CN104388462A - 一种小麦转化双t超毒载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种小麦转化双T超毒载体及其应用。所述的双T超毒载体，是p1011-V，其序列如SEQ ID NO.7所示。本发明在现有的两个载体进行测序，将测序结果用计算机软件进行比对分析，利用同源重组(Homologous Recombination)技术将测序的两个载体加以改造，构建出一个新的适用于小麦遗传转化的新载体。使用该载体进行的小麦遗传转化，可以在得到的阳性植株的后代中筛选得到没有标记基因的转基因小麦，大大提高了转基因小麦的安全性，为转基因小麦的发展和推广做出了一定的贡献。

Description

一种小麦转化双T超毒载体及应用

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种小麦转化双T超毒载体。

背景技术

1、小麦的育种目标

小麦(Triticum aestivum)是世界上总产量仅次于玉米的第二大粮食作物，是人类的主食之一。随着人口的急剧增长、耕地面积的减少，提高小麦产量已成为全世界面临的一个严峻问题。普通小麦(AABBDD,2n＝42)是异源六倍体植物，属于禾本科小麦属普通小麦种(Triticumaestivum L.)，目前小麦育种的主要目标仍然是高产、抗逆和优质，分子标记辅助选择、外源优良基因的应用、多基因聚合是现代小麦育种研究热点(何中虎等,2006)。常规育种技术周期长，种植资源发掘利用不够，育种方法、手段在很大程度上依赖经验模式，而通过基因工程手段，向栽培植物导入抗逆性的外源基因，已发展成为改良植物抗胁迫的新途径。20世纪60至70年代，人们就效仿细菌转化方法开展了植物转基因的尝试。1983年，Zambryski首次用根癌农杆菌介导法获得第一例转基因植株，开创了植物转基因的先河，标志着植物转基因时代的到来(Zambryski et al.,1983)。1985年，Horsch等创立了农杆菌介导的“叶盘法”转基因系统，它大大简化了以往利用原生质体为受体的转基因体系，具有里程碑的意义(Horschet al.,1985)。1987年Sanford等发明了基因枪，该实验室Klein首次将其用于植物转基因研究(Klein et al.,1987)。它克服了当时农杆菌介导法的受基因型和受体种类的限制，开创了植物转基因方法的新领域。

2、小麦转化方法

目前，植物转基因技术已成为植物分子生物学研究的强有力的手段，更是功能基因组研究不可或缺的实验工具。小麦为异源六倍体植物，基因组大，基因调控困难，由小麦外植体所诱导的愈伤组织普遍存在成愈率低、愈伤胚性差、分化率低、转化细胞再生困难、基因型依赖性大等问题，是举世公认的最难转化的栽培作物。目前，小麦遗传转化体系中，所用的方法包括农杆菌介导法、基因枪转化法、花粉管通道法、显微注射法、激光微束穿刺法、PEG法和电击法等。但随着基因枪法和农杆菌法的不断改善，它们已逐渐成为小麦转化的主要方法。

3、农杆菌转化法

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。在植物基因工程的发展中，研究和应用比较清楚和成功的是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化。

