CN103898135B - 一种优化的获得无选择标记转基因生物的双t-dna表达载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种优化的获得无选择标记转基因生物的双T-DNA表达载体及其应用。本发明提供的双T-DNA载体A，为将双T-DNA区域插入表达载体中上得到的载体；所述双T-DNA区域包括两个独立T-DNA区域：T-DNA区域A和T-DNA区域B；所述T-DNA区域A的右边界A和所述T-DNA区域B的右边界相邻，且所述T-DNA区域A的左边界A和所述T-DNA区域B的左边界相离。本发明的实验证明，本发明构建的双T-DNA质粒两个T-DNA区的右边界在质粒环中相互靠近，形成头对头的结构（LB-RB-RB-LR型），以期避免在转录的时候形成通读，降低转化基因与选择标记基因的连锁比例，从而提高T1代分离出无选择标记转基因株系几率，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种优化的获得无选择标记转基因生物的双T-DNA表达载体及其应用。
背景技术
植物转基因技术自1983年问世以来，得到了长足的发展，它可以打破不同物种之间生物隔离，使物种之间的基因交流成为可能，让转基因作物向需要的方向发展。目前研究人员已发现多种不同的转基因方法，如农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电激法、显微注射法、脂质体法等(SawahelWA,etal.1992.BiotechAdvances.10:393-412)。利用这些转化方法将外源目的基因导入到植物细胞时，通常只有部分细胞可以成为稳定的转化细胞，选择标记基因的应用使转化细胞在相应的选择压力下仍可继续存活并分化成植株，而非转化细胞将死亡（DaleEC,etal.1991.ProcNatlAcadSciUSA.88:10558-10562）。然而，选择标记基因及其蛋白产物毕竟不是基因工程的目的产品，从而引发有关转基因植物安全的许多问题。主要有以下几点：一是抗生素类基因编码产物可能对人类或动物有潜在的毒性或致敏性；二是标记基因有可能会通过不同的途径在物种间传播，威胁生态环境，包括转基因作物导致杂草问题、产生病毒或加重病害对非目标生物的影响。此外，选择标记基因的存在还限制了转基因作物的进一步改良，当转基因植物中已存在某一选择标记基因时，该基因在随后的再次转化中就不能再作为选择标记，这样便给植物再次导入外源基因带来一定的限制。而由于目前可供利用的选择标记基因为数甚少，不可能每次转化都更换新的选择标记基因，重复转化将难以实现。因此，建立无选择标记植物转化系统，培育无选择标记的转基因植物将从根本上解决这个问题（DekeyserR,etal.1989.PlantPhysiol.90:217-223），且无论是从安全性考虑，还是从转基因技术本身考虑均具有着重要的意义。
无选择标记转基因植物的研究和培育已成为国际上植物基因工程领域的一个趋势。迄今，已有一些方法可获得不带选择标记基因的转化植物，主要的有转座子成份介导法，位点特异性重组系统介导法及共转化方法等（YoderJI,etal.1994.Bio/Technology,12:263-267）。目前有人对传统的T-DNA共转化方法做了功能改进，发明了一种获得无选择标记转基因植物的专用载体，Chen等（SongbiaoChen,etal.2004.PlantCellRep,23:625-631）利用上述载体构建了含有GUS基因的植物表达载体pCDTGNGUS，通过农杆菌介导法转化烟草。T0代共转化频率为53.6%，对共转化T1代转基因株系的遗传分析表明，41.4%的株系发生基因分离，产生无选择标记转基因植株，但T1代18个株系中有6株系（33.3%）均成双TDNA插入连锁，影响了后代分离比。分析原因为该载体由于两个T-DNA区相靠近，两个T-DNA区的双边界为顺势（边界型为LB-RB-LB-RB型），可能在转录的时候形成通读，导致两个T-DNA连锁插入同一位点，严重降低了后代分离标记基因。因此建立一种高效的获得无选择标记转基因植物培育体系具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种双T-DNA载体A。
本发明提供的双T-DNA载体A，包括双T-DNA区域，所述双T-DNA区域依次包括TDNA区域A和T-DNA区域B；所述T-DNA区域A依次包括左边界A、选择标记基因表达盒和右边界A；所述T-DNA区域B依次包括右边界B、第二个MAR、用于插入目的DNA的多克隆位点、第一个MAR和左边界B；所述T-DNA区域A的右边界A和所述T-DNA区域B的右边界B相邻。
上述双T-DNA载体A中，所述选择标记基因和所述目的DNA的转录方向相反。
上述T-DNA区域A的左边界A和所述T-DNA区域B的左边界B相背离。
上述选择标记基因表达盒包括启动子、选择标记基因和终止子。
上述MAR(matrixattachmentregion，MAR)序列是一段核基质结合序列，置于外源表达结构的两侧可提高外源基因表达的水平，或明显减少了外源基因在转基因植株间的表达差异。利用MARs来稳定、提高外源基因的表达是克服外源基因失活的一种有效方法。
上述双T-DNA载体A中，所述选择标记基因为新霉素磷酸转移酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、潮霉素磷酸转移酶编码基因、膦丝菌素乙酰转移酶基因或5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因；所述选择标记基因具体为潮霉素磷酸转移酶编码基因或新霉素磷酸转移酶基因；
所述用于插入目的DNA的多克隆位点依次包括HindIII、SphI、PstI、XbaI、BamHI、SmaI、SacI、EcoRI。
上述双T-DNA载体A为如下1）或2）：
1）所述的双T-DNA载体A（pDTmar-hyg）中的双T-DNA区域依次包括所述左边界A、终止子CaMV35SpolyA、所述潮霉素磷酸转移酶编码基因和启动子35S、所述右边界A、所述右边界B、所述第二个MAR、所述用于插入目的DNA的多克隆位点、所述第一个MAR和所述左边界B；1）所述的双T-DNA载体A中的双T-DNA区域的核苷酸序列具体为序列表中的序列1；
上述终止子CaMV35SpolyA、潮霉素磷酸转移酶编码基因和启动子35S构成选择标记基因表达盒；
2）所述的双T-DNA载体A（pDTmar-npt）中的双T-DNA区域依次包括所述左边界A、nos终止子、所述新霉素磷酸转移酶基因和nos启动子、所述右边界A、所述右边界B、所述第二个MAR、所述用于插入目的DNA的多克隆位点、所述第一个MAR和所述左边界B。2）所述的双T-DNA载体A中的双T-DNA区域的核苷酸序列具体为序列表中的序列2。
上述nos终止子、所述新霉素磷酸转移酶基因和nos启动子构成选择标记基因表达盒。
