CN1654662A - 一种培育无选择标记转基因植物的方法及其专用表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培育无选择标记转基因植物的方法及其专用表达载体，其目的是提供一种可高效率培育无选择标记转基因植物的方法及其所用的双标记双T－DNA植物表达载体。本发明所提供的双标记双T－DNA植物表达载体包含两个独立的T－DNA，其中一个T－DNA含有选择标记基因和绿色荧光蛋白基因，另一个T－DNA携带目的基因。本发明创造性地把绿色荧光蛋白基因(gfp)作为一个可视的剔除标记构建在与选择标记基因相同的T－DNA结构域上。由于gfp基因和选择标记基因位于同一T－DNA结构域上，二者在转基因后代植株中偕同遗传，同时由于gfp基因能在许多种植物中稳定表达和方便地检测，所以这一体系能普遍适用于大多数包括双子叶植物、单子叶植物在内的作物，具有广阔的应用前景。

Description

一种培育无选择标记转基因植物的方法及其专用表达载体

技术领域

本发明涉及一种培育转基因植物的方法及其专用表达载体，特别涉及一种培育无选择标记转基因植物的方法及其专用表达载体。

背景技术

随着植物转基因技术的长足发展，研究人员可以利用多种转化方法将外源基因转化到植物体内，如农杆菌介导法、基因枪法、PEG、电激法等(Sawahel WA，et al.1992.Biotech Advances.10：393-412)。利用这些转化方法将外源目的基因导入到植物细胞时，通常只有部分细胞可以成为稳定的转化细胞。因此，一般在转化系统中使用抗生素抗性基因或除草剂抗性基因等作为选择标记基因筛选转化细胞。在选择压力下，不含选择标记基因及其产物的非转化细胞将死亡；转化细胞和组织则整合有选择标记基因而存在抗性，从而能够继续成活并分化成植株(Dale E C，et al.1991.Proc Natl Acad Sci USA.88：10558-10562)。选择标记基因的应用使植物基因工程成为可能。

然而另一方面，选择标记基因及其蛋白产物毕竟不是基因工程的目的产品。尽管目前的研究表明多数选择标记基因及其产物并未带来安全性隐患，但有些人仍会担心这些基因存在于转基因植物中会带来影响环境和人类健康安全性的问题(Zechendorf B.1994.12：870-875)，如选择标记基因及其产物在食用时可能有毒性或会引起过敏反应；尤其是选择标记基因编码产物如具有某一临床或肠道应用的抗生素抗性时，人们担心选择标记基因转移进微生物中将增强病原微生物的抗药性，从而引起抗生素失效。此外，如抗除草剂型的选择标记基因平行转移进野草中，可能会使其转变为难以控制的害草，造成生态平衡的破坏(Dale P J.1992.PlantPhysiol.100：13-15)。再者，通过基因工程手段将多个目的基因重复转化导入受体植物中，集中高产、优质，抗虫、抗病等多种性状，是培育作物新品种的一种良策。目前可供利用的选择标记基因为数甚少，经过一次转化获得的转基因植物如已存在选择标记基因，该基因在随后的再次转化中将不能再作为选择标记，但又不可能每次转化都更换新的择标记基因。但假如培育出不含选择标记基因的转基因植物，这个问题即会迎刃而解(Dekeyser R，et al.1989.Plant Physiol.90：217-223)。总而言之，建立无选择标记植物转化系统，培育无选择标记的转基因植物无论是从安全性考虑，还是从转基因技术本身考虑均具有着重要的意义。

无选择标记转基因植物的研究和培育已成为国际上植物基因工程领域的一个趋势。迄今，已有一些方法可获得不带选择标记基因的转化植物，主要的有转座子成份介导法，位点特异性重组系统介导法及共转化方法等(Yoder J I，et al.1994.Bio/Technology，12：263-267)。