农杆菌中存在一种环状、大小约为150～200kb的质粒(tumor-inducing plasmid,Ti质粒)，其上有一段T-DNA(transfer-DNA region)，是一种天然存在的遗传转化体系。由于Ti质粒的T-DNA携带生长素、细胞分裂素以及合成冠瘿碱等基因，使得被根癌农杆菌侵染过的植物组织产生冠瘿瘤，并合成大量冠瘿碱，冠瘿碱反过来促进根癌农杆菌的繁殖和Ti质粒的转移，从而扩大侵染范围。根据其诱导的植物细胞产生的冠瘿瘤的种类，可以分为3种类型：章鱼碱型(octopine type)、胭脂碱型(nopaline type)和农杆碱型(琥珀碱型)(agropine type)。Ti质粒上有两个主要区域，即T-DNA区域和vir区(vir-region)，此外，还具有质粒复制起点和冠瘿碱分解代谢酶基因位点。T-DNA区，又称T区(T-region)，是Ti质粒上可以整合进入植物基因组的DNA片段，决定冠瘿瘤的形态和冠瘿碱的合成。胭脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中的T-DNA的左右两侧是一段25bp的重复序列，构成了T-DNA的边界序列(border sequence)，分别为左边界(left border,LB)和右边界(right border,RB)，T-DNA依靠它们可以将携带的外源基因转移并整合至植物基因组中。由于转移方向是由左自右，右边界在T-DNA整合中对DNA结合位点的识别具有重要作用，因此右边界更为重要。vir区即毒性区，又称致瘤区域，长度约为35kb。它控制根癌农杆菌附着于植物细胞和Ti质粒进入细胞有关部位，与冠瘿瘤的形成有关。vir区位于T-DNA区左侧，包含6个毒性遗传位点：virA、virB、virC、virD、virE以及virG。vir基因决定了T-DNA的加工和转移过程。Onc基因(致癌)，其在植物细胞中编码细胞分裂素和植物生长素，导致受侵染的植物细胞无限增殖，此外，因T-DNA不含编码促进自身转移遗传物质的基因，故可将Onc基因等不必要序列敲除，替换以需要转化的目的基因，达到改良植物的目的。借助农杆菌的侵染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株，此即农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium-mediated transfermation)。

植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子，如羟基乙酰丁香酮(OH-AS)、乙酰丁香酮(AS)等酚类化合物。根癌农杆菌对这类酚类化合物具有趋化性，待附着于植物细胞表面后，其Ti质粒的vir基因被激活。virA基因编码感受蛋白，位于细菌细胞膜疏水区，可接受环境中的信号分子，被最先激活表达。virA基因被激活以后，又激活了virG基因的表达，virG蛋白经磷酸化转为活化状态，进而激活vir区其他基因的表达。另外，一些小分子量的糖类，如半乳糖、葡萄糖等，也能够诱导激活vir区基因的表达。virD基因产物virD1蛋白使得DNA从超螺旋转变为松弛型状态，virD2蛋白切割已松弛的T-DNA，使左右两边界产生缺口，T-DNA片段得以释放。此外，游离的virE2蛋白与游离的virD1/virD2-单链T-DNA核酸蛋白复合物结合，形成T-复合体，保护T-DNA不被植物细胞内的核酸酶降解。T-复合体经预先形成的virB蛋白通道，依次穿过根癌农杆菌及植物细胞的细胞壁和细胞膜，并在virD蛋白的导向作用下，进入受体细胞核，最终整合进入植物基因组中。

1983年，第一株以农杆菌介导的转基因烟草问世(Zambryski et al.,1983；喻修道等,2010)。农杆菌转化法简单、低廉且高效，很快成为了双子叶植物基因转化的主导方法。但由于小麦是单子叶植物，不是农杆菌的天然宿主，故能否将该方法引入至小麦等单子叶植物成为了上世纪90年代的研究热点。Cheng等(1997)首次利用农杆菌介导法转化以小麦幼胚、预培养幼胚及胚性愈伤组织为受体材料，获得了具有分子生物学证据的、稳定的转基因小麦，并初步建立了一套以小麦幼胚及胚性愈伤组织为受体的技术体系。随后，农杆菌介导的小麦转化在其它实验室纷纷取得成功：Xia等(1999)以小麦幼胚及胚性愈伤组织为受体，利用农杆菌介导法，成功获得转基因小麦植株；王永勤等(2002)则采用携带了gus和(或)bar基因的双元表达载体的3种不同农杆菌菌株对农大170和农大146的幼胚和胚性愈伤组织进行了转化，得到大量具有PPT(草胺膦)抗性的愈伤和植株，其中，抗性愈伤的GUS染色阳性率高达50％-60％，对抗性植株进行PCR和Southern检测证明，外源基因已成功整合到植物基因组中；王翠亭等(2003)利用携带pC3301质粒的超毒农杆菌EHA105对扬麦158进行了转化，从294个小麦幼胚外植体中得到了5株成苗，经PCR和Southern blot分析，其中2株成苗整合了外源DNA，转化率为0.68％。

