa5)in comparison with its homologTFIIAg1[J].Molecular Genetics and Genomics,2006,275:354–366.)、Xa10(Tian D,Wang J,Zeng X,et al.The rice TAL effector-dependent resistance proteinXA10triggers cell death and calcium depletion in the endoplasmic reticulum[J].Plant Cell,2014,26,497–515)、xa13(Chu Z,Fu B,Yang H,et al.Promotermutations of an essential gene for pollen development result in diseaseresistance in rice[J].Genes Dev,2006,20:1250–1255)、Xa21(Song W,Wang G,Chen L,et al.A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistancegene,Xa21[J].Science,1995,270:1804-1806)、Xa23(Wang C L,Zhang X P,Fan Y L,etal.XA23is an executor R protein and confers broad-spectrum disease resistancein rice[J].Mol.Plant,2015,8,290–302)、xa25(Liu Q S,Yuan M,Zhou Y,et al.Aparalog of the MtN3/saliva family recessively confers race-specificresistance to Xanthomonas oryzae in rice[J].Plant Cell and Environment,2011,34:1958-1969)、Xa27(Gu K，Yang B，Tian D,et al.R gene expression induced by atype-III effector triggers disease resistance in rice[J].Nature,2005,435,23June,1122-1125)和xa41(Hutin M,Sabot F,Ghesquiere A,et al.knowledge-basedmolecular screen uncovers a broad-spectrum OsSWEET14 resistance allele tobacterial blight from wild rice[J].Plant J.2015,84,694–703)。在上述这些抗病基因中，它们大多数抗谱狭窄、抗性持久性差或为隐性基因，在生产上不便利用。目前被有效利用的只有Xa3、Xa4、Xa7、Xa21和Xa23等少数几个。由于病原菌致病性的不断变异，已出现能克服Xa3、Xa4、Xa7和Xa21抗白叶枯病基因的菌株。目前只有Xa23表现出对所有测试菌株广谱高抗的特性，而且Xa23基因介导的抗性具有完全显性、全生育期抗病的特点，因此对水稻特别是杂交稻的遗传改良，包括分子标记辅助育种和转基因工程育种都具有十分广阔的应用前景。Xa23基因抗病的原理具有特殊性：Xa23基因正常情况下不表达，但具有一个启动子陷阱，当白叶枯病菌侵染含Xa23基因水稻时，病原菌的效应子蛋白AvrXa23(赵开军等，中国发明专利ZL 201010256332.8：激发水稻产生抗病反应的avrXa23蛋白及其编码基因，2013年5月17日)特异性激活Xa23基因的表达，而其编码蛋白Xa23就导致水稻细胞发生程序性死亡(PCD)或过敏性坏死(HR)，限制病菌在植物组织内的繁殖和扩散，从而达到抗病目的。因此，Xa23是育种家公认的目前最好用的广谱抗白叶枯病基因(Wang C L,Qin T F,YuH M,et al.The broad bacterial blight resistance of rice line CBB23istriggered by a novel transcription activator-like(TAL)effector of Xanthomonasoryzae pv.oryzae[J].Mol.Plant Pathol.2014,15,333–341；赵开军等，中国发明专利ZL201310198366.X:植物抗病蛋白Xa23及其编码基因与应用，2015年5月8日)。Xa23基因来源于个别野生稻种，在栽培稻中并不存在。但是大多数栽培稻品种中含有Xa23基因的隐性等位基因xa23(Cui H,Wang C L,Qin T F,et al.Promoter variants of Xa23allelesaffect bacterial blight resistance and evolutionary pattern[J].PLoS ONE.2017,12(10):e0185925.)。

基因组编辑技术是指可以在基因组水平上对DNA序列进行定点改造的遗传操作技术，其在基因功能研究和改造、生物医学和植物遗传改良等方面都具有重大的应用价值(Voytas D F.Plant genome engineering with sequence-specific nucleases[J].Annual Review of Plant Biology,2013,64(1):327-350.；Stottmann R W,Go D.Theimpact of CRISPR/Cas9-based genomic engineering on biomedical research andmedicine[J].Current molecular medicine,2016,16(4):343-352.)。科学家自20世纪90年代末就开始探索基因组定点编辑技术，但直到2002年，也仅在小鼠(Capecchi MR.Altering the genome by homologous recombination[J].Science,1989,244(4910):1288-1292.)和果蝇(Bellaiche Y,Mogila V,Perrimon N.I-SceI endonuclease,a newtool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila[J].Genetics,1999,152(3):1037-1044.)等少数模式生物中实现了同源重组介导的基因组定点编辑，且因同源重组的效率很低，限制了其应用前景。进入21世纪后，随着蛋白质结构与功能研究的新突破和人工核酸内切酶(engineered endonuclease，EEN)技术的出现，将特异识别并结合DNA的蛋白结构域和EEN融合，创造出了能够特异切割DNA序列的核酸酶(sequence-specific nucleases，SSNs)，从而可以对基因组特定位点进行高效和精确的靶向编辑(Baker M.Gene-editing nucleases[J].Nature Methods,2012,9(1):23-26.)。

目前，SSNs主要包括锌指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFNs)(Urnov F D,Rebar E J,Holmes M C,et al.Genome editing with engineered zinc fingernucleases[J].Nature Reviews Genetics,2010,11(9):636-646.)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)(Christian M,Cermak T,Doyle E L,et al.Targeting DNA double-strand breaks with TAL effectornucleases[J].Genetics,2010,186(2):757-761.)、成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated Cas9，CRISPR/Cas9system)(Mali P,Aach J,Stranges P B,etal.CAS9transcriptional activators for target specificity screening and pairednickases for cooperative genome engineering[J].Nature Biotechnology,2013,31(9):833-838.)和CRISPR/Cpf1系统(Zetsche B,Gootenberg J S,Abudayyeh O O,etal.Cpf1is a single RNA-guided endonuclease of a class 2CRISPR-Cas system[J].Cell,2015,163(3):759-771.)。这些SSNs的共同特点是都能在基因组特定部位精确切割DNA双链，造成DNA双链断裂(DNA double-strand breaks，DSBs)；而DSBs能够极大地提高染色体重组事件发生的概率(Cohentannoudji M,Robine S,André Choulika,et al.I-SceI-induced gene replacement at a natural locus in embryonic stem cells[J].Molecular and Cellular Biology,1998,18(3):1444-1448.)。DSBs的修复机制在真核生物细胞中高度保守，主要包括同源重组(homology-directed repair，HDR)和非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)两种修复途径。当没有供体DNA时，细胞则通过NHEJ途径修复(Symington L S,Gautier J.Double-strand break end resection andrepair pathway choice[J].Annual Review of Genetics,2011,45:247-271.)。由于NHEJ方式的修复往往不够精确，在DNA链断裂位置常会产生少量核酸碱基的插入或缺失(insertion-deletion，InDel)，从而导致基因突变；而存在同源序列供体DNA时，以HDR方式的修复能够产生精确的定点替换或插入(Bibikova M,Golic M,Golic K G,etal.Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases[J].Genetics,2002,161(3):1169-1175.)。