上述1）所述的双T-DNA载体A按照如下方法制备：将含有所述T-DNA区域B的片段插入含有所述T-DNA区域A的表达载体中，且使所述T-DNA区域A的右边界A和所述T-DNA区域B的右边界相邻；所述含有所述T-DNA区域B片段的核苷酸序列具体为序列表中序列1自5’末端第2744-5527位核苷酸；所述含有所述T-DNA区域A的表达载体具体为pC1300LacZ-；具体为将序列表中序列1自5’末端第2744-5527位核苷酸插入pC1300LacZ-载体的SphI酶切位点间得到的载体pDTmar-hyg；
2）所述的双T-DNA载体A按照如下方法制备：将新霉素磷酸转移酶基因（nptII）表达盒替换掉1）所述的双T-DNA载体A中潮霉素磷酸转移酶编码基因表达盒得到的载体；所述潮霉素磷酸转移酶编码基因表达盒包括终止子CaMV35SpolyA、所述潮霉素磷酸转移酶编码基因和启动子35S。具体为将新霉素磷酸转移酶基因（nptII）表达盒取代1）所述的双TDNA载体A的XhoI/PmeI酶切识别位点间的小片段（潮霉素磷酸转移酶编码基因表达盒）得到的重组载体pDTmar-npt。
上述新霉素磷酸转移酶基因（nptII）表达盒按照如下方法获得：EcoRI和ClaI(NEB)双酶切质粒pCASmGFPt，收集2298bp的酶切产物，即得到新霉素磷酸转移酶基因（nptII）表达盒。
本发明的另一个目的是提供一种DNA片段。
本发明提供的DNA片段，为上述双T-DNA载体A中的双T-DNA区域。
本发明的第三个目的是提供一种双T-DNA载体B。
本发明提供的双T-DNA载体B，为将目的DNA插入上述的双T-DNA载体A的用于插入目的DNA的多克隆位点得到的载体。
上述目的DNA以目的基因表达盒的形式插入；
所述目的基因表达盒具体为绿色荧光蛋白基因表达盒或5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表达盒；
所述绿色荧光蛋白基因表达盒进一步具体包括CaMV35S启动子、绿色荧光蛋白基因mgfp5和nos终止子组成；所述绿色荧光蛋白基因表达盒的核苷酸序列进一步具体为序列表中的序列3；
所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表达盒进一步具体包括P-Ubi启动子、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因和nos终止子；所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表达盒的核苷酸序列进一步具体为序列表中的序列4。
上述双T-DNA载体B具体为pDTgfp-npt和pDTepsps-hyg；
载体pDTgfp-npt为将序列表中序列3所示的绿色荧光蛋白基因（mgfp5)表达盒插入pDTmar-npt载体的SmaI酶切位点间得到的载体。
载体pDTepsps-hyg为将序列表中序列4所示的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表达盒插入pDTmar-hyg的SmaI和SbfI酶切位点间得到。
上述的双T-DNA载体A或上述的DNA片段或上述的双T-DNA载体B在抑制双T-DNA插入植物基因组发生连锁中的应用也是本发明保护的范围；上述应用中，所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物进一步具体烟草，所述单子叶植物进一步具体为水稻。
上述的双T-DNA载体A或上述的DNA片段或上述的双T-DNA载体B在培育无选择标记转基因植物中的应用也是本发明保护的范围；上述应用中，所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物进一步具体烟草，所述单子叶植物进一步具体为水稻。
选择标记基因可以包括任何适用于遗传转化的选择标记基因，例如新霉素磷酸转移酶（neomycinphosphotransferase-II，Npt-II）基因、氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicolacetyltransferase，Cat）基因、二氢叶酸还原酶（Dihydrofolatereductase，DHFR）基因、潮霉素磷酸转移酶（hygromycinphosphotransferase，Hpt）基因、膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinothricin-N-acetyltransferase，Bar）基因和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPs）基因等；目的基因可以包括任何在生产上有应用价值的基因，如抗虫基因、抗病基因、抗除草剂基因、抗衰老基因、抗逆基因、品质改良等基因以及由上述基因组成的融合或多价基因。所述目的基因的启动子可以包括组成型启动子、器官特异性启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或者由启动子和调控元件组成的复合启动子。
上述植物包括双子叶植物和单子叶植物，如烟草、棉花、大豆、花生、番茄、辣椒、油菜或白菜，以及水稻、小麦、玉米、高梁、大麦、燕麦或黑麦等。当所述植物为烟草时，所述优化的双T-DNA植物表达载体为pDTmar-npt。当所述植物为水稻时，所述优化的双T-DNA植物表达载体为pDTmar-hyg。
定义
“植物表达载体”是指能驱动目的基因在植物体内表达的载体。
“Ti质粒”是根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）中的一种双链环状DNA分子，一般具有T-DNA区（transferred-DNAregions）、毒性区（virulenceregion）、质粒复制起点（originofreplication）和质粒结合转移位点（regionsencodingconjugation）。在农杆菌侵染植物细胞时，T-DNA区在毒性区的激活下能从Ti质粒上转移并整合到植物染色体中。Ti质粒载体系统目前被广泛应用于植物基因工程领域。
“T-DNA”是根癌农杆菌内Ti质粒上的一段能从质粒上转移并整合到寄主植物基因组中的DNA，即transferredDNA。T-DNA两端各有一段长约25bp的边界序列（bordersequence），分别称为左边界（LB）和右边界（RB）。边界序列的存在是T-DNA保留转移特性的必需元件。当保留T-DNA的边界序列时，以目的基因取代野生型T-DNA的部分基因组后，改造后的T-DNA仍能进入植物细胞并整合到植物染色体组中。T-DNA在受体植物染色体上的整合位点是随机的。目前，在植物基因工程应用中，野生型根癌农杆菌T-DNA中的致瘤基因被外源目的基因和选择标记基因替换，仅保留边界序列。
“基因”是指编码一种特定蛋白的全部或部分的核酸片段，并包括该编码区前面（5’非编码区）和后面（3’非编码区）的调控序列。
“外源基因”是指正常情况下宿主生物中没有的、通过基因转移导入的基因；也可指正常存在于宿主生物中的，但又被重新导入其基因组中其天然基因座之外的另一基因座的基因，这种变化会导致一种内源基因的编码序列的一个或几个额外拷贝的出现。