农杆菌介导法的优点：(1)成功率高，效果好。该转化系统是模仿或称之为利用天然的转化载体系统，不管是用菌株接种整体植物的伤口，还是直接侵染离体培养细胞，通常都可以获得满意的转化；(2)在所有的转化系统中，Ti质粒转化系统是机理研究得最清楚的，方法最成熟，应用也最广泛；(3)Ti质粒的T-DNA区可以容纳相当大的DNA片段插入，目前已把长达50kb的异源DNA序列通过T-DNA完整地转移到植物细胞中；(4)T-DNA上含有引导DNA转移和整合的序列，以及能够被高等植物细胞转录系统识别的功能启动子和转录信号，使插入到T-DNA区的外源基因能够随同T-DNA一道在植物细胞中表达；(5)可根据人们的需要连接不同的启动子，使外源基因能够在再生植株的各种器官中特异性表达，例如在果实中表达，在叶中表达，甚至仅在根中表达，即可进行人为地控制；(6)农杆菌Ti质粒转化系统转化的外源基因以单拷贝为多数，遗传稳定性好，并且多数符合孟德尔遗传规律，因此转基因植株能较好地为育种提供了中间选育材料。

根癌农杆菌Ti质粒载体系统作为一个植物基因转化载体系统的不足之处是它主要用于双子叶植物，大多数单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，如何改进农杆菌介导的转化系统，扩大其应用范围，一直是人们所关心问题。

4、筛选标记基因

转基因过程中只有少数植物细胞能够吸收外源DNA并整合进植物细胞中，而大多数细胞仍然是未转化的(侯爱菊等，2003)，因此研究者在受体植物中加上选择性标记用于提高转化效率。但是这些筛选标记在转化后一直保留在植物体内，存在安全隐患。常用的主要的筛选标记基因是抗生素和除草剂抗性标记基因(张楠，2007)。利用这些标记基因的选择体系存在的潜在危害主要表现在以下几个方面:①转基因作物中的除草剂抗性基因可能经自然杂交传递到近缘野生杂草中，使现有的除草剂无法将杂草杀掉；②标记基因扩散到环境中，可能造成生态失衡；③转基因食品中的标记基因及其产物可能对人或动物的健康有害；④标记基因可能被转移到人或动物肠道寄生菌中而产生耐药性，从而降低或丧失某种抗生素的治疗作用(王洪伟，2014)。