2010年出现TALENs和2013年出现CRISPR/Cas9技术后，世界上掀起了基因组定点编辑研究热潮(Ishii T.Germline genome-editing research and its socioethicalimplications[J].Trends in molecular medicine,2015,21(8):473-481.)。尤其是CRISPR/Cas9技术，因其相对简单、精确、高效，很快被广泛应用于医学、农业、基础研究等领域(Weeks D P,Spalding M H,Yang B.Use of designer nucleases for targeted geneand genome editing in plants[J].PlantBiotechnology Journal,2016,14(2):483-495.)。因TALENs和CRISPR/Cas9潜在的巨大应用价值，它们相继被《科学》杂志评为2012年和2013年的十大科学突破之一。在利用基因编辑技术提高水稻抗病性方面，已报道的全是通过敲除水稻抗病负调控基因而使水稻获得避病型抗性(Li T,Liu B,Spalding M H,etal.High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice[J].Nat Biotechnol.2012；30(5):390-392；Wang F,Wang C,Liu P,et al.Enhanced RiceBlast Resistance by CRISPR/Cas9-Targeted Mutagenesis of the ERF TranscriptionFactor Gene OsERF922[J].PLoS ONE.2016；11(4):e0154027)，这种策略是利用SSNs将抗病负调控基因DNA双链切断，并利用水稻的NHEJ修复机制造成抗病负调控基因失活，这是比较容易实现的，但是植物的抗病负调控基因比较少，因此这种策略的使用机会有限。而本发明技术是利用SSNs将水稻基因组DNA双链切断，同时提供设计好的功能性模板DNA片段，再利用水稻的HDR修复机制使功能性模板DNA片段定点插入到水稻基因组的特定位置，这是目前基因编辑领域公认的高难度技术，但是这个技术可以使水稻获得主动性的抗病功能(而不是避病)，利用前景更加广阔。因此本发明不仅具备高难度技术的创新性，而且具有巨大的实际应用前景。

发明内容

如何利用基因组编辑技术来提高水稻对白叶枯病的抗病性是本发明人在基因编辑技术出现后一直的探索的课题，根据本发明人对Xa23基因的深入研究，结合基因组编辑技术，最终完成本发明。

Xa23基因来源于个别野生稻种，在栽培稻中并不存在。但是大多数栽培稻品种中含有Xa23基因的隐性等位基因xa23。由于栽培稻中的等位基因xa23并不表达，因而不能基于Xa23基因所获得的抗白叶枯病的抗性。对此按照常规的方式，将发明人已克隆的Xa23基因转化导入到水稻中，以获得所述基因的表达，进而使转基因水稻获得对白叶枯的抗病性。但这种通过转化导入新的基因存在的缺点比较明显，比如会同时导入抗性标记基因等。对此，发明人认真分析了栽培稻中的等位基因xa23并不受白叶枯病菌诱导表达的原因在于：栽培稻中虽然含有Xa23编码区，但其启动子内缺乏AvrXa23识别的EBE_AvrXa23序列(Wang CL,Qin T F,Yu H M,et al.The broad bacterial blight resistance of rice lineCBB23is triggered by a novel transcription activator-like(TAL)effector ofXanthomonas oryzae pv.oryzae[J].Mol Plant Pathol,2014,15(4):333-341.)，因此而不能转录表达。发明人经过进一步思考，如果将抗白叶枯病基因Xa23启动子的EBE_AvrXa23序列引入水稻xa23位点的上游启动子区，使xa23获得白叶枯病菌诱导表达的能力，从而提高水稻的白叶枯病抗性，如此利用的是基因组中本身存在的xa23基因，抗性可能会提高更为明显。

基于此，发明人创造性的利用基因编辑技术，具体地是利用CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、TALENs和ZFNs基因编辑技术，优选是CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过研发最终将抗白叶枯病基因Xa23启动子的EBE_AvrXa23序列引入水稻xa23位点的上游启动子区，获得了使xa23获得白叶枯病菌诱导表达的能力。本发明克服传统转基因技术导致转基因植株基因组中Xa23基因的随机插入的缺点，而利用本发明的技术可以通过基因定点编辑利用水稻中固有的xa23基因来实现对水稻白叶枯病的抗病反应，具有编辑位点特异性的优点，且不带入外源DNA，从而避免传统转基因技术的生物安全问题。同时，这种培育抗白叶枯病水稻的新方法能使众多丰产优质但感病的水稻品种变成广谱高抗白叶枯病的丰产优质且抗病的品种，可以广泛应用于水稻抗病育种，对水稻遗传育种和生产具有重大应用前景。

因此，本发明的目的是提供一种显著提高水稻抗白叶枯水平的方法。具体是通过利用基因编辑技术，优选的是CRISPR/Cas9技术介导的同源重组修复(HDR)技术，将AvrXa23结合位点的核酸片段(以下简称EBE_AvrXa23)替换到水稻xa23基因上游的假EBE区，使之具有抗病性状，创造新的抗病品种。

上述方法中，所述的AvrXa23结合位点的核酸片段序列包括但并不局限于EBE_AvrXa23序列(TCCGAAACATCTTCCTCCCGCATCACTA)(SEQ ID NO:1)，但是可以产生抗病效应的AvrXa23结合位点的核酸片段在天然栽培稻品种中并不存在。在对白叶枯感病的水稻品种日本晴xa23基因S上游EBE_AvrXa23对应位置的序列附近筛选的CRISPER/Cas9基因编辑靶序列为：AGTAGCTGATGTGAAGGGCGCGG(SEQ ID NO:2)和/或ATGTTAGTGAGGCGGAAGGAAGG(SEQ IDNO:3)。

所使用的打靶载体采用了双靶点的设计，以实现对水稻的xa23基因上游启动子区的2个靶位点进行同时切割。这是为了得到更好的同源重组替换效果，在设计打靶载体pC-XA23时采用了双靶点的设计，这样同时表达两个靶点序列的sgRNA和Cas9内切酶，对水稻品种日本晴xa23基因上游启动子区的2个靶位点进行同时切割。这样就能人为地使水稻品种日本晴xa23基因上游启动子区被切割成3段并可能造成2个靶位点中间序列片段的脱落，这样可以尽量增加非同源末端连接修复的难度，也为含有2个靶点外侧同源臂的修复模板介导的同源重组修复提供了机会。