转座子成分能利用保守的切割粘连机制从植物染色体中的某个位置转移到新的遗传座位，转座后的新座位有一半的机率与原来的遗传座位不连锁。利用转座子成分的这一特性能够去除转基因植物中的选择标记基因和其它多余序列(Yoder J I，et al.1994.Bio/Technology.12：263-267)。Goldsbrough等(1993.Bio/Technology.11：1286-1292)把选择标记nptII基因插入到玉米转座子成分Ds的反向重复序列之间，把报告基因gus构建在Ds反向重复序列外，然后以此载体转化番茄。结果发现在转座酶基因Ac作用下，Ds成分连带nptII基因转移到植物基因组中新的遗传座位。在转基因植株后代中gus基因与nptII基因发生了分离，从而获得了只带gus基因而无抗性标记(nptII)基因的植株。

位点特异性重组系统是一类能够通过对特定DNA序列进行切割和重新连接，使其发生重组的DNA重组体系。在转基因植物去除标记基因研究中，应用最为广泛的是来源于大肠杆菌P1噬菌体的Cre/loxP系统。Cre/loxP系统由cre基因编码的38.5KD的重组酶Cre蛋白及其识别切割序列loxP位点组成，loxP序列长34bp，包括8bp的间隔序列及两个13bp的反向重复序列。Cre蛋白能识别两个同向的loxP位点，介导loxP位点连同其中间的片段发生重组而被剔除。Rusell等人(1992.MolGen Genetic.234：49-59)将gus基因和编码磺酰脲(sulfonylurea)抗性的(acetolactate synthase，als)基因转入烟草，其中als基因构建在了loxP序列之间。通过农杆菌介导或有性杂交将cre基因导入到已获得的转基因植株体内，在转基因植株后代中可发现磺酰脲抗性阴性，但GUS阳性的转基因植株。Southern杂交结果证实显示als基因已被Cre酶去除。早期的研究需要通过二次转化或有性杂交导入重组酶，(Dale E C，et al.1991.Proc Natl Acad Sci USA.88：10558-10562；Russell S H，et al.1992.Mol Gen Genetic.234：49-59)。后来进一步发展的可调控表达的位点特异性重组系统可以一次性将目的基因、选择标记基因和重组酶转入受体植株中，然后在适当的时候诱导重组酶表达，进而去除选择标记基因和重组酶基因本身(Sugita K，et al.2000.Plant J.22：461-469；Hoff T，et al.2001.Plant Mol Biol.45：41-49；Zuo J，et al.2001.Nature Biotechnology.19：157-161)。

共转化法包括基于基因枪直接转化和农杆菌介导的两种途径。早期的研究发现把目的基因和选择标记基因分置于不同的质粒上，二者混合后经基因枪转化可获得共整合有目的基因和选择标记基因的植株，当两个基因分别整合在受体的不同染色体上时，后代植株即可发生分离从而获得不带选择标记的转化植株。然而由于基因枪转化法存在拷贝数多，外源基因整合方式复杂，其插入受体基因组的序列无规律性，可能携带大段的质粒骨架序列或可能只整合部分的外源基因序列，使这一方法的应用受到了限制，目前已基本不再应用。农杆菌介导的共转化方法主要是基于T-DNA在转化过程中整合于植物基因组中的位置具有一定随机性的原理。该法以两个分离的T-DNA(分别包含目的基因和选择标记基因)共同转化受体植物，获得目的基因与选择标记基因分别整合于不同染色体的转化植株后，再经过遗传分离筛选只携带有目的基因的植株。这一方法的整合方式一般是以可预见的左右边界间的T-DNA插入方式为主，其整合的拷贝数也较基因枪法少得多，从而克服了基因枪法的缺点。Mcknight等(1987.Plant Mol Biol.8：439-445)用分别含有nptII基因和胭脂碱合成酶(Nopaline synthase，Nos)基因的两个载体共转化烟草，结果表明，分开的T-DNA在一定条件下共同转化植物时，可以分别整合在植物基因组的不同位点。转化植株后代中，两个T-DNA发生分离，从而获得只含有单基因的转化植株。Komari等(1996.Plant J.10：165-174)将两个带有同源序列的T-DNA载体转化到农杆菌中，通过同源重组形成了“超级”Ti质粒载体。利用该载体转化烟草，并通过对转基因植株后代进行分析，发现选择标记基因(nptII)和报告基因(gus)可以分离，超过半数的转基因植株出现了GUS阳性而不带nptII活性。上述研究结果说明共转化方法可以获得无选择标记的转基因植物。