解决筛选标记带来的安全隐患有两方面：一是在转基因后代中去除标记基因，二是开发安全的筛选标记基因。

目前去除标记基因的方法主要有：共转化体系，位点特异性重组体系，转座子系统，同源重组体系。所谓的共转化是指将不同的外源基因分别构建到不同的载体或同一载体的不同区段,将多种载体同时转人同一受体细胞,筛选出共转化植株。一种是转化所用的农杆菌细胞含有两个载体,分别携带目的基因和筛选标记；第二种是一个质粒含有两段T-DNA；第三种是将基因构建到不同的质粒，独立转化到不同的农杆菌中，将这几种菌液以一定的比例混合获得转化植株(陈扬勋，2012)。定点重组系统是利用重组酶催化两个短的、特定的DNA序列间发生重组,以去除选择标记基因的遗传操作系统。每个重组系统都由2个主要组分组成:重组酶和特异性识别位点。其基本原理就是将选择标记基因置于特异性识别位点之内而将目的基因置于其外。当转基因植株同时或分别引入重组酶基因时,重组酶就会切除、颠倒或交换特异性识别位点内的DNA片段。转座子是指一段特定的DNA序列,它可以在染色体组内移动,从一个位点切除,插入到一个新的位点。把标记基因和目的基因分开,子代植株通过遗传分离,获得仅带目的基因的转基因植株。基于以上原理,转座子系统可被开发用于转化系统来培育安全的、无标记基因的转基因植株。同源重组在理论上就是在没有重组酶活性的情况下,将标记基因置于重复序列之间,通过重复序列的同源重组作用去除标记基因转座子相连,在转座子和标记基因或目的基因一起移动的过程中,标记基因和目的基因分开,子代植株通过遗传分离,获得仅带目的基因的转基因植株。基于以上原理,转座子系统可被开发用于转化系统来培育安全的、无标记基因的转基因植株(倪斌，2007)。另外不同于传统的细胞核转基因技术的叶绿体基因工程也可以解决转基因植物标记基因安全的。叶绿体基因工程是以叶绿体基因组为平台对植物进行遗传操作，通过一定方法是外源基因穿过细胞膜和叶绿体双层膜进入叶绿体，在同源重组片段的介导下与叶绿体基因组之间发生同源重组，以定点整合方式进入叶绿体基因组，在其中转录翻译并获得终产物的技术。尤其可以防止外源基因通过花粉扩散到非目标植物中，造成基因污染。原因是大多数植物的叶绿体基因组遵循母性遗传机制，导入叶绿体基因组的外源基因基本不会通过花粉扩散，从而可以保证环境的安全性。

安全的筛选标记有：1.化合物解毒酶基因：这种标记基因编码的产物是酶，可催化对细胞生长有毒的化合物转变成无毒的化合物，从而使转化细胞能在含有毒化合物的培养基上生长，而非转化细胞则被杀死。例如：甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因。2.糖类代谢酶基因：PMI基因。3.绿色荧光蛋白基。4.天门冬氨酸激酶

5、同源重组技术

同源重组(Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体(sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或Holliday结构(Holliday Juncture Structure)的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday结构的拆分。同源重组可以双向交换DNA分子，也可以单向转移DNA分子，后者又被称为基因转换(Gene Conversion)。由于同源重组严格依赖分子之间的同源性，因此，原核生物的同源重组通常发生在DNA复制过程中，而真核生物的同源重组则常见于细胞周期的S期之后。

基因重组分为同源重组和位点专一性重组。同源重组是更为普遍的一种重组机制，它可以发生在任何两种具有相同或相似序列之间，涉及到两个DNA分子在相同区域的断裂和重新连接。将生物细胞内的这种重组机制拿到生物细胞外进行运用，只要有同源序列我们就可以对任意的载体或序列进行改造。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明将现有的用于小麦遗传转化的载体以及用于水稻遗传转化的双T载体测序，将测序结果用计算机软件进行比对分析，利用同源重组(Homologous Recombination)技术将测序的两个载体加以改造，构建出一个新的适用于小麦遗传转化的新载体。使用该载体进行的小麦遗传转化，可以在得到的阳性植株的后代中筛选得到没有标记基因的转基因小麦，大大提高了转基因小麦的安全性。

本发明所述的小麦转化双T超毒载体，其结构如图3所示，其序列如SEQ ID NO.7。是以pYH592为骨架，在pVS1-STA与T-DNA left border之间插入VirG而获得。

本发明利用同源重组技术获得了用于小麦转基因的含有两段T-DNA的超毒载体1个。

本发明所获得的小麦转化用载体，能够将筛选标记和目的基因分别插入不同的T-DNA中，使其在后代染色体重组的过程中，筛选得到只含有目的基因的转基因小麦，成功的去除掉筛选标记带来的转基因安全问题，为转基因小麦的发展和推广做出了一定的贡献。