本发明的实验证明，本发明在前期工作的基础上，创造性的改变了双T-DNA在表达载体中的排列方向，使构建的双T-DNA质粒两个T-DNA区的右边界在质粒环中相互靠近，形成头对头的结构（LB-RB-RB-LR型），以期避免在转录的时候形成通读，降低转化基因与选择标记基因的连锁比例，从而提高T1代分离出无选择标记转基因株系几率，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为中间载体pC1300LacZ-的物理图谱
图2为中间载体pCDMAR-hyg的物理图谱
图3为优化后的双T-DNA植物载体pDTmar-hyg的物理图谱
图4为优化后的双T-DNA植物载体pDTmar-hyg的双T-DNA区域的线性结构
图5为中间载体pCASmGFPt的物理图谱
图6为优化后的双T-DNA植物载体pDTmar-npt的物理图谱
图7为优化后的双T-DNA植物载体pDTmar-npt的双T-DNA区域的线性结构
图8为中间载体pSPmGFP5的物理图谱
图9为整合目的基因gfp的优化后的双T-DNA表达载体pDTgfp-npt的物理图谱
图10为整合基因epsps的未优化载体pCDepsps-hyg的物理图谱
图11为整合基因epsps的优化后载体pDTepsps-hyg的物理图谱
图12为整合目的基因gfp的未优化的双T-DNA表达载体pCDgfp-npt的物理图谱
图13为转整合gfp基因的优化及未优化载体T0代烟草植株PCR分析的电泳图谱
图14为转整合gfp基因的优化及未优化载体T1代烟草植株PCR分析的电泳图谱
图15为转整合epsps基因的优化及未优化载体T0代水稻植株PCR分析的电泳谱
图16为转整合epsps基因的优化及未优化载体T1代水稻植株PCR分析的电泳图谱
图17为载体pCDmar-npt的物理图谱
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例构建过程中质粒提取、酶切、DNA的回收、纯化均按分子克隆中的方法进行(分子克隆：实验室手册,Sambrooketal,NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)。
实施例1、双T-DNA植物载体pDTmar-hyg和pDTmar-npt的构建
一、双T-DNA植物载体pDTmar-hyg的构建
1、中间载体pC1300LacZ-的获得
EcoRI和HindIII（NEB）双酶切pCAMBIA1300（RobertsC,etal.1994.PlantMol.Biol.25(6):989-994；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得），收集8907bp的载体骨架，然后用Klenow(NEB)补平载体骨架的酶切位点，自连，获得无多克隆位点的中间载体pC1300LacZ-（载体示意图如图1）。
2、双T-DNA植物载体pDTmar-hyg获得
以载体pCDMAR-hyg（载体示意图如图2，DREB基因双T-DNA植物表达载体的构建及验证，分子植物育种，2004，2（1），7-12；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得）为模板，以primer-1:5-tgcaggatatcactgaacgtcagaagccgactgc-3,primer-2:5-tgcaggatatcatccaacccctccgctgctata-3（下划线为EcoRV酶切位点）为引物进行PCR扩增，得到2774bp的PCR产物（序列表中序列1自5’末端第2744-5527位核苷酸），其含有双MAR序列(LiXG,etal.2001.ScienceinChina(seriesC)44:400-408)、多克隆位点、选择标记基因潮霉素磷酸转移酶编码基因的表达盒的T-DNA片段结构域。
用EcoRV酶切上述PCR产物，回收2753bp酶切片段；用SphI(NEB)酶切pC1300LacZ-载体，回收8907bp载体骨架；用T4DNA聚合酶(NEB)削平载体骨架的SphI酶切位点，得到平末端载体骨架；将2753bp酶切片段与平末端载体骨架连接，得到重组载体；
将多个PCR鉴定为阳性的克隆进行测序分析，获得插入方向正确的重组载体，命名为pDTmar-hyg（载体结构示意图如图3所示）。经过测序，载体pDTmar-hyg为将序列表中序列1自5’末端第2744-5527位核苷酸插入pC1300LacZ-载体的SphI酶切位点间得到的载体，该载体包括双T-DNA区域1，该区域的核苷酸序列为序列表中序列1所示，结构示意图如图4所示。
双T-DNA区域1依次包括两个独立T-DNA区域：T-DNA区域A-1和T-DNA区域B；TDNA区域A-1依次包括左边界A、终止子CaMV35SpolyA、潮霉素磷酸转移酶编码基因Hpt和启动子35S；T-DNA区域B依次包括右边界B、第二个MAR、用于插入目的基因的多克隆位点、第一个MAR和左边界B；T-DNA区域A-1的右边界A和T-DNA区域B的右边界相邻，且T-DNA区域A-1的左边界A和T-DNA区域B的左边界相离（即右臂相邻）。
选择标记基因潮霉素磷酸转移酶编码基因（hygromycinphosphotransferase，Hpt）表达盒包括启动子35S、基因Hpt和终止子CaMV35SpolyA；
上述用于插入目的基因的多克隆位点依次包括HindIII、SphI、PstI、XbaI、BamHI、SmaI、SacI、EcoRI；
双T-DNA区域1各部分的核苷酸序列如下所示：序列1自5’末端第1-26位核苷酸为左边界A；自5’末端第76-292位核苷酸为选择标记基因潮霉素磷酸转移酶编码基因表达盒的终止子T-nos；自5’末端第320-1342位核苷酸为选择标记基因潮霉素磷酸转移酶编码基因；自5’末端第1378-2147位核苷酸为选择标记基因潮霉素磷酸转移酶编码基因表达盒的启动子35S；自5’末端第2653-2678位核苷酸为右边界A；自5’末端第2893-2919位核苷酸为右边界B；自5’末端第2965-3712位核苷酸为第二MAR；自5’末端第3928-3985位核苷酸为用于插入目的基因的多克隆位点；自5’末端第4248-5110位核苷酸为第一MAR；自5’末端第5385-5410位核苷酸为左边界B。
二、双T-DNA植物载体pDTmar-npt
EcoRI和ClaI(NEB)双酶切质粒pCASmGFPt（载体结果示意图如图5，中国科学院博士研究生学位论文“一种转录后基因沉默机制的研究”，刘翔，2004年，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得），收集2298bp的酶切产物，该酶切产物包括新霉素磷酸转移酶基因（nptII）表达盒；新霉素磷酸转移酶基因（nptII）表达盒包括nos启动子、新霉素磷酸转移酶基因（nptII）和nos终止子。