上述三种方法中，转座子成分介导法获得无选择标记转基因植株的过程复杂，周期也较长。Cre/loxP系统介导法同样过程复杂，需要经过几代的纯合后，经有性杂交或二次转化导入cre基因剔除选择标记后，再通过自交分离去除cre基因和另一选择标记基因，周期极长，获得纯合的无选择标记转基因植株要达5代以上。可调控表达的位点特异性重组系统介导策略相对简化了无选择标记转基因植物培育的程序，但需要利用一些特殊的诱导物质对转基因植株进行诱导，目前也多限于在烟草、拟南芥等双子叶模式植物的应用，而在单子叶植物水稻等重要作物方面的应用还相当少。相对而言，共转化是一较简单且在多数作物均能适用的方法。目前这一方法已在多种植物上成功获得无选择标记的转基因植物。然而常规的共转化法存在着一个主要缺陷即两个分离载体上的T-DNA共整合到受体基因组中机率一般较低，导致获得无选择标记转基因植株的效率偏低。

本发明人所在实验室对传统的T-DNA共转化方法做了功能改进，并建立了双T-DNA载体体系。该体系中的Ti质粒同时包含有2个T-DNA区域，分别包含目的基因和标记基因。在转化过程中，每个T-DNA转移是一个独立行为，有可能插入到寄主细胞的不同染色体中。T₀代转基因植株通过自交，子代中转基因分离而获得无选择标记基因的转基因植株。这个方法操作简单，易于重复，通过后代分离就可以产生无选择标记基因的转基因植株。已利用双T-DNA方式转化获得了转基因烟草和水稻。在烟草中，T₀代植株选择标记基因nptII和作报告基因用的bar基因共转移的频率为69.2％，分离比率为28.1％，获得无选择标记的转基因植株的概率达19.5％(Zhou H Y，et al.2003.Acta Botanica Sinica.45：1103-1108)，明显高于已有的其它常规方法的效率。

双T-DNA载体体系已在烟草中证明可以有效的培育无选择标记转基因植株。然而另一方面，由于种种原因，与原始的受体材料比，转基因植株通常会出现一些变异，如结实率下降，株高变矮，产量下降等，因此要获得目的基因稳定高效表达，综合农艺性状优良的植株通常需要较大的样本量。一般在近200个独立克隆来源的转化群体中才能筛选到几株综合性状优良的植株。通过无选择标记转化体系筛选到性状优良的植株所需的样本数则更需远远大于常规体系的数量。一般理论上目的基因和选择标记共整合植株的后代分离得到无选择标记植株概率为3/16，而纯合的无选择标记植株的概率仅有1/16，加上一些植株选择标记基因与目的呈连锁遗传而不发生分离，这一数据可能更低。在T₁代筛选无选择标记转化体的工作量是十分巨大的，以一个品种转化获得200个独立克隆的共整合T₀代植株为例，每个T₀代植株至少需要筛选50个以上T₁代植株才能保证获得无选择标记转化体，常规的作法必须先利用PCR方法对近10,000个植株进行选择标记基因的筛选，然后再对经筛选确认不带选择标记基因的植株作PCR筛选含目的基因的植株。这对实践中的大规模培育无选择标记转基因植物是一难度巨大的瓶颈，因此建立一种高效的无选择标记转基因植物培育体系具有重要的实际意义。

绿色荧光蛋白基因(gfp)是近年来应用于植物基因工程中的一个新型报告基因。其编码的蛋白由238个氨基酸组成，在65-67位Ser-Tyr-Gly三种氨基酸环化加氧形成特殊的生色团结构。gfp与gus、Luc等其它报告基因相比具有检测方法简单、适合活体观察、结果真实可靠而又不需任何外源底物或辅助因子等许多优点，目前已在包括拟南芥、烟草、水稻、玉米、棉花、小麦等许多种物种中得到应用。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种可高效率培育无选择标记转基因植物的双标记双T-DNA植物表达载体。

本发明所提供的双标记双T-DNA植物表达载体，包含两个独立的T-DNA，其中一个T-DNA含有选择标记基因和绿色荧光蛋白基因(gfp)，另一个T-DNA携带目的基因。