所使用的供体载体中待替换的AvrXa23结合位点的核酸片段序列前设计有酶切位点，优选为BamHI酶切位点。这是可以在后续更便捷地检测得到的阳性植株，在供体载体pD-XA23中待替换的EBE_AvrXa23序列前增加了BamH I酶切位点，这样在阳性植株筛选中可以通过简单的PCR扩增和限制性内切酶BamH I的酶切就能筛选得出发生同源重组替换的阳性植株。

本发明方法中所述水稻是栽培稻，优选为亚洲栽培稻和非洲栽培稻，更优选地是亚洲栽培稻的籼稻常规品种(例如黄华占、美香占2号、稻花香2号、龙粳31等)和杂交稻组合(例如超优千号、湘两优900、隆两优1988、深两优136、晶两优华占、内香6优9号、泸优727及蜀优217等)的亲本。

本发明通过对xa23基因的特点进行深入分析，提供了一种全新的提高水稻抗白叶枯病水平的方法，经过验证，利用本发明方法创制出的抗白叶枯病的水稻品种中，xa23基因的启动子区域实现了AvrXa23结合位点的核酸片段EBE_AvrXa23的同源重组替换编辑，从而激活了xa23基因表达，产生了较强的抗病反应(实验证明表明抗病能力最提高24倍)，并且无脱靶效应及常规转基因导致的T-DNA随机插入。因此本发明的方法具有更安全，抗性提高更明显等优点。

附图说明

图1水稻品种日本晴xa23基因上游启动子区CRISPR/Cas9靶位点选择和EBE_AvrXa23同源重组替换实验设计图。

图2靶位点序列合成引物接头。

图3打靶载体pC-XA23构建流程图。

图4打靶载体pC-XA23组成示意图,其中target1sgRNA代表识别靶点1的sgRNA表达盒，target2sgRNA代表识别靶点2的sgRNA表达盒。

图5利用Overlapping PCR构建供体载体pD-XA23同源重组修复模板的引物设计图，其中黄色背景部分为保护碱基，红色背景部分为切割位点，绿色背景部分为EBE_AvrXa23(SEQ ID NO:1)核酸片段，蓝色背景部分为BamHⅠ的酶切位点。

图6利用Overlapping PCR构建供体载体pD-XA23同源重组修复模板的流程图。

图7供体载体pD-XA23组成示意图，其中LHA代表同源左臂，RHA代表同源右臂，T1代表CRISPER/Cas9编辑靶点1，T2代表CRISPER/Cas9编辑靶点2。

图8同源重组修复检测设计图。图中的引物对XA23PF/XA23PR为设计在同源重组臂之外的一对引物。

图9同源重组修复流程图

图10PCR/RE检测图。引物对XA23PF/XA23PR扩增的条带，经过BamHⅠ的酶切可以得到待选的阳性株系。

图11接种水稻白叶枯病菌PXO99的感病植株和抗病植株。

图12T0代植株接种水稻白叶枯病菌PXO99后病斑长度调查结果。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法和所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规方法和自常规生化试剂商店购买得到的。常规分子生物学实验方法可参见分子克隆：实验指南，J.Sambrook，等编著，第四版，冷泉港实验室出版，冷泉港，N.Y.，2012。下述实施方式仅仅是示意性的，并不是意图对本发明保护范围进行限制，例如选择材料仅仅作为例子来使用，本发明并不局限于这些材料本身。

实施例一、打靶载体pC-XA23

一、材料

1、菌株：大肠杆菌(Escheriehia coli)DH5a；

2、载体：CRISPER/Cas9载体获赠自华南农大刘耀光老师实验室。该CRISPER/Cas9载体已公开发表(Ma X L,Zhang Q Y,Zhu Q L,et al.A robust CRISPR/Cas9 system forconvenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicotplants[J].Mol Plant,2015，8(8),274-1284)。

二、方法

1、引物设计

(1)利用在线CRISPER靶序列筛选网站(http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/)在日本晴中xa23基因(参见GenBank登录号KP123634)启动子序列上选择潜在脱靶位点较少的靶序列，然后把靶点序列连接到sgRNA序列的5’端[(20bp target)GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT](SEQ ID NO：4),利用在线软件RNA Folding Form(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/RNA-Folding-Form2.3)做二级结构分析。避免使用靶序列与sgRNA序列产生连续配对7bp以上的靶序列。。通过筛选得到即将进行双靶点切割的目标靶序列，分别为靶序列1：AGTAGCTGATGTGAAGGGCGCGG(SEQ ID NO：2)和靶序列2:ATGTTAGTGAGGCGGAAGGAAGG(SEQID NO：3)。并根据2条靶序列分别设计靶点1的接头正向引物XA23-FS1和靶点1的的接头反向引物XA23RS1(SEQ ID NO：5/SEQID NO：6)；靶点2的接头正向引物XA23-FS2和靶点2的接头反向引物XA23RS2(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：8),构建CRISPER/Cas9打靶载体pC-XA23的引物如表1所示。其中除接头引物外，U-F(SEQ ID NO：9)，gR-R(SEQ ID NO：10)靶标sgRNA表达盒的第一轮PCR扩增，Pps-GGL/Pgs-GG2(SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：12)和Pps-GG2/Pgs-GGR(SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：13))用于靶标sgRNA表达盒的第二轮PCR扩增，并引入Bsa I酶切位点以便将识别靶点1和靶点2的sgRNA表达盒连接到含Cas9基因的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H植物表达载体上形成打靶载体pC-XA23。PU3(SEQ ID NO：11)为测序引物。

表1 构建打靶载体pC-XA23所需引物

2、载体构建

根据Ma等(Ma XL,et al.A robust CRISPR/Cas9 system for convenient,High-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants.Mol Plant,2015b,8(8):1274-1284.)报道的方法进行构建，具体操作如下：

A：靶位点接头设计

U3和U6基因由III型RNA聚合酶转录，转录起始点是确定的碱基位置(U3为A，U6为G)；因此，由U3或U6启动子驱动的sgRNA首碱基一定是A或者G。对于PAM上游第20碱基是A或G的靶点，其接头设计如图2所示。由于本发明中选择的靶点1序列：AGTAGCTGATGTGAAGGGCGCGG(SEQ ID NO:2)和靶点2序列：ATGTTAGTGAGGCGGAAGGAAGG(SEQID NO:3)的首碱基均为A，因此选择含有U3启动子的sgRNA载体(pYLgRNA-OsU3)。