将2298bp的酶切产物用Klenow酶(NEB)补平EcoRI、ClaI酶切位点，得到平末端酶切产物；再将pDTmar-hyg用XhoI/PmeI酶切，收集9327bp的载体骨架，用Klenow酶(NEB)补平载体骨架的XhoI酶切位点，得到平末端载体骨架；将平末端酶切产物和平末端载体骨架链接，得到双T-DNA载体pDTmar-npt（为将新霉素磷酸转移酶基因（nptII）表达盒取代pDTmar-hyg的XhoI/PmeI酶切识别位点间的小片段（潮霉素磷酸转移酶编码基因表达盒）得到的重组载体pDTmar-npt）。
将多个PCR鉴定为阳性的克隆进行测序分析，获得插入方向正确的重组载体，命名为pDTmar-npt（载体结构示意图如图6所示）。经过测序，载体pDTmar-npt包括双T-DNA区域2，该区域的核苷酸序列为列表中序列2所示，结构示意图如图7所示。
双T-DNA区域2依次包括两个独立T-DNA区域：T-DNA区域A-2和T-DNA区域B；T-DNA区域A-2包括左边界A、nos终止子、新霉素磷酸转移酶基因和nos启动子、右边界A；T-DNA区域B依次包括右边界B、第二个MAR、用于插入目的基因的多克隆位点、第一个MAR和左边界B；T-DNA区域A-2的右边界A和T-DNA区域B的右边界相邻，且T-DNA区域A-2的左边界A和T-DNA区域B的左边界相离（即右臂相邻）。
选择标记基因nptII表达盒包括nos启动子、新霉素磷酸转移酶基因（nptII）和nos终止子；
上述用于插入目的基因的多克隆位点依次包括HindIII、SphI、PstI、XbaI、BamHI、SmaI、SacI、EcoRI；
双T-DNA区域2各部分的核苷酸序列如下所示：序列表中序列2自5’末端第1-26位核苷酸为左边界A；自5’末端第545-800位核苷酸为选择标记基因nptII表达盒的终止子nos、自5’末端第1013-1996位核苷酸为选择标记基因nptII、自5’末端第1997-2303位核苷酸为选择标记基因nptII表达盒的nos启动子、自5’末端第2618-2643位核苷酸为右边界A、自5’末端第2858-2883位核苷酸为右边界B、自5’末端第2930-3676位核苷酸为第二MAR、自5’末端第3893-3950位核苷酸为用于插入目的基因的多克隆位点、自5’末端第4213-5074位核苷酸为第一MAR、自5’末端第5349-5374位核苷酸为左边界B。
实施例2、双T-DNA植物表达载体pDTgfp-npt和pDTepsps-hyg的构建
一、双T-DNA植物表达载体pDTgfp-npt的构建
XhoI和BglII(NEB)双酶切中间载体pSPmGFP5（中国科学院博士研究生学位论文“一种转录后基因沉默机制的研究”，刘翔，2004年，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；载体构建示意图如图8），得到1989bp的酶切产物，该酶切产物包括绿色荧光蛋白基因（mgfp5)表达盒，该表达盒包括CaMV35S启动子、绿色荧光蛋白基因（mgfp5)和nos终止子组成的表达盒（该表达盒的核苷酸序列为序列3）。
将该酶切产物用Klenow酶(NEB)补平XhoI和BglII酶切位点，得到平末端酶切产物；再将由实施例1得到的载体pDTmar-npt用SmaI(NEB)酶切，回收11624bp的载体骨架；再将平末端酶切产物和载体骨架链接，得到双T-DNA表达载体pDTgfp-npt，该表达载体的结构示意图如图9所示。
经过测序鉴定方向，且该表达载体pDTgfp-npt为将序列表中序列3所示的绿色荧光蛋白基因（mgfp5)表达盒插入pDTmar-npt载体的SmaI酶切位点间得到的载体。
序列3自5’末端第30-878位核苷酸为CaMV35S启动子、自5’末端第884-1701位核苷酸为绿色荧光蛋白基因（mgfp5)、自5’末端第1702-1967位核苷酸为nos终止子。
从图9的结构示意图可以看出，双T-DNA表达载体pDTgfp-npt含有两个方向相反且独立的T-DNA区，其中一个T-DNA包含新霉素磷酸转移酶基因（nptII）表达盒作为选择标记基因，另一个T-DNA包含绿色荧光蛋白基因（mgfp5)表达结构盒作为报告基因，代表目的基因。在报告基因的两侧同时还含有两段同向来源于豌豆的MAR序列，该序列可以提高和稳定外源基因在受体植物中的表达（LiXG,etal.2001.ScienceinChina(seriesC)44:400-408）。
二、双T-DNA植物表达载体pDTepsps-hyg的构建
XmnI和SbfI(NEB)双酶切质粒pCDepsps-hyg（载体结构示意图如图10，该载体的核苷酸序列为序列表中的序列5，双T-DNA顺势连接，LB-RB-LB-RB）含有两个同向且独立的T-DNA区），得到4222bp的酶切产物；该酶切产物包括5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶表达盒，该表达盒包括P-Ubi启动子、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPs）基因和nos终止子（该表达盒的核苷酸序列为序列表中的序列4）。
将由实施例1得到的载体pDTmar-hyg用SmaI和SbfI(NEB)酶切，回收11637bp的载体骨架，将4222bp的酶切产物与11637bp的载体骨架连接，得到双T-DNA植物表达载体pDTepsps-hyg（载体结构示意图如图11）。
载体pDTepsps-hyg为将序列表中序列4所示的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表达盒插入pDTmar-hyg的SmaI和SbfI酶切位点间得到。
序列4自5’末端第2198-4108位核苷酸为P-Ubi启动子、自5’末端第554-2197位核苷酸为EPSPs、自5’末端第285-574位核苷酸为nos终止子。
实施例3、对照双T-DNA植物表达载体pCDgfp-npt的构建
XhoI和BglII(NEB)双酶切中间载体pSPmGFP5，得到1989bp的酶切产物，该酶切产物包括绿色荧光蛋白基因（mgfp5)表达盒，该表达盒包括CaMV35S启动子、绿色荧光蛋白基因（mgfp5)和nos终止子组成的表达盒（序列3）。
将该酶切产物用Klenow酶(NEB)补平XhoI和BglII酶切位点，得到平末端酶切产物；再将载体pCDmar-npt（载体结构示意图如图17，该载体的核苷酸序列为序列表中的序列6，双T-DNA顺势连接，为LB-RB-LB-RB；）用SmaI(NEB)酶切，回收11643bp的载体骨架；再将平末端酶切产物和载体骨架链接，得到双T-DNA表达载体pCDgfp-npt，该表达载体的结构示意图如图12所示。
经过测序验证插入方向正确，且该表达载体pCDgfp-npt为将序列表中序列3的绿色荧光蛋白基因（mgfp5)表达盒插入pCDmar-npt载体的SmaI酶切位点间得到的载体。