其中，所述选择标记基因可以包括任何适用于遗传转化的选择标记基因，例如新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase-II，Npt-II)基因、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase，Cat)基因、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase，Hpt)基因、膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricin-N-acetyltransferase，Bar)基因和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPs)基因等；所述绿色荧光蛋白基因(gfp)作为可视剔除标记，它包括任何能用于植物稳定表达的gfp基因，如mgfp4、mgfp5(Hasloff J，et al.1997.Proc Natl AcadSci USA.94：2122-2127)、sgfpS65T(Chiu W L，et al.1996.Curr Biol.6：325-330)、pgfpS65T(Pang S-Z，et al.1996.Plant Physiol.112：893-900)、egfp(Yang T-T，et al.1996.Nucleic Acids Res.24：4592-4593)、smgfp、smRS-gfp(Davis S J and Viersra R D.1998.Plant Mol Biol.36：521-528)等；目的基因可以包括任何在生产上有应用价值的基因，如抗虫基因、抗病基因、抗除草剂基因、抗衰老基因、抗逆基因、品质改良基因以及由上述基因组成的融合或多价基因。

所述目的基因的启动子可以包括组成型启动子、器官特异性启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或者由启动子和调控元件组成的复合启动子。

上述双标记双T-DNA植物表达载体的构建可按常规方法进行。

本发明的另一个目的是提供一种利用上述双标记双T-DNA植物表达载体高效率培育无选择标记转基因植物的方法，该方法包括以下步骤：

1)构建携带目的基因的上述双标记双T-DNA植物表达载体，并转入根癌农杆菌中；

2)用步骤1)中含有所述双标记双T-DNA植物表达载体的根癌农杆菌转化植物受体组织，培养得到T₀代转化植株；

3)PCR或southern杂交分析T₀代转化植株，筛选得到目的基因、选择标记基因和绿色荧光蛋白基因共转化的T₀代转化植株；

4)培育目的基因、选择标记基因和绿色荧光蛋白基因共转化的T₀代转化植株自交所得的T₁遗传分离群体，检测T₁植株，去除所有表达GFP荧光的植株，对余下的无GFP表达的植株进行PCR分析，获得只含有目的基因而不含标记基因的植株。

上述方法中，还包括筛选出纯合的无选择标记转基因株系的步骤：培育T₁代无选择标记转基因植株自交所得的T₂代植株，筛选出纯合的无选择标记转基因株系。其中，可通过PCR分析目的基因的分离。

上述方法中，在步骤4)中，可利用紫外灯或荧光显微镜检测T₁植株的叶片组织有无荧光。

上述双标记双T-DNA植物表达载体和方法中，所述植物包括双子叶植物和单子叶植物，如棉花、烟草、大豆、花生、番茄、辣椒、油菜或白菜，以及水稻、小麦、玉米、高梁、大麦、燕麦或黑麦等。当所述植物为烟草时，所述双标记双T-DNA植物表达载体为pCDTGNGUS。

本发明创造性地把绿色荧光蛋白基因(gfp)作为一个可视的剔除标记构建在与选择标记基因相同的T-DNA结构域上。在共转化有选择标记基因、gfp基因和目的基因植株的遗传分离后代中，由于gfp基因和选择标记基因位于同一T-DNA结构域上，二者在转基因后代植株中偕同遗传，因此通过简单的检测GFP的表达就能初步剔除含有选择标记基因的后代植株，结合PCR对剩下的植株进行检测就能高效的获得无选择标记的转基因植株(图1)。这一体系将比常规利用PCR检测所有分离植株的方法节省四分之三的工作量和费用。同时由于gfp基因能在许多种植物中稳定表达和方便地检测，所以这一体系能普遍适用于大多数包括双子叶植物、单子叶植物在内的作物，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为利用双标记双T-DNA载体系统高效率培育无选择标记转基因植物策略的示意图