B：靶位点接头制备

将接头正向和反向引物用0.5x TE溶解成10μM，再各取1μl加入到8μL 0.5x TE混合稀释到1μM；94℃加热1min，室温自然冷却完成退火。

C：接头靶引物与sgRNA载体的连接

接头靶引物用T4连接酶克隆至各自相应的预先被Bsa I酶切处理过的sgRNA载体(pYLgRNA-OsU3)，连接体系(表2)；室温连接10-15min。

表2连接反应体系

D：靶标sgRNA表达盒的PCR扩增

以上述连接产物为模版，进行巢式PCR扩增，扩增反应共分二轮。第一轮扩增分两个独立的反应：反应1使用U-F/接头反向引物(SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:8)；反应2使用接头正向引物/gR-R(SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:10)。反应程序为：94℃10sec，60℃15sec，68℃20sec(28个循环)。取5μl PCR产物电泳检测(2％琼脂糖凝胶)是否扩增出条带。

第二轮为Overlapping PCR，用位置特异引物(表3)扩增出表达盒产物。具体为：取第一轮反应1和2中的PCR产物(稀释10倍)为混合模版，根据连接的靶位点数量用相应的位置特异引物进行扩增(表4)；反应程序为：95℃10sec，58℃15sec，68℃20sec(20个循环)。取2μl PCR产物电泳检测(1％琼脂糖凝胶)是否扩增出条带。

通过第二轮Overlapping PCR即可构建得到的打靶载体pC-XA23上识别靶点1的sgRNA表达盒的序列(SEQ ID NO:24)和识别靶点2的sgRNA表达盒的序列(SEQ ID NO:25)。每个表达盒都由OsU3启动子和识别靶点1或靶点2的sgRNA组成。两轮PCR的构建流程如图3所示。

表3 sgRNA表达盒特定位置引物对的使用方法

表4 PCR反应体系

E：靶标sgRNA表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H植物表达载体

pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体预先用Bsa I酶切处理，琼脂糖凝胶回收载体片段。将第二轮PCR扩增的靶标sgRNA片段用PCR产物纯化试剂盒纯化后，利用变温循环酶切-连接(表5)：37℃5min，10℃5min，20℃5min(10-15循环)；最后37℃5min。重组质粒通过热激(42℃，1min)转入TOP10感受态细胞，之后于LB+Kan(50μg/mL)固体培养基培养至克隆长出后，用PU3(SEQ ID NO11)和相应靶点接头反向引物PCR扩增检测是否连接正确，PCR检测正确的质粒进一步用引物PU3(SEQ ID NO11)测序验证。最终得到打靶载体pC-XA23(图4)。

表5酶切-连接反应体系

实施例二、供体载体pD-XA23构建

一、材料

1、菌株：大肠杆菌(Escheriehia coli)DH5a。

2、载体：

-Blunt Cloning Vector来自全式金(Transgene)

3、酶：KOD FX购自东洋宝(TOYOBO)公司，BamH I FD购自宝生物(Takara)

4、试剂盒：DNA Gel Extraction Kit购自宝生物(Takara)

二、方法

1、引物设计

利用Overlapping PCR构建供体载体pD-XA23同源重组修复模板的引物，设计的供体载体的引物如下表所示。Nipxa23F1cas1(SEQ ID NO:16)和Nipxa23R1(SEQ ID NO:17)用于扩增同源左臂和BamH I酶切位点及EBE_AvrXa23(SEQ ID NO:1)的5’端10bp部分序列；Nipxa23F2(SEQ ID NO:18)和Nipxa23R2cas2(SEQ ID NO:19)用于扩增同源右臂和EBE_AvrXa23(SEQ ID NO:1)序列(图5)。

表6供体载体pD-XA23构建引物设计

2、修复模版的构建

修复模版的构建基本流程如图6所示，第一步利用正向引物Nipxa23F1cas1(SEQID NO:16)和相应反向引物Nipxa23R1(SEQ ID NO:17)组成的引物对扩增得到含有靶点1、同源左臂和EBE_AvrXa23(SEQ ID NO:1)的5’端10bp部分序列的片段；利用正向引物Nipxa23F2(SEQ ID NO:18)和相应反向引物Nipxa23R2cas2(SEQ ID NO:19)组成的引物对扩增同源右臂和EBE_AvrXa23(SEQ ID NO:1)序列。第二步利用Overlapping PCR的方法将二者连接起来构建修复模版。

A：修复模版DNA片段的扩增

使用正向引物Nipxa23F1cas1(SEQ ID NO:16)和相应反向引物Nipxa23R1(SEQ IDNO:17)组成的引物对扩增同源左臂和部分EBE_AvrXa23(SEQ ID NO:1)序列；使用正向引物Nipxa23F2(SEQ ID NO:18)和相应反向引物Nipxa23R2cas2(SEQ ID NO:19)组成的引物对扩增同源右臂和部分EBE_AvrXa23(SEQ ID NO:1)序列(表7)。

表7 PCR扩增体系

反应参数：94℃变性5分钟，然后进入PCR循环，即94℃30秒，55℃30秒、68℃30秒，共进行35个循环，最后68℃延伸10分钟。

B：修复模版PCR产物的纯化

(1)取上述DNA片段在1％的琼脂糖凝胶上电泳，分离片段。

(2)将胶块称重，按照DNA Gel Extraction Kit说明书以100mg＝100μL体积进行换算；加入3倍凝胶体积量的Buffer DE-A，随后于75℃加热至凝胶完全融化。

(3)向上述融化液中加入0.5倍Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，颠倒混匀；当回收的DNA片段小于400bp时，加入1倍凝胶体积的异丙醇。

(4)将上述混合液吸至DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃滤液。

(5)在DNA制备管中加入500μL Buffer W1，12000rpm离心30sec,弃滤液。

(6)在DNA制备管中加入700μL Buffer W2，12000rpm离心30sec,弃滤液；重复操作一次。

(7)将DNA制备管12000rpm离心2min。

(8)将DNA制备管置于新的1.5mL离心管中，在制备膜中间加25-30μL的去离子水(为提高洗脱效率，去离子水可先65℃预热)；室温静止2min，12000rpm离心2min洗脱DNA。

C：Overlapping PCR构建修复模版

上述纯化回收的PCR产物序列中，除了同源左右臂外，其EBE_AvrXa23(SEQ ID NO:1)部分右序列一致，可以使用Overlapping PCR的方法将二者连接起来构建修复模版。首先是经过纯化回收的两种PCR产物混合后退火延伸，反应体系如下(表8)。