从图12的结构示意如可以看出，双T-DNA表达载体pCDgfp-npt含有两个同向且独立的T-DNA区，其中一个T-DNA包含新霉素磷酸转移酶基因（nptII）表达盒作为选择标记基因，另一个T-DNA包含绿色荧光蛋白基因（mgfp5)表达结构盒作为报告基因，代表目的基因。在报告基因的两侧同时还含有两段同向来源于豌豆的MAR序列，该序列可以提高和稳定外源基因在受体植物中的表达（LiXG,etal.2001.ScienceinChina(seriesC)44:400-408）。
实施例4、双T-DNA植物表达载体pDTgfp-npt和pDTepsps-hyg在培育无选择标记转基因植物或抑制双T-DNA连锁中的应用
一、双T-DNA植物表达载体pDTgfp-npt在培养无选择标记转基因烟草或抑制双T-DNA连锁中的应用
1、烟草转化植株的获得
1）叶盘法转化烟草
利用改良叶盘法，通过农杆菌介导转化烟草。
参照BIO-DAD公司电激仪的说明书，将优化后的植物表达载体pDTgfp-npt及其未优化的对照载体pCDgfp-npt通过电激法转化到根癌农杆菌LBA4404（Luo，etal.2006.PlantCellRep25:403–409，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得）中，得到农杆菌LBA4404/pDTgfp-npt（提取质粒，用SalI和KpnI酶切，得到2013bp的为阳性）和LBA4404/pCDgfp-npt（提取质粒，用SalI和KpnI酶切，得到1955bp的为阳性）。
将农杆菌LBA4404/pDTgfp-npt和LBA4404/pCDgfp-npt在含有kanamycin50mg/L的YEB固体培养基上划线，28℃避光培养至长出直径约1mm大小的单菌落（约2-3天），单菌落再度转接于同样的固体培养基上，培养至生长旺盛期（约2-3天）。取少许农杆菌LBA4404/pDTgfp-npt和LBA4404/pCDgfp-npt转接于20ml的YEB液体培养基中（kanamycin50mg/L）于28℃，220rpm振荡培养过夜(约16小时)。次日以2％-4％的接种量转接于20ml不含抗生素的YEB液体培养基中，并补加乙酰丁香酮（AS）至终浓度为100μM。继续振荡培养3-4小时，到达对数生长中期时，用3.5倍体积的YEB液体培养基稀释至肉眼稍见浑浊即可（OD600=0.1）作转化用，得到农杆菌LBA4404/pDTgfp-npt和LBA4404/pCDgfp-npt菌液。
取完全展开的野生本氏烟草(Nicotianabenthamiana)（以下简称为野生型烟草；Baulcombeetal.,ThePlantJournal1995.67：1045-1053；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得）无菌苗叶片，用打孔器（直径0.9cm）制成叶盘，在农杆菌LBA4404/pDTgfp-npt和LBA4404/pCDgfp-npt菌液中浸泡8分钟。取出叶盘，用无菌滤纸吸干后，转入覆盖有一层无菌滤纸的共培养培养基（MS基本培养基＋蔗糖30g/L＋6BA1.0mg/L＋IAA0.1mg/L）中于25℃暗培养3天后，再将叶盘转入继代培养基（MS基本培养基＋＋蔗糖30g/L＋6-BA1.0mg/L＋IAA0.1mg/L＋头孢噻肟钠500mg/L）中，在继代培养基中光照培养（光/暗周期为16/8小时）3天后，再将叶盘转入筛选培养基（MS基本培养基＋蔗糖30g/L＋6-BA1.0mg/L＋IAA0.1mg/L＋头孢噻肟钠500mg/L＋kanamycin80mg/L），继续培养10天后，将叶盘转入再生培养基（MS基本培养基＋蔗糖30g/L＋6-BA1.0mg/L＋头孢噻肟钠500mg/L＋kanamycin80mg/L）。一个月左右叶片边缘长出再生芽至1-2cm，转入新的再生培养基中（MS基本培养基＋蔗糖30g/L＋6-BA1.0mg/L＋头孢噻肟钠500mg/L＋kanamycin80mg/L）。再生芽长到3-4cm时，用解剖刀将再生芽切下，并转入生根培养基（MS基本培养基＋蔗糖20g/L＋kanamycin50mg/L）中，待再生芽在培养基中生根，并长成独立植株时，移栽至蛭石并在温室中进行继续培养，得到T0代转pDTgfp-npt烟草和T0代转pCDgfp-npt烟草（对照）。
2）T0代转基因烟草植株的分子检测验证双-DNA连锁
（1）、烟草DNA的提取
CTAB法提取T0代转基因烟草的基因组DNA，具体如下：分别取T0代转pDTgfp-npt烟草和T0代转pCDgfp-npt烟草（对照）的新鲜叶片0.3mg置于研钵中，加液氮研成粉末，再加入0.6ml60℃预热的CTAB缓冲液(30g/LCTAB，1.4mol/LNaCl，0.2%的巯基乙醇，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris-HCl，pH8.0)。60℃保温30分钟，其间轻摇数次。然后加等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次，上清液转移到新的离心管中加入2/3倍体积异丙醇，形成的沉淀即是DNA，加入少许洗液(体积分数为76％的乙醇，10mmol/LNH4AC)洗涤沉淀一次，干燥后用500μlTE缓冲液(10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA)溶解DNA。随后加入RNaseA(终浓度10mg/L)，37℃保温30分钟，依次用等体积的苯酚、苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、氯仿：异戊醇(24：1)各抽提一次，水相加入2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA。DNA干燥后溶解于60μl无菌水中，得到基因组DNA。
（2）、T0代转基因烟草PCR检测
对转化优化后的载体pDTgfp-npt获得的192个T0代转pDTgfp-npt烟草植株及其转化对照载体pCDgfp-npt获得的99个T0代转pCDgfp-npt烟草（对照）的基因组DNA进行PCR检测，具体如下：
取1μl基因组DNA做模板进行PCR反应；
nptII基因的引物为：引物1：N1，5'-GAA,CAA,GAT,GGA,TTG,CAC,GCA,GG-3'；引物2：N2，5'-AAG,AAG,GCG,ATA,GAA,GGC,GAT,GC-3'，扩增片段为774bpnptII基因；
mgfp5基因的引物为：引物1：M1，5'-ACC,CAG,ATC,ATA,TGA,AGC,GG-3'；引物2：M2，5'-TTG,GGA,TCT,TTC,GAA,AGG,GC-3'，扩增片段为415bpmgfp5基因；
鉴定转化优化后载体pDTgfp-npt的双T-DNA插入连锁的引物：引物1：W1，5'CCA,GGC,TTT,ACA,CTT,TAT,GCT,TC-3'；引物2：W2，5'-CTT,CTC,CTC,TAG,TAT,CTC,CCG,ATG-3'，扩增片段为472bp；