图2为中间载体pBin19lacZ^-的物理图谱

图3为中间载体pCDMAR的物理图谱

图4为双T-DNA通用植物表达载体pCDTN的物理图谱

图5为中间载体pSPGUSA的物理图谱

图6为双T-DNA植物表达载体pCDTNGUS的物理图谱

图7为中间载体pSPmGFP5的物理图谱

图8为双标记双T-DNA植物表达载体pCDTGNGUS的物理图谱

图9为pCDTGNGUS的双T-DNA的线性结构

图10为转pCDTGNGUS载体T₀代烟草植株表达GFP绿色荧光的照片

图11为转pCDTGNGUS载体T₀代烟草植株PCR分析的电泳图谱

图12A为转pCDTGNGUS载体T₀代烟草植株以nptII为探针的Southern blot分析结果

图12B为转pCDTGNGUS载体T₀代烟草植株以mgfp5为探针的Southern blot分析结果

图12C为转pCDTGNGUS载体T₀代烟草植株以gusA为探针的Southern blot分析结果

图13A为转pCDTGNGUS载体T₀代烟草的自交T₁代植株叶片的GFP表达照片

图13B为从图13A相应幼苗切下的叶片在1.0mg l^-1和200mg l^-1kanamycin的MS培养基上培养15天的植株照片

图14为转pCDTGNGUS载体T₀代烟草的自交T₁代植株PCR分析的电泳图谱

图15A为转pCDTGNGUS载体T₀代烟草的自交T₁代植株以nptII为探针的Southern blot分析结果

图15B为转pCDTGNGUS载体T₀代烟草的自交T₁代植株以mgfp5为探针的Southern blot分析结果

图15C为转pCDTGNGUS载体T₀代烟草的自交T₁代植株以gus为探针的Southernblot分析结果

具体实施方式

定义

“植物表达载体”是指能驱动目的基因在植物体内表达的载体。

“Ti质粒”是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中的一种双链环状DNA分子，一般具有T-DNA区(transferred-DNA regions)、毒性区(virulenceregion)、质粒复制起点(origin of replication)和质粒结合转移位点(regionsencoding conjugation)。在农杆菌侵染植物细胞时，T-DNA区在毒性区的激活下能从Ti质粒上转移并整合到植物染色体中。Ti质粒载体系统目前被广泛应用于植物基因工程领域。

“T-DNA”是根癌农杆菌内Ti质粒上的一段能从质粒上转移并整合到寄主植物基因组中的DNA，即transferred DNA。T-DNA两端各有一段长约25bp的边界序列(border sequence)，分别称为左边界(LB)和右边界(RB)。边界序列的存在是T-DNA保留转移特性的必需元件。当保留T-DNA的边界序列时，以目的基因取代野生型T-DNA的部分基因组后，改造后的T-DNA仍能进入植物细胞并整合到植物染色体组中。T-DNA在受体植物染色体上的整合位点是随机的。目前，在植物基因工程应用中，野生型根癌农杆菌T-DNA中的致瘤基因被外源目的基因和选择标记基因替换，仅保留边界序列。

“基因”是指编码一种特定蛋白的全部或部分的核酸片段，并包括该编码区前面(5’非编码区)和后面(3’非编码区)的调控序列。

“外源基因”是指正常情况下宿主生物中没有的、通过基因转移导入的基因；也可指正常存在于宿主生物中的，但又被重新导入其基因组中其天然基因座之外的另一基因座的基因，这种变化会导致一种内源基因的编码序列的一个或几个额外拷贝的出现。