表8 Overlapping PCR第一步扩增体系

反应参数：94℃变性5分钟，然后进入PCR循环，即94℃10秒，52℃15秒、68℃20秒，共进行15个循环，最后68℃延伸5分钟。

第一步扩增反应后向试管中加入正向引物Nipxa23F1cas1(SEQ ID NO:16)，反向引物Nipxa23R2cas2(SEQ ID NO:19)继续扩增，反应体系如下(表9)。

表9 Overlapping PCR第二步扩增体系

反应参数：94℃变性5分钟，然后进入PCR循环，即94℃30秒，55℃30秒、68℃30秒，共进行35个循环，最后68℃延伸10分钟。通过该步Overlapping PCR即可构建得到的供体载体pD-XA23上修复模板的序列(SEQ ID NO:26)。

3、供体载体pD-XA23的构建

将回收纯化的PCR产物连接到

-Blunt Cloning Vector(Transgene)，连接反应如下:

(l)离心

-Blunt Cloning Vector数秒，收集离心管底部内含物。

(2)0.5ml离心管中加入:0.5μl

-Blunt Cloning Vector和4μl修复模版混匀。

(3)将上述混合液放到37℃培养箱中15min。

(4)反应结束后将离心管置于冰上。

(5)从-70℃取出大肠杆菌(Escheriehia coli)DH5a感受态细胞，置于冰浴中，直到融化，约5分钟。将步骤4所得到连接产物加入到感受态细胞中，轻轻混合，置于冰上。

(6)冰浴30min后，42℃水浴热激40s，置于冰上2min。

(7)加入300μl LB液体培养基37℃培养1小时

(8)取100μl培养液于LB/Amp/IPTG/X-Gal培养皿，37℃培养16-20小时。

(9)观察结果，挑选白菌落。

其中用到的试剂如下:

Amp(50mg/ml):100mg Amp加2ml去离子水500ml，过滤灭菌；IPTG(0.IM):1.2gIPTG加水50ml，过滤，4℃贮存；X-Gal(50mg/ml):100mg 5-溴-4-氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷溶于2ml二甲基甲酰胺溶液。用铝箔包裹以防因光照而被破坏，-20℃贮存，须过滤。

LB培养基(IL):10g胰蛋白胨，5g酵母抽提物，5g NaCl，再用Na0H调pH至7.0(固体时再加15g琼脂)；SOC培养基(100ml):2.0g trytone，0.5g酵母抽提物，1.0ml 1M NaCl，0.25ml 1M KCl,1.0ml lM Mg2+母液，1.0ml 2M glucose。

LB/Amp:终浓度为100μg/ml的Amp浓度，将平板置于4℃保存；LB/Amp/IPTG/X-Gal:在LB/Amp上加100μl的0.1M IPTG和20μl的50mg/m1X-Gal。

4、DH5α感受态细胞的制备

(l)取菌DH5α于LB固体培养基上划平板，37℃，培养过夜。

(2)当天晚上配置SOB培养基(SOB培养基:tryptone，20g、酵母抽提物，5g、5MNaCl，2.0ml、1M KCl，2.5ml，加去离子水l000ml，用NaOH调pH至7.0，灭菌)，10％甘油灭菌(10％甘油:639丙三醇(约50ml)加去离子水至500ml，灭菌)。

(3)次日上午接种:接单菌落到2mlSOB培养基里，37℃，200-250rpm振荡培养6小时。

(4)上述菌液加入到400ml SOB的1L大烧瓶内，37℃，250rpm，约3小时后，测OD550值，以后每几分钟测一次。OD550在0.65-0.77时，立即停止摇荡，取出放于冰水中迅速摇动至完全冷却。以下操作必须在冰上进行。

(5)将上述菌液分装于50ml离心管中，2,200g(g＝rcf)，0℃，离心11分钟。

(6)倒出上清，加30ml10％灭菌甘油，在冰水中摇荡至沉淀完全溶解，2,400g，0o C离心，13分钟。

(7)重复第6步，倒去上清，待有絮状菌体出现时停止倾倒，把所有絮状菌体转入同一个50ml离心管中，再次离心。

(8)用枪吸去上清夜，仅留少部分甘油，和沉淀物充分混匀，约800-900μl(400mlSOB约制备800-900μl感受态细胞)。以40μl/管的剂量分装入1.5ml的离心管中，放置-80℃保存即可。

5、重组载体的鉴定

A：质粒提取

采用SDS碱裂解法制备质粒DNA，所用试剂如下:

溶液I:50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·CI(PH8.0)，10mmol/L EDTA(PH8.0)；灭菌，4℃贮存。

溶液Ⅱ:0.2mol/LNa0H(临用前用10mmol/L贮存液现用现稀释)，1％SDS；混匀，置于室温。

溶液Ⅲ:5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，加水28.5ml混匀，置于冰上。

无DNA酶的胰RNA酶:将胰RNA酶(RNA酶A)溶于10mmol/L Tris(pH7.5)，15mmol/LNaCI中配成10mg/ml浓度，于100℃，加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。

(1)挑单菌落于加有2mL LB培养基(含有载体相应抗生素)的试管中，于摇床230rpm、37℃培养12-16h。

(2)将菌液转移至1.5mL离心管，12000rpm离心1min，收集菌体。

(3)向菌体中加入300μL溶液I，用震荡器充分震荡悬浮；加300μL溶液Ⅱ，温和颠倒6-8次至液体透明；透明后迅速加入300μL溶液Ⅲ，温和颠倒混匀至分散状的白色絮状物悬液。

(4)12000rpm离心7min，吸取上清液约900μL到新的1.5mL离心管中，再加入0.6倍体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀。

(5)12000rpm离心7min，弃掉上清，用75％酒精洗两次，待自然晾干后加入20μL 1×TE(pH 8.0)溶解，-20℃保存备用。

B：质粒酶切和测序鉴定

在1.5ml离心管中加入：质粒DNA 3.0μl，10×H Buffer 2.0μl，BamH I(5U/μl)1.0μl，加ddH20 14.0μl，总计20.0μl，于37℃，酶切l小时。

质粒酶切后检测在1％的琼脂糖凝胶上电泳，检测分离片段大小符合预期(图9)，重组载体用M13F(SEQ ID NO:20)和M13R(SEQ ID NO:21)进行测序。最终得到的载体(图7)。

实施例三、水稻遗传转化

一、材料

(1)水稻转化受体材料：水稻粳稻品种日本晴。

(2)菌株：大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α。

(3)试剂：金粉储液(60mg/mL)；2.5MCaCl₂；100mM spermdine；无水乙醇。

(4)仪器：伯乐(Bio-rad)PDS1000/He基因枪。

二、方法

1、农杆菌介导水稻遗传转化

(1)水稻基本培养基试剂配方

表10水稻基本培养基试剂配方

(2)植物激素母液配方

1)1.0mg/ml 2,4-D母液

①称取100mg 2,4-D，置于小烧杯内；

②加少量无水乙醇使之完全溶解；

③把2，4-D酒精溶液缓缓加入磁力搅拌器上的水中，如果出现沉淀，需要重新配制；

④定容至100ml，4℃保存。

2)1.0mg/mlα-NAA母液

①称取100mgα-AA置于小烧杯内:

②用1N的KOH溶液溶解NAA；

③用水定容至100ml，4℃保存。

3)1.0mg/ml 6-BA母液

①称取100mg6-BA置于小烧杯内:

②加少量的浓盐酸，用玻棒研磨成糊状，再加入少量浓盐酸，使之完全溶解；

③用水稀释并定容至100ml，4℃保存。

4)l mg/ml KT

称取100mg Kenetin，用少量1N KOH溶解，用水稀释定容至100ml，过滤灭菌后，分装入无菌小管中，-20℃保存。

(3)水稻培养基

愈伤组织诱导及继代培养基：N₆培养基+2.0mg/L 2，4-D+500mg/L脯氨酸+300mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3.0mg/L Phytagel；pH5.9。

高渗培养基：愈伤组织诱导培养基+0.2mol/L甘露醇+0.2mol/L山梨醇,PH5.8。

预培养培养基：N₆培养基+2.0mg/L 2，4-D+600mg/L水解酪蛋白+20g/L蔗糖+7.0g/L Agar+10.0g/L Glucose+100μmol/L As；PH5.6。

共培养培养基：N₆培养基+2.0mg/L 2，4-D+800mg/L水解酪蛋白+20g/L蔗糖+7.0g/LAgar+10.0g/L Glueose+100μmol/L As；PH5.6。

筛选培养基：N₆培养基+2.0mg/L 2，4-D+600mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+7.O g/LAgar+50mg/L LHyg+200mg/L Carb；PH6.0。

预分化培养基：MS培养基+2.0mg/L 6-BA+2.0mg/L KT+0.2mg/LNAA+0.2mg/LIAA+600mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+7.0g/L Agar+50mg/L Hyg+200mg/L Cab；PH5.9。

分化培养基：MS培养基+2.0mg/L 6-BA+2.O mg/L KT+0.2mg/L NAA+0.2mg/LLAA+1.0g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3.0g/L；Phytagel:pH6.0。

生根培养基：1/2MS大量培养基+1/2MS微量培养基+铁盐+MS有机+20g/L蔗糖+3.0g/L Phytagel；PH5.8。

(4)胚性愈伤组织的诱导和继代培养

1)日本晴200粒成熟种子剥去颖壳，用75％乙醇浸洗1分钟，转入0.1％升汞浸泡15分钟，再用灭菌超纯水冲洗5次后用滤纸吸干。

2)将种子置于愈伤组织诱导培养基上，25℃，暗培养3-4周。

3)从种子盾片附近长出的愈伤组织块剥离下来，置愈伤组织继代培养基上继代2-3次(每代15天)，25℃，暗培养。

4)然后转移到预培养基上25℃，暗培养一周，即可获得用于转化的愈伤组织。

(5)基因枪转化

1)20.25μl(60mg/mL金粉储液)，取前超声5min，移液枪吸打30s。

2)12000rpm离心，弃上清，加入150μl无菌水。

3)加入15μg质粒载体(pC-XA23和pD-XA23摩尔比1:1)。

4)加入150μl 2.5M CaCL₂快速混匀。

5)加入50μl 100mM spermdine慢速涡旋10min到1h。

6)5000rpm离心10s,弃上清。

7)加入200μl无水乙醇，快速混匀，5000rpm离心10s弃上清。

8)加入180μl无水乙醇。

9)超声水浴2到3s。

10)基因枪转化每枪1ug质粒DNA(0.08ug金粉)；伯乐(Bio-rad)PDS1000/He基因枪的操作条件是：愈伤组织到载体膜阻拦网6cm，氦气压力1100psi。

(6)抗性愈伤组织的筛选

将上述共培养后的愈伤组织取出，用无菌水冲洗5-7次后，在400ppm羧苄青霉素的无菌水中浸泡30分钟，取出愈伤组织置于滤纸上，在超净台里吹干(5个小时以上)。干燥后的愈伤组织转移到潮霉素抗性筛选培养基上，筛选2次，每次2周。

(7)抗性愈伤组织的预分化和分化

挑选直径为1-2mm生长状态好、结构致密、淡黄色的抗性愈伤组织，转移至预分化培养基上，于25℃暗培养一周，然后转移至分化培养基上，于28℃，光照培养3-4周，愈伤组织开始分化出小苗。

(8)转化植株的生根培养和移苗

将3-4cm的幼苗转入生根培养基里，于28℃，光照培养，待根系生长良好后，打开瓶口，练苗1周，然后转移到温室或试验基地中生长。

实施例四转基因植株的分子检测和抗病性鉴定

一、材料

(1)水稻材料：水稻粳稻品种日本晴的T0代苗。

(2)菌种：水稻白叶枯病菌PXO99

(3)酶：KOD FX购自东洋宝(TOYOBO)公司，BamH I FD购自宝生物(Takara)。

(4)试剂盒：PCR产物纯化试剂盒购自康为试剂。

(5)PSA培养基：10.0g/L胰蛋白胨，10.0g/L蔗糖,1.0g/L谷氨酸，15.0g/L Agar；PH6.8。

二、方法

经过基因枪转化后共得到890株T0代转基因苗

1、水稻总DNA的提取

采用SDS法提取水稻基因组DNA(Dellaporta et al.,1983)，具体操作如下：

(1)取适量水稻叶片置于2mL离心管中，装入钢珠，在液氮中冷却3min，随后迅速用植物细胞破碎仪进行震荡破碎约40sec。

(2)迅速倒出钢珠，加入650μL已65℃预热的SDS提取液，65℃水浴40min，每隔10min摇匀一次。

(3)在上述混合液中加入650μL酚/氯仿(V:V＝1:1)，上下颠倒混匀5min，室温静止5min后，4℃、12000rpm离心10min。

(4)吸取600μL至新的1.5mL离心管中，加0.6倍体积异丙醇(预冷)，上下颠倒混匀。

(5)-30℃冰柜中静置30min，4℃、12000rpm离心10min，弃上清。

(6)用75％乙醇清洗DNA沉淀两次，尽量弃去乙醇，待自然干燥后加适量1×TE(pH8.0)溶解，-20℃保存备用。

2.PCR验证

在同源左臂的左边和同源右臂的右边的基因组序列上分别设计正向引物Xa23EBEpF(SEQ ID NO:22)和反向引物Xa23EBEpR(SEQ ID NO:23)(表11)。用来扩增发生同源重组修复后的染色体区域(表12)。具体的检测设计如图8所示。