鉴定转化对照载体pCDgfp-npt的双T-DNA插入连锁的引物:引物1：W3，5'TGA,CTC,CCT,TAA,TTC,TCC,GCT,CAT-3'；引物2：W4，5'-CGA,TAC,CGT,CGA,GTT,TCT,CCA,TA-3'，扩增片段为1145bp；
上述每个PCR反应体系均包括：2μl10×PCR反应缓冲液、0.5μl10mM引物1、0.5μl10mM引物2、1μlDNA模板、2.5μl2.5mMdNTPs，补加无菌水至总体积20μl。每个PCR反应条件均为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、54℃复性30秒、72℃延伸1分钟，进行30个循环，最后72℃延伸5分钟。
T0代转pDTgfp-npt烟草植株PCR产物全部进行琼脂糖电泳检测，部分电泳结果如图13A，为检测转化优化后载体pDTgfp-npt的部分电泳结果，其中M为100bpDNAmarker；P为阳性质粒pDTgfp-npt；N为野生型烟草，1-9为T0代转pDTgfp-npt烟草植株，可以看出，1-9均扩增出774bpnptII基因和415bpmgfp5基因，其中仅有5和6扩增出472bp，为T0代双T连锁检测呈阳性植株，其余均为非双T连锁T0代转pDTgfp-npt烟草植株。
T0代转pCDgfp-npt烟草（对照）PCR产物全部进行琼脂糖电泳检测，部分电泳结果如图13B，为检测对照载体pCDgfp-npt的部分电泳结果，其中M为100bpDNAmarker；P为阳性质粒pCDgfp-npt；N为野生型烟草，1-10为T0代转pCDgfp-npt烟草（对照），可以看出，2-10均扩增出774bpnptII基因和2-6,8-10均扩增出415bpmgfp5基因，其中2-4,6,8,10均扩增出1145bp，为T0代转pCDgfp-npt烟草（对照）双T连锁检测呈阳性植株。
192个T0代转pDTgfp-npt烟草PCR检测结果显示，nptII基因检测呈阳性的T0代转基因烟草共184株；nptII基因与mgfp5基因发生共转化T0代转pDTgfp-npt烟草有160个，二者共转化率为86.96%，其中二者共转化160个中经检测双T连锁整合到烟草基因组的T0代转pDTgfp-npt烟草共41株、连锁频率为25.63%（表1），非双T连锁的整合到烟草基因组的T0代转pDTgfp-npt烟草共119株、非连锁频率为74.37%。
99个T0代转pCDgfp-npt烟草（对照）PCR检测结果显示，nptII基因检测呈阳性的T0代转基因烟草共95株；nptII基因与mgfp5基因发生共转化T0代转基因烟草有86个，二者共转化率为90.53%，其中二者共转化86个中经检测双T连锁整合到烟草基因组的T0代转pCDgfp-npt烟草（对照）共38株、连锁频率为44.19%（表1），非双T连锁的整合到烟草基因组的T0代转pCDgfp-npt烟草（对照）共48株、非连锁频率为55.81%。
表1为T0代转基因烟草共转化频率及连锁频率
注：GFP+,GFP检测成阳性;Kmr,卡那检测成阳性
可以看出，本发明的载体大大降低了双T-DNA的连锁。
（3）、T1代转基因烟草植株的分子检测
将上述nptII基因与mgfp5基因共转化、且非双T连锁的T0代转基因烟草在温室中培养至成熟，自交得到种子，得到T1代转基因烟草。
取12个转化优化后载体pDTgfp-npt的T1代转pDTgfp-npt烟草（非双T连锁）和6个转化对照载体pCDgfp-npt的T1代转pCDgfp-npt烟草（对照，非双T连锁），取种子适量，于温水（37℃）中浸泡4小时，使种子沉入水中，用30%次氯酸钠溶液灭菌8分钟，无菌蒸馏水洗三遍，温水（37℃）浸泡半小时，转接于MS培养基中（平皿）25℃培养，光/暗周期为16/8小时。在幼苗长到5叶期，提取叶片DNA，DNA提取、PCR检测方法同上述（2）。
检测nptII基因的引物为：引物1：N19，5'TCC，GAA，CGC，AGC，AAG，ATA-3'；引物2：N20，5'CGG，TGC，CCT，GAA，TGA，ACT-3'，扩增片段为983bp，检测mgfp5基因的引物为：引物1：M1，5'-ACC,CAG,ATC,ATA,TGA,AGC,GG-3'；引物2：M2，5'-TTG,GGA,TCT,TTC,GAA,AGG,GC-3'，扩增片段为415bp。
T1代转pDTgfp-npt烟草植株部分检测结果如图14A，为检测转化优化后载体pDTgfp-npt的部分电泳结果，其中M为2kbplusDNAmarker；P为阳性质粒pDTgfp-npt；N为野生型烟草，1-22为T1代转pDTgfp-npt烟草，可以看出，除4，5，12既扩增出415bpmgfp5基因又扩增出983bpnptII基因外，其余植株只能扩增出415bp的mgfp5基因，说明在转化pDTgfp-npt的T1代转基因烟草中出现了mgfp5基因与选择标记基因nptII的分离，能够筛选出无选择标记转基因植株。
T1代转pCDgfp-npt烟草（对照）植株部分检测结果如图14B所示，为检测转化优化后对照载体pCDgfp-npt的部分电泳结果，其中M为2kbplusDNAmarker；P为阳性质粒pCDgfp-npt；N为野生型烟草，1-22为T1代转pCDgfp-npt烟草（对照），可以看出6,8,10,12,17,18,21,22均扩增出415bpmgfp5基因而未扩增出983bp的nptII基因，说明在转化pCDgfp-npt的T1代转基因烟草中出现了mgfp5基因与选择标记基因nptII的分离，能够筛选出无选择标记转基因植株。
在检测的12个转化pDTgfp-npt的T1代转pDTgfp-npt烟草中，共有6（50%）个株系出现目的基因mgfp5与选择标记基因nptII的分离，从而可以筛选出无选择标记转基因植株；说明T1代检测非连锁的比率为50%，统计结果如表2所示。
实验结果表明，利用本研究中优化的双T-DNA表达载体系统pDTmar-npt进行遗传转化，并最终获得无选择标记的转基因植株的比率为86.96%(T0代共转化频率)×74.47%（T0代检测非连锁的比率）×50%（T1代检测非连锁的比率）=32.38%。
表2为T1代转pDTmar-npt烟草株系gfp基因与npt基因分离比分析
a拷贝数按3:1,15:1或63:1分离比进行卡平方估算
在检测的转化pCDgfp-npt的6个T1代烟草株系中，共有2（33.33%）个株系出现目的基因mgfp5与选择标记基因nptII的分离，从而可以筛选出无选择标记转基因植株；说明T1代检测非连锁的比率为33.33%，统计结果如表3所示。
实验结果表明，利用本研究中未优化的双T-DNA表达载体系统pCDmar-npt进行遗传转化，并最终获得无选择标记的转基因植株的比率为90.53%(T0代共转化频率)×55.81%（T0代检测非连锁的比率）×33.33%（T1代检测非连锁的比率）=16.84%。
表3为T1代转pCDmar-npt烟草株系gfp基因与npt基因分离比分析
a拷贝数按3:1,15:1或63:1分离比进行卡平方估算
二、双T-DNA植物表达载体pDTepsps-hyg在培养无选择标记转基因水稻中的应用
1）转化水稻