附图说明

图1.VirG区和载体克隆产物。

(M1：DL5000，M2：DL15000，1：PCR载体产物，2：PCR基因产物)。

图2.菌落PCR产物。

(M：DL5000；1、2：PCR扩增得到的DNA片段)。

图3.本发明p1011-V质粒图谱。

图4.BanH I,Kpn I双酶切结果。

(M1:15000,M2:DL2000,1:质粒pYH592，2、3、4：质粒pYH592双酶切，5：质粒ZmXERICO,6、7、8:质粒ZmXERICO双酶切)

图5.连接产物转化大肠杆菌菌落PCR结果。

(M：DL2000,1、2、3：菌落PCR产物)

图6.p1011-V-ZmXERICO转化扬麦14的再生苗。

具体实施方式

实施例1：

一、实验材料

质粒pYH592(于恒秀,无抗性选择标记转基因软米和糯稻新品系的选育及中间试验,作物学报,2009,35(6):967-973)，pYN203(高营营，2013)(高营营，抗性相关基因转化小麦的研究[D],扬州大学，2013),DH5α大肠杆菌感受态,同源重组酶：Exnase TM II(Vazyme)

二、质粒DNA的提取

(1)分别挑取含pYH592以及含pYN203的阳性菌落接种于含有卡那霉素的2ml 2×YT液体培养基中，37℃摇菌12～16h。

(2)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中加入500ul的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中

(3)取1-5ml菌液，加入离心管中，4℃，12000rpm离心1min，尽量吸除上清。

(4)向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液P1，使用移液器彻底悬浮菌液。

(5)向离心管中加入250ul溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

(6)向离心管中加入350ul溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min。

(7)取上清液转移到吸附柱CP3中，尽量不要吸出沉淀，12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

(8)向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

(9)重复操作步骤8。

(10)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心2min,将吸附柱中残余的漂洗液去除。

(12)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100ul洗脱缓冲液EB，室温放置2min,12000rpm离心2min将质粒溶液pYH592和pYN203收集到1.5ml的离心管中。

三、分析序列，设计同源引物

根据同源重组技术的要求，针对载体和目的片段两端的序列分别设计两对引物。一对是VirG区克隆引物：VirG-F:CATTACGCCATGAACAATTGTAGAAACGCAAA(SEQ ID NO.1)

VirG-R:CCAGCGGCGGCGCTCATGCAAGTAGCGTATG(SEQ ID NO.2)

其从质粒YN203上扩增得到长度为1331bp的片段(VirG),其序列如SEQ ID NO.5所示。

另一对是载体克隆引物：

pYH592-F:GAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATG(SEQ ID NO.3)

pYH592-R:TTGTTCATGGCGTAATGTCTCCGGTTC(SEQ ID NO.4)

其从pYH592上扩增长度为12448bp的载体，其序列如SEQ ID NO.6所示。

四、PCR扩增

用PhantaTM Super Fidelity DNA Polymerase(Vazyme,P501-01)，VirG-F、VirG-R为引物，从质粒YN203上扩增1331bp的VirG片段，其扩增后的电泳结果见图1，胶回收备用。其扩增体系和扩增程序见表1和表2。

表1 VirG片段PCR反应体系

表2 VirG片段PCR反应程序

用LAmp^TM DNA Polymerase(Vazyme，P301-d1)，pYH592-F、pYH592-R为引物从pYH592上扩增12448bp的载体，扩增后电泳结果见图1，胶回收备用。其扩增体系和扩增程序见表3和表4。

表3载体片段PCR反应体系

表4载体片段PCR反应程序

五、同源重组反应

根据表5配制同源重组反应体系，37℃，30分钟。然后置于冰水浴中5分钟。转化感受态大肠杆菌DH5α，菌液离心浓缩后全部涂板。37℃培养箱中，倒置培养过夜。挑23个单菌落分别溶于20μl LB培养液中，各取1μl菌液作为菌落PCR鉴定的模板，同时带一个模板空白对照，菌落PCR鉴定的程序同表2，鉴定得到的阳性菌液就是含有p1011-V质粒的菌液，其电泳结果见图2。得到的阳性菌液送生物公司测序，测序结果再次验证了阳性菌液里含有VirG，根据测序结果绘制出p1011-V的质粒图谱见图5。p1011-V的序列如SEQ ID NO.7所示。