表11检测引物序列

表12 PCR反应体系

3.PCR产物纯化

PCR产物的纯化按照PCR产物回收试剂盒的说明进行，具体如下所示：

(1)估计PCR反应液的体积，加入5倍体积的Buffer PB，充分混匀。

(2)柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱中加入200μL Buffer PS，13000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(3)将第一步所得混合液吸至收集管吸附柱中，室温放置2分钟，13000rpm离心30到60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

(4)向吸附柱中加入750μL Buffer PW，13000rpm离心30到60秒，弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中。

(5)13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

(6)将吸附柱置于新的1.5mL离心管中，在制备膜中间加25-30μL的去离子水(为提高洗脱效率，去离子水可先65℃预热)；室温静止2min，12000rpm离心2min洗脱DNA。

4.酶切验证

因为在实验设计中供体载体的修复模版上的EBE_AvrXa23(SEQ ID NO:1)序列片段的前面人为的加入了一段限制性内切酶BamH I的识别序列5’-GGATCC-3’,当发生了同源重组反应后即可以通过酶切验证。至此就完成了整个同源重组替换编辑的分子克隆及检测过程(图9)。酶切的反应体系如下表所示，37℃酶切30min。检测结果显示有21株样品可以在PCR后被限制型内切酶BamH I切开(图10)。

表13酶切反应体系

5.测序验证

上一步酶切得到的阳性植株，经PCR产物测序后确定来源于w1694株系和w1699株系的15株为T0代同源重组的植株,经过HDR途径在指定位置替换代入EBE_AvrXa23(SEQ ID NO:1)序列(表14)，重组率为1.7％；另外还有来源于w1703株系的6株为假阳性植株，双靶点切割后经过NHEJ途径随机插入一段含有BamH I的识别点的非EBE_AvrXa23的序列。

表14测序验证

6.T0代植株脱靶位点分析

因为CRISPR介导的基因编辑可能因为识别靶序列的sgRNA结合了与靶序列相似的序列而导致非特异性的切割，产生脱靶效应。因此，进一步对所得到的阳性植株做了脱靶位点检测，这也是确保本发明的编辑替换的位点特异性。

根据CRISPR实验方法中的脱靶位点分析方法，使用blast比对和在线脱靶位点分析软件CRISPERGE对EBE_AvrXa23同源重组实验的潜在脱靶位点进行分析。结果显示本实验中使用靶位点的sgRNA和Cas9酶在打靶时并没有在日本晴基因组上产生脱靶，结果如下表所示。

表14潜在脱靶位点分析

注：T1：靶点1；T2：靶点2；OT：off target(脱靶)；

有下划线碱基代表错配的碱基；斜体碱基代表PAM位点。

7.接种鉴定

广谱致病菌系PXO99引自国际水稻研究所(IRRI),真空保存于-70℃，用前在PSA培养基上复壮,置于28℃培养48h，以无菌水配制接种菌液,浓度调至OD₆₀₀＝1.0。

受体亲本及基因编辑的T0代植株采用人工剪叶接种法，接种水稻白叶枯病致病菌系PXO99。接种后2周左右，感病对照品种病情趋于稳定时进行调查,用病斑长度作为抗感反应参数。接种后，不断观察病斑的发展，14天后调查，相应病斑长度调查结果下表及图11和图12所示。

表16 T0代接种PXO99后的表型分析

结果显示发生同源重组替换的15株阳性植株表现抗病,病斑长度在0.5-2cm之间，受体亲本野生型日本晴及其余6株发生NHEJ随机插入片段的假阳性植株都表现感病，病斑长度在10cm以上，抗病能力最高提高24倍，大部分能够提供10倍以上。上述实验结果表明发生EBE_AvrXa23的同源重组替换的植株在接种后病斑长度与野生型亲本及发生NHEJ随机插入片段的假阳性植株相比要明显变短，产生了抗病反应。因此，通过将CRISPER双靶点的打靶载体pC-XA23和含有EBE_AvrXa23核酸修复片段的模板供体载体pD-XA23共转化白叶枯感病水稻品种日本晴，可以激活日本晴中水稻抗病基因xa23的表达诱发超敏反应来抵御白叶枯病菌的侵害，进一步可以培育出抗水稻白叶枯病的水稻品(系)种。

序列表

<110> 中国农业科学院作物研究所

<120> 一种通过基因编辑技术培育抗白叶枯病水稻的方法

<160> 26

<210>1

<211> 28

<212> DNA

<213>基因组序列

<220>

<223> EBEAvrXa23序列的描述：AvrXa23结合位点的核酸片段序列

<400> 1

TCCGAAACAT CTTCCTCCCG CATCACTA 28

<210>2

<211> 23

<212> DNA

<213>基因组序列

<220>

<223> 靶点序列的描述：xa23基因启动子区靶点序列

<400> 2

AGTAGCTGAT GTGAAGGGCG CGG 23

<210>3

<211> 23

<212> DNA

<213>基因组序列

<220>

<223> 靶点序列的描述：xa23基因启动子区靶点序列

<400>3

ATGTTAGTGA GGCGGAAGGA AGG 23

<210>4

<211> 83

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：sgRNA序列

<400> 4

GTTTTAGAGC TAGAAATAGC AAGTTAAAAT AAGGCTAGTC CGTTATCAAC TTGAAAAAGT 60

GGCACCGAGT CGGTGCTTTT TTT 83

<210>5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 5

GGCAGTAGCT GATGTGAAGG GCG 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 6

AAACCGCCCT TCACATCAG CTAC 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 7

GGCATGTTAG TGAGGCGGAA GGA 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 8

AAACTCCTTC CGCCTCACTA ACA 23

<210>9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 9

CTCCGTTTTA CCTGTGGAAT CG 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 10