取开花后12-15d水稻明恢86（苏军等。农杆菌介导籼稻明恢86高效稳定转化体系的建立。福建农业学报，2003，18（4），209-213；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；以下也称为野生型水稻）幼穗，剥去颍壳后在70％酒精中漂洗2min，然后在25％次氯酸钠中消毒30min，用无菌水冲洗3次后吸干水渍，取出幼胚，接种于诱导培养基（N6大量+B5微量+MS铁盐+B5有机+水解酪蛋白300mg/L+谷氨酰胺500mg/L+脯氨酸2.8g/L培养基+2,4-D2.0mg/L+蔗糖30.0g/L+植物凝胶4.5g/L，pH5.8）上诱导愈伤组织。
将优化后的植物表达载体pDTepsps-hyg及其对照pCDepsps-hyg（实施例1中涉及）通过电激法转化到根癌农杆菌LBA4404中，得到农杆菌LBA4404/pDTepsps-hyg（提取质粒，用BglII酶切，得到14680bp和1325bp片段的为阳性）和LBA4404/pCDepsps-hyg（提取质粒，用EcoRV酶切，得到9907bp、3476bp和2633bp片段的为阳性）。
将农杆菌LBA4404/pDTepsps-hyg和LBA4404/pCDepsps-hyg接于20mlYEB液体培养基中(含Km，Rif各50mg/L)28℃避光培养过夜，次日按2％-4％转接到无抗菌素的YEB培养基中(含乙酰丁香酮100μM/L)，剧烈振荡培养3h。测OD值稀释至相应浓度(OD约0.5)。选取生长状态好的胚性愈伤为受体，加入相应浓度的根癌土壤杆菌液浸泡3-5min后将愈伤组织转接于共培养基（N6大量+B5微量+MS铁盐+B5有机+水解酪蛋白300mg/L+谷氨酰胺500mg/L+脯氨酸2.8g/L培养基+2,4-D2.0mg/L+蔗糖30.0g/L+葡萄糖10g/L+植物凝胶4.5g/L+乙酰丁香酮100μM+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素400mg/L，pH5.2）上，28℃暗培养3d。将共培养愈伤组织于无菌培养皿中，用含Cef400mg/L的无菌水漂洗3次，在无菌滤纸上吸干后转接于预培养基（N6大量+B5微量+MS铁盐+B5有机+水解酪蛋白300mg/L+谷氨酰胺500mg/L+脯氨酸2.8g/L培养基+2,4-D2.0mg/L+蔗糖30.0g/L+葡萄糖10g/L+植物凝胶4.5g/L+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素400mg/L，pH5.8)中25℃暗培养5-7d。然后依次经30-50mg/LHygB的严格筛选。获得的抗性愈伤组织在含50mg/LHygB的分化培养基（MS大量+MS微量+MS铁盐+MS有机+水解酪蛋白1000mg/L+谷氨酰胺500mg/L+NAA0.4mg/L培养基+6-BA2.0mg/L+KT1mg/L+蔗糖30.0g/L+山梨醇20g/L+植物凝胶4.5g/LpH5.8）上进行分化(初期为暗培养,10-15d后为14h/d的光周期培养)。得到的抗性小芽在生根培养基（1/2MS+蔗糖20g/L+植物凝胶4.5g/L,pH5.8）上进一步生根成完整的抗性植株。待植株长至6-10cm时，进行开放式水培养,长出新根后移栽温室，得到T0代转pDTepsps-hyg水稻和T0代转pCDepsps-hyg水稻（对照）。
2）T0代转基因水稻植株的分子检测双T-DNA连锁
（1）水稻总DNA的提取
分别称取T0代转pDTepsps-hyg水稻和T0代转pCDepsps-hyg水稻（对照）新鲜叶片0.3mg置于研钵中，加液氮研成粉末，再加入0.6ml60℃预热的CTAB缓冲液(30g/LCTAB，1.4mol/LNaCl，0.2%的巯基乙醇，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris-HCl，pH8.0)。60℃保温30min，其间轻摇数次。然后加等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次，上清液转移到新的离心管中加入等体积异丙醇，形成的沉淀即是DNA，加入少许洗液(体积分数为76％的乙醇，10mmol/LNH4AC)洗涤沉淀一次，干燥后用500μlTE缓冲液(10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA)溶解DNA。随后加入RNaseA(终浓度10mg/L)，37℃保温30min，依次用等体积的苯酚、苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、氯仿：异戊醇(24：1)各抽提一次，水相加入2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA。DNA干燥后溶解于100μl无菌水中，得到基因组DNA。
（2）、T0代转基因水稻PCR检测
对96个T0代转pDTepsps-hyg水稻和24个T0代转pCDepsps-hyg水稻（对照）植株进行PCR检测，具体如下：
取1μl基因组DNA做模板进行PCR反应；
hyg基因的引物为：引物1：N1，5'-CGG，TCG，GCA，TCT，ACT，CTA，TT-3'；引物2：N2，5'CGT，TAT，GTT，TAT，CGG，CAC，TTT-3'，扩增片段为845bp的hyg基因（如图15）；
epsps基因的引物为：引物1：M1，5'-ATT，GAC，AGC，AGC，CGT，GAC-3'；引物2：M2，5'ACC，TTT，GCT，CCC，ATC，ATC，T-3'，扩增片段为538bp的epsps基因（如图15）；
鉴定pDTepsps-hyg载体双T-DNA插入连锁的引物：引物1：W1，5'GAT，TGT,GCG,TCA,TCC,CTT,AC-3'；引物2：W2，5'-ACA，TCG,TCT,CTG,CCT,CCT,CT-3'，扩增片段为1750bp。
鉴定pCDepsps-hyg载体双T-DNA插入连锁的引物：引物1：W3，5'-ACT，TTT,CGA,TCA,GAA,ACT,TCT,C-3'；引物2：W4，5'-GCC,TCC,ATT,GGT,AGT,ACA,TT-3'，扩增片段为2025bp。
上述每个反应体系均包括：2μl10×PCR反应缓冲液、0.5μl10mM引物1、0.5μl10mM引物2、1μlDNA模板、2.5μl2.5mMdNTPs，补加无菌水至总体积20μl。每个PCR反应条件均为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、54℃复性30秒、72℃延伸1分钟，进行30个循环，最后72℃延伸5分钟。
T0代转pDTepsps-hyg水稻hyg基因和epsps基因PCR产物进行琼脂糖电泳检测如图15A所示（M为100bpDNAmarker；P为阳性质粒pDTepsps-hyg；N为野生型水稻，1-10为T0代转pDTepsps-hyg水稻），可以看出8、9、10为hyg基因和epsps基因阳性的T0代转pDTepsps-hyg水稻；