实施例1、双标记双T-DNA植物表达载体pCDTGNGUS的构建

EcoR I/Cla I双酶切载体pBin19(Bevan M 1984.Nucleic Acids Res 12：8711-8721)(Klenow酶补平EcoR I、Cla I酶切位点)，自连获得无多克隆位点的载体pBin19lacZ^-(图2)。BglII酶切pBin19lacZ^-，获得含T-DNA结构域的片段，插入到本实验室原先构建好的中间载体pCDMAR(图3)的Sac II(T₄DNA聚合酶削平Sac II)位点，获得双T-DNA通用植物表达载体pCDTN(图4)，该载体中包含两独立的T-DNA，其中一个T-DNA包含由nos启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因(nptII)作为选择标记基因，另一个T-DNA包含一个多克隆位点，可用于插入各种目的基因。Xho I/EcoRI双酶切载体pSPGUSA(图5，该载体包含一个由CaMV35S启动子和nos终止子控制的β-葡萄糖酸苷酶(β-glucuronidase)基因(gus)表达结构)获得由CaMV35S启动子和nos终止子控制的β-葡萄糖酸苷酶(β-glucuronidase，GUS)基因表达结构，插入到pCDTN的EcoR I/Sal I位点，形成载体pCDTNGUS(图6)。Hind III/Bgl II双酶切载体pSPmGFP5(图7，该载体包含一个由CaMV35S启动子和nos终止子控制的绿色荧光蛋白基因(mgfp5)表达结构)(Klenow酶补平Hind III、Bgl II酶切位点)，获得由CaMV35S启动子和nos终止子控制的绿色荧光蛋白基因(mgfp5)表达结构，插入到pCDTNGUS的Pme I位点中，形成双标记双T-DNA植物表达载体pCDTGNGUS(图8，图9)。载体pCDTGNGUS含有两个独立的T-DNA结构域，其中一个T-DNA包含新霉素磷酸转移酶基因(nptII)表达结构作为选择标记基因以及绿色荧光蛋白基因(mgfp5)表达结构作为可视剔除标记基因；另一个T-DNA包含β-葡萄糖酸苷酶(β-glucuronidase，GUS)基因表达结构作为报告基因，代表目的基因。在报告基因的两侧同时还含有两段同向来源于豌豆的MAR序列，该序列可以提高和稳定外源基因在受体植物中的表达(Li X G，et al.2001.Science in China(series C)44：400-408)。图9中，标出的内切酶为转基因植株Southern blot分析所用的酶。

构建过程中质粒提取、酶切、DNA的回收、纯化均按分子克隆中的方法进行(分子克隆：实验室手册，Sambrook et al，New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)。

实施例2、烟草转化植株的获得

利用改良叶盘法，通过农杆菌介导转化烟草。参照BIO-DAD公司电激仪的说明书，将植物表达载体pCDTGNGUS通过电激法转化到根癌农杆菌LBA4404中。含有植物表达载体的农杆菌LBA4404在含有kanamycin 50mg/L的YEB固体培养基上划线，28℃避光培养至长出直径约1mm大小的单菌落(约2-3天)，单菌落再度转接于同样的固体培养基上，培养至生长旺盛期(约2-3天)。取少许根癌农杆菌转接于20ml的YEB液体培养基中(kanamycin 50mg/L)于28℃，220rpm振荡培养过夜(约16小时)。次日以2％-4％的接种量转接于20ml不含抗生素的YEB液体培养基中，并补加乙酰丁香酮(AS)至终浓度为100μM。继续振荡培养3-4小时，到达对数生长中期时，用3.5倍体积的YEB液体培养基稀释至肉眼稍见浑浊即可(OD₆₀₀＝0.1)作转化用。取完全展开的烟草无菌苗叶片，用打孔器(直径0.9cm)制成叶盘，在菌液中浸泡8分钟。取出叶盘，用无菌滤纸吸干后，转入覆盖有一层无菌滤纸的共培养培养基(MS基本培养基+蔗糖30g/L+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.1mg/L)中于25℃暗培养2-3天后，将叶盘转入继代培养基(MS基本培养基+蔗糖30g/L+6-BA1.0mg/L+IAA 0.1mg/L+头孢噻肟钠500mg/L)中。在继代培养基中光照培养(光/暗周期为16/8小时)3天后，将叶盘转入筛选培养基(MS基本培养基+蔗糖30g/L+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.1mg/L+头孢噻肟钠500mg/L+kanamycin 80mg/L)。继续培养7-10天后，将叶盘转入再生培养基(MS基本培养基+蔗糖30g/L+6-BA 1.0mg/L+头孢噻肟钠500mg/L+kanamycin 80mg/L)。一个月左右叶片边缘长出再生芽至1-2cm，转入新的再生培养基中(MS基本培养基+蔗糖30g/L+6-BA 1.0mg/L+头孢噻肟钠500mg/L+kanamycin 80mg/L)。