CGGAGGAAAA TTCCATCCAC 20

<210>11

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 11

CGGGAACACT GGGTACGT 18

<210>12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400>12

TTCAGAGGTC TCTCTCGACT AGTATGGAAT CGGCAGCAAA GG 42

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 13

AGCGTGGGTC TCGTCAGGGT CCATCCACTC CAAGCTC 37

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 14

TTCAGAGGTC TCTCTGACAC TGGAATCGGC AGCAAAGG 38

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 15

AGCGTGGGTC TCGACCGACG CGTATCCATC CACTCCAAGC TC 25

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 16

ACTCCGCGCC CTTCACATCA GCTACTTTCC GCTATTTCAA AGTATCCGTC 50

<210> 17

<211>50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400>17

CGGGAGGAAG ATGTTTCGGA GGATCCGCGC GGAAGGAGAA TATTGCGATG 50

<210> 18

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 18

TCCGAAACAT CTTCCTCCCG CATCACTATT CCGCCTCACT AACATCAGC 49

<210> 19

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 19

ACTCCTTCCT TCCGCCTCAC TAACATATGA CCCAACCGAC CACGAG 46

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 20

GGTAACGCCA GGGTTTTCC 19

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 21

CAGGAAACAG CTATGACC 18

<210> 22

<211>32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 22

CTATATATAT AGGCCCTGAA GGCTTAAACA GG 32

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 23

GAAGGGGAGG AGGAAGGGGG AGAAGAG 27

<210> 24

<211> 562

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 24

TGGAATCGGC AGCAAAGGAC GCGTTGACAT TGTAGGACTA TATTGCTCTA ATAAAGGAAG 60

GAATCTTTAA ACATACGAAC AGATCACTTA AAGTTCTTCT GAAGCAACTT AAAGTTATCA 120

GGCATGCATG GATCTTGGAG GAATCAGATG TGCAGTCAGG GACCATAGCA CAAGACAGGC 180

GTCTTCTACT GGTGCTACCA GCAAATGCTG GAAGCCGGGA ACACTGGGTA CGTTGGAAAC 240

CACGTGTGAT GTGAAGGAGT AAGATAAACT GTAGGAGAAA AGCATTTCGT AGTGGGCCAT 300

GAAGCCTTTC AGGACATGTA TTGCAGTATG GGCCGGCCCA TTACGCAATT GGACGACAAC 360

AAAGACTAGT ATTAGTACCA CCTCGGCTAT CCACATAGAT CAAAGCTGGT TTAAAAGAGT 420

TGTGCAGATG ATCCGTGGCA GTAGCTGATG TGAAGGGCGG TTTTAGAGCT AGAAATAGCA 480

AGTTAAAATA AGGCTAGTCC GTTATCAACT TGAAAAAGTG GCACCGAGTC GGTGCTTTTT 540

TTCAAGAGCT TGGAGTGGAT GG 562

<210> 25

<211> 562

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400>25

TGGAATCGGC AGCAAAGGAC GCGTTGACAT TGTAGGACTA TATTGCTCTA ATAAAGGAAG 60

GAATCTTTAA ACATACGAAC AGATCACTTA AAGTTCTTCT GAAGCAACTT AAAGTTATCA 120

GGCATGCATG GATCTTGGAG GAATCAGATG TGCAGTCAGG GACCATAGCA CAAGACAGGC 180

GTCTTCTACT GGTGCTACCA GCAAATGCTG GAAGCCGGGA ACACTGGGTA CGTTGGAAAC 240

CACGTGTGAT GTGAAGGAGT AAGATAAACT GTAGGAGAAA AGCATTTCGT AGTGGGCCAT 300

GAAGCCTTTC AGGACATGTA TTGCAGTATG GGCCGGCCCA TTACGCAATT GGACGACAAC 360

AAAGACTAGT ATTAGTACCA CCTCGGCTAT CCACATAGAT CAAAGCTGGT TTAAAAGAGT 420

TGTGCAGATG ATCCGTGGCA TGTTAGTGAG GCGGAAGGAG TTTTAGAGCT AGAAATAGCA 480

AGTTAAAATA AGGCTAGTCC GTTATCAACT TGAAAAAGTG GCACCGAGTC GGTGCTTTTT 540

TTCAAGAGCT TGGAGTGGAT GG 562

<210> 26

<211> 611

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 26

ACTCCGCGCC CTTCACATCA GCTACTTTCC GCTATTTCAA AGTATCCGTC TTCCTCCCTG 60

TCCACATGAG CTAAACGCTT CCTCTTCCCT GAGTCAAAGT CTTCCCTATA TTACTACTTT 120

GTATTATAGC TGGGTTCACT ATGTTGCATC ATCTCACAGC TAACCCGAAC ATCACTAACA 180

TCGCAATATT CTCCTTCCGC GCGGATCCTC CGAAACATCT TCCTCCCGCA TCACTATTCC 240

GCCTCACTAA CATCAGCTAC TATAAAAGCC CTTCCTTGTT GCATCATCTC AAGGAGCTGC 300

AAGCACTTCC TCTCTGGCAG CACTTCCTCA TCTCAAGGAG TTGCAAATGT TGCATCATCT 360

CAAGGAGCTG GCAGCCGTAG CCGGTATACA CATGATCCTC ATCTACCTCT GCCGCTTTCT 420

CCTCCGCCGC AGCCGCAACG TATTATTCAC CGTTTCCAAC AGCCTCCGTT TTCGCCTCAA 480

GGTATTAACT GTATTGTTGT ACATATGTCT CTCGGTCATG CTGTTCTACC TGTTTGGCTC 540

CATCATGCCG CTGCCGCCGT GGGGCCTCGT GGTCGGTTGG GTCATATGTT AGTGAGGCGG 600

AAGGAAGGAG T 611

Claims

1.一种通过基因编辑显著提高水稻抗白叶枯病水平的方法，其特征在于：利用CRISPR/Cas9基因编辑方法介导的同源重组修复方法，将AvrXa23结合位点的核酸片段替换到对白叶枯感病的栽培稻水稻中xa23基因上游的启动子区，赋予xa23基因在遭遇白叶枯病菌侵染时能激活表达的能力，从而提高水稻对白叶枯的抗性水平；所述的AvrXa23结合位点的核酸片段序列为EBE_AvrXa23序列，其中所述EBE_AvrXa23的序列为SEQ ID NO:1所示序列：TCCGAAACATCTTCCTCCCGCATCACTA；其中CRISPER/Cas9基因编辑靶序列为：SEQ ID NO:2所示序列：AGTAGCTGATGTGAAGGGCGCGG和/或SEQ ID NO:3所示序列：ATGTTAGTGAGGCGGAAGGAAGG；并且所使用的打靶载体采用双靶点的设计，以实现对水稻的xa23基因上游启动子区的如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示序列的2个靶位点进行同时切割。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：基因编辑中所使用的供体载体中待替换的AvrXa23结合位点的核酸片段序列前设计有酶切位点。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的酶切位点为BamHI酶切位点。

4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于：所述水稻是亚洲栽培稻和非洲栽培稻。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述水稻是亚洲栽培稻的籼稻品种。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述水稻是超优千号、湘两优900、隆两优1988、深两优136、晶两优华占、内香6优9号、泸优727及蜀优217。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述水稻是杂交稻组合超优千号、湘两优900、隆两优1988、深两优136、晶两优华占、内香6优9号、泸优727及蜀优217的亲本。