T0代转pCDepsps-hyg水稻（对照）hyg基因和epsps基因PCR产物进行琼脂糖电泳检测如图15B所示（M为100bpDNAmarker；P为阳性质粒pCDepsps-hyg；N为野生型水稻，1-10为T0代转pCDepsps-hyg水稻（对照），可以看出1-5、9、10为hyg基因和epsps基因阳性的T0代转pDTepsps-hyg水稻。
图16A为T0代转pDTepsps-hyg水稻连锁鉴定电泳图(M为2kbplusDNAmarker；P为阳性质粒pDTepsps-hyg；N为野生型水稻，1-15为T0代转pDTepsps-hyg水稻；可以看出，其中3，5,11扩增出1750bp条带，为T0代双T连锁检测呈阳性植株；其余均为非双T连锁T0代转pDTepsps-hyg水稻；
图16B为T0代转pCDepsps-hyg水稻（对照）连锁鉴定电泳图（M为2kbplusDNAmarker；P为阳性质粒pCDepsps-hyg；N为野生型水稻，1-15为T0代转pCDepsps-hyg水稻（对照））可以看出，其中5，7，10扩增出2025bp条带，为T0代双T连锁检测呈阳性植株；其余均为非双T连锁T0代转pCDepsps-hyg水稻（对照）。
96个T0代转pDTepsps-hyg水稻PCR检测的结果显示，hyg基因检测呈阳性的T0代转基因水稻共92株；hyg基因与epsps基因发生共转化T0代转pDTepsps-hyg水稻有70个，二者共转化率为76.06%，其中70个hyg基因与epsps基因发生共转化T0代转pDTepsps-hyg水稻中经检测双T连锁整合到烟草基因组的T0代转基因水稻共1株、连锁频率为1.43%（表4），非双T连锁的整合到水稻基因组的T0代转pDTepsps-hyg水稻共69株、非连锁频率为98.57%。
表4为T0代转基因水稻共转化频率及连锁频率
注：epsps+,epsps检测成阳性;Hygr,潮霉素检测成阳性可以看出，本发明的载体大大降低了双T-DNA的连锁。
Claims (12)
1.一种双T-DNA载体A，包括双T-DNA区域，所述双T-DNA区域包括T-DNA区域A和T-DNA区域B；所述T-DNA区域A依次包括左边界A、选择标记基因表达盒和右边界A；所述T-DNA区域B依次包括右边界B、第二个MAR、用于插入目的DNA的多克隆位点、第一个MAR和左边界B；所述T-DNA区域A的右边界A和所述T-DNA区域B的右边界相邻。
2.根据权利要求1所述的双T-DNA载体A，其特征在于：所述选择标记基因为新霉素磷酸转移酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、潮霉素磷酸转移酶编码基因、膦丝菌素乙酰转移酶基因或5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因；所述用于插入目的DNA的多克隆位点依次包括HindIII、SphI、PstI、XbaI、BamHI、SmaI、SacI、EcoRI。
3.根据权利要求2所述的双T-DNA载体A，其特征在于：
所述双T-DNA载体A为如下1)或2)：
1)所述的双T-DNA载体A中的双T-DNA区域依次包括所述左边界A、终止子CaMV35SpolyA、所述潮霉素磷酸转移酶编码基因和启动子35S、所述右边界A、所述右边界B、所述第二个MAR、所述用于插入目的DNA的多克隆位点、所述第一个MAR和所述左边界B；
2)所述的双T-DNA载体A中的双T-DNA区域依次包括所述左边界A、nos终止子、所述新霉素磷酸转移酶基因和nos启动子、所述右边界A、所述右边界B、所述第二个MAR、所述用于插入目的DNA的多克隆位点、所述第一个MAR和所述左边界B。
4.根据权利要求3所述的双T-DNA载体A，其特征在于：
1)所述的双T-DNA载体A中的双T-DNA区域的核苷酸序列为序列表中的序列1；
2)所述的双T-DNA载体A中的双T-DNA区域的核苷酸序列为序列表中的序列2。
5.根据权利要求3或4所述的双T-DNA载体A，其特征在于：
1)所述的双T-DNA载体A按照如下方法制备：将含有所述T-DNA区域B片段插入含有所述T-DNA区域A的表达载体中，且使所述T-DNA区域A的右边界A和所述T-DNA区域B的右边界相邻；所述含有所述T-DNA区域B片段的核苷酸序列具体为序列表中序列1自5’末端第2744-5527位核苷酸；所述含有所述T-DNA区域A的表达载体具体为pC1300LacZ-；
所述pC1300LacZ-为通过EcoRI和HindIII双酶切pCAMBIA1300，收集8907bp载体骨架，然后用Klenow补平载体骨架的酶切位点，自连，所获得的无多克隆位点的中间载体；
2)所述的双T-DNA载体A按照如下方法制备：将新霉素磷酸转移酶基因表达盒替换掉1)所述的双T-DNA载体A中潮霉素磷酸转移酶编码基因表达盒得到的载体；所述潮霉素磷酸转移酶编码基因表达盒包括终止子CaMV35SpolyA、所述潮霉素磷酸转移酶编码基因和启动子35S。
6.一种DNA片段，为权利要求1-5中任一所述双T-DNA载体A中的双T-DNA区域。
7.一种双T-DNA载体B，为将目的DNA插入权利要求1-5中任一所述的双T-DNA载体A的用于插入目的DNA的多克隆位点得到的载体。
8.根据权利要求7所述的双T-DNA载体B，其特征在于：所述目的DNA以目的基因表达盒的形式插入；
所述目的基因表达盒具体为绿色荧光蛋白基因表达盒或5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表达盒；
所述绿色荧光蛋白基因表达盒进一步具体包括CaMV35S启动子、绿色荧光蛋白基因mgfp5和nos终止子组成；所述绿色荧光蛋白基因表达盒的核苷酸序列进一步具体为序列表中的序列3；
所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表达盒进一步具体包括P-Ubi启动子、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因和nos终止子；所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表达盒的核苷酸序列进一步具体为序列表中的序列4。
9.权利要求1-5中任一所述的双T-DNA载体A或权利要求6所述的DNA片段或权利要求7或8所述的双T-DNA载体B在抑制双T-DNA插入植物基因组发生连锁中的应用；所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为烟草，所述单子叶植物为水稻。
11.权利要求1-5中任一所述的双T-DNA载体A或权利要求6所述的DNA片段或权利要求7或8所述的双T-DNA载体B在培育无选择标记转基因植物中的应用；所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为烟草，所述单子叶植物为水稻。
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