再生芽长到3-4cm时，采用两种选择方式进行生根。第一种为常规的方法，即直接用解剖刀将再生芽切下，并转入生根培养基(MS基本培养基+蔗糖20g/L+kanamycin 50mg/L)中。第二种方法先以手提长波紫外灯(UVP B-100AP)对再生芽进行检测，表达绿色荧光的再切下转入生根培养基中(MS基本培养基+蔗糖20g/L+kanamycin 50mg/L)。为保证每个再生苗都是来自独立的转化事件，每个叶片只切一棵芽。再生苗在含有卡那的生根培养基上生根，一个月后统计生根情况。结果如表1所示，表明常规方法获得的芽75.6％(62/82)能生根，经绿色荧光蛋白筛选的芽则100％(55/55，包括两次实验)能够生根。说明常规转化程序结合绿色荧光蛋白筛选能够提高烟草转化的效率。

表1  转基因烟草T₀代植株共表达GUS性状的频率

筛选方法	重复	生根前总芽数	生根苗数	表达GFP苗数	PCR检测含有nptII和mgfp5基因但未表达GFP的生根苗数	表达GUS苗数	共表达频率(％)
								常规卡那筛选卡那筛选结合结合GFP选择总数	112-	822134-	622134-	532134108	4--4	30102363	52.647.667.656.3

实施例3、T₀代转基因烟草植株GUS共表达分析

将实施例2中的根系发育完全后的烟草幼苗转至温室生长，以手提长波紫外灯(UVP B-100AP)进行检测，结果如图10所示，表明阳性植株在紫外激发下发出绿色荧光，阴性植株则无绿色荧光。图10中，图片A为可见光条件下的照片，图片B为紫外光下的照片；左边植株为非转化对照植株，右边植株为转化植株。常规方法获得的生根苗85.5％(53/62)能够表达绿色荧光蛋白，其中未表达绿色荧光蛋白的9棵苗中有4棵能通过PCR检测到mgfp5和nptII基因的存在。经绿色荧光蛋白筛选的生根苗则100％表达绿色荧光蛋白。

T₀代转基因烟草植株的共转化行为通过检测gus基因的表达进行分析。GUS表达按Jefferson(1987.Plant Mol Biol Rep 5：387-405)的方法进行测定。取100mg烟草材料，加400ul提取液研磨，离心后吸取上清10ul，加200ul反应液(25ml提取液加入22mg MUG)，37℃保温30分钟，加入1ml终止液(0.2mol/LNa₂CO₃)于室温终止反应。用F-4500(日立)型荧光分光光度计360nm激发波长、460nm吸收波长下检测相对MU含量。总蛋白含量按标准Bradford(1976.AnalBiochem 72：248-254)方法进行，GUS活性以MU的纳摩尔数与总蛋白含量及时间的比值表示。GUS活性与非转化对照一致的记为阴性，明显高于对照的记为阳性。对三次转化获得的共112个(包括4个含有nptII和mgfp5基因但未表达GFP的生根苗)T₀代植株进行GUS检测，结果三次转化所获得的材料共表达GUS活性的频率分别为52.6％，47.6％和67.6％，平均为56.3％(表1)。

实施例4、T₀代转基因烟草植株的分子鉴定

1、烟草DNA的提取

CTAB法提取转基因烟草DNA。分别取实施例3中的112个T₀代转化烟草植株的新鲜叶片0.3mg置于研钵中，加液氮研成粉末，再加入0.6ml 60℃预热的CTAB缓冲液(30g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.2％的巯基乙醇，20mmol/LEDTA，100mmol/L Tris-HCl，pH8.0)。60℃保温30分钟，其间轻摇数次。然后加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，上清液转移到新的离心管中加入2/3倍体积异丙醇，形成的沉淀即是DNA，加入少许洗液(体积分数为76％的乙醇，10mmol/L NH₄AC)洗涤沉淀一次，干燥后用500μl TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA)溶解DNA。随后加入RNase A(终浓度10mg/L)，37℃保温30分钟，依次用等体积的苯酚、苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次，水相加入2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA。DNA干燥后溶解于100μL无菌水中。