表5同源重组体系

其中，步骤五中用到的感受态DH5α的制备和转化如下：

氯化钙法制备感受态细胞(Bio Basic,No.BS525)

(1)取少量冻存菌株大肠杆菌(E.coli)DH5α，在LB平板培养基上进行划线培养，恒温培养箱(37℃)中培养16～20h。

(2)挑取一个单菌落，接种于含2ml SOB培养液中，恒温摇床(37℃,250rpm/min)上培养12～16h。

(3)接种1ml的培养物到500ml锥形瓶中(内含100ml SOC培养液)，恒温摇床(37℃,250rpm/min)上培养至OD600≈0.35。

(4)迅速将培养物置于冰浴中20min，期间缓慢摇匀使内容物充分均匀冷却。同时将2个50ml离心管置于冰上预冷，为下一步做准备。

(5)将细菌转移至预冷的离心管中，4℃，4000rpm离心15min，弃去上清。

(6)用16ml的溶液A小心的悬浮细菌，冰上放置15min。

(7)4℃，4000rpm离心15min，收集菌体。

(8)用4ml溶液B重新悬浮细菌，分装，80μl/管，液氮速冻，-70℃保存。

(9)用于转化时，将100pg到10ng DNA加到感受态细胞(冰上溶解)中。

(10)细胞和DNA混合物冰上放置30min，然后37℃培养5min或42℃培养90s，然后再次冰上放置2min。

(11)加入1ml SOC培养基，37℃温和摇动培养1h。

(12)在选择性培养基上涂布培养细胞，恒温培养箱(37℃)中培养12～16h。

实施例2：本发明载体的应用

从郑单958(有市售)中，以ZeaXERICO-5-0：ATGGGCATCTCGAGCATGCCGG(SEQ ID NO.8)，ZeaXERICO-3-END：TCAGGCAATCCGGGGCACCTCG(SEQ ID NO.9为引物克隆出一个与抗旱相关的基因ZmXERICO，长度为438bp，其序列如SEQ ID NO.10所示。

在该基因两头分别加上BamHⅠ和KpnⅠ的酶切位点，用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切p1011-V,以及加了酶切位点的ZmXERICO。酶切后用1％的琼脂糖胶跑电泳，电泳图如图4。胶回收酶切后的ZmXERICO以及p1011-V,按照表6的体系连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，在含有卡那霉素的培养基上删选得到的阳性菌落即含有p1011-V的部分，挑取单菌落，利用引物ZeaXERICO-5-0与ZeaXERICO-3-END进行菌落PC人，菌落PCR验证结果见图5。至此我们已经成功的将ZmXERICO构建到本发明的载体上去，命名为p1011-V-ZmXERICO。提取质粒p1011-V-ZmXERICO转入农杆菌感受态EHA105中，备用。

表6 T4 DNA连接反应体系

将含有质粒p1011-V-ZmXERICO的农杆菌培养至OD600的值在0.5的浓度，与培养10天的扬麦14幼胚的愈伤组织共培养30min，后通过组织培养的方法，筛选分化生根，现已获得170株再生苗(图6)。

Claims (3)

1.小麦转化用的双T超毒载体p1011-V，其特征在于其序列如SEQ ID NO.7所示。

2.如权利要求1所述的双T超毒载体p1011-V，其特征在于，是以pYH592为骨架，在pVS1-STA与T-DNA left border之间插入VirG而获得，所述VirG的序列如SEQ ID NO.5所示。

3.权利要求1所述的双T超毒载体p1011-V在小麦转化中的应用，是筛选得到只含有目的基因的转基因小麦，去除掉筛选标记。