2、PCR检测

对T₀代共112个转化植株进行PCR检测。取1μl DNA做模板进行PCR反应。nptII基因的引物为：引物1：N1，5’-GAA，CAA，GAT，GGA，TTG，CAC，GCA，GG-3’；引物2：N2，5’-AAG，AAG，GCG，ATA，GAA，GGC，GAT，GC-3’，扩增片段为774bp。mgfp5基因的引物为：引物1：M1，5’-ACC，CAG，ATC，ATA，TGA，AGC，GG-3’；引物2：M2，5’-TTG，GGA，TCT，TTC，GAA，AGG，GC-3’，扩增片段为415bp。gus基因的引物：引物1：G1，5’-CGA，ACT，GAA，CTG，GCA，GAC，TAT，C-3’；引物2：G2，5’-GGT，TCA，GGC，ACA，GCA，CAT，CAA，AG-3’，扩增片段为989 bp。每个反应体系均包括：5μl 10×PCR反应缓冲液、1μl 10mM引物1、1μl 10mM引物2、1μl DNA模板、4μl 2.5mM dNTPs，补加无菌水至总体积50μl。每个PCR反应条件均为：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟、52℃复性1分钟、72℃延伸1.5分钟，进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。取10μl PCR产物进行琼脂糖电泳检测。结果如图11所示，表明PCR检测的结果与GUS检测结果一致，共表达GUS活性烟草的DNA可以扩增出和预期片段同样大小的条带。图11中，M为DNA marker；P为阳性质粒pCDTGNGUS；N为对照植株，1-9为转基因植株；2、3、6、8、9为共转化gus基因的植株。

3、Southern杂交

对部分共转化有gus基因与mgfp5、nptII基因的植株进行Southern分析。约40μg DNA加入50unit的EcoR I酶切后，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离，用0.4N NaOH转移到Hybond-N+(Amersham pharmacia)膜上，转移后的膜在2×SSC中洗一下，80℃真空固定2小时。在含有7％SDS(W/V)的0.5M磷酸钠缓冲液中65℃预杂交2小时。用[α-³²P]dCTP(Amersham pharmacia)随机引物法进行探针标记(Promega标记试剂盒)。65℃杂交过夜，0.1×SSC中65℃洗膜，压X光片，放射性自显影。结果如图12A、图12B和图12C所示，表明杂交结果与PCR检测结果一致，8个植株中除了假阳性植株(泳道4)外，都能检测出mgfp5和nptII的杂交条带(图12B，C，泳道1-3，5-8)。5个共表达GUS活性的植株均能检测出gus的杂交条带(图12A，泳道2，3，5，6，8)。图12A、图12B和图12C中，P为阳性质粒；N为对照植株；1-3，5-8为T₀转基因烟草植株；4为假阳性植株。

实施例5、筛除含有选择标记基因的植株并高效率获得无选择标记的转基因植株

1、转基因烟草T₁代株系GFP表达性状和卡那霉素抗性性状的遗传分析

共转化植株在温室中培养至成熟，自交得到种子。取烟草种子适量，于温水(37℃)中浸泡3-4小时，使种子沉入水中，用30％次氯酸钠溶液灭菌8分钟，无菌蒸馏水洗三遍，温水(37℃)浸泡半小时。转接于MS培养基中(平皿)25℃培养，光/暗周期为16/8小时。在幼苗长到4-5叶期，切取小苗的第3个真叶，置于含有1.0mg/L 6-BA和200mg/L kanamycin的MS培养基上对其卡那霉素抗性性状进行分析，每个株系分析105或126个植株。烟草幼苗在切取叶片后继续在培养基上生长至5-6个叶片时在手提长波紫外灯(UVP B-100AP)下观测整株GFP表达性状。结果如图13A和图13B所示，图13A表明阳性植株在紫外激发下发出绿色荧光，阴性植株则发出红光。图13B表明叶片在抗性培养基上筛选10-15天后，具卡那霉素抗性的能明显生长，而敏感的则坏死变白。

卡那霉素抗性和GFP表达性状分析结果如表2所示，表明在29个T₁代株系中，除一个来源于K-50的T₁代株系无GFP表达，5个来源于K-1、G-3、G-30、G-41和G-44的后代株系中出现极少数植株GFP表达性状和卡那霉素抗性性状不一致外，GFP表达性状和卡那霉素抗性性状完全呈偕同遗传分离，说明通过快速检测GFP表达的方法能够取代常规叶片筛选的方法对转基因烟草T₁代中携带选择标记的遗传分离植株进行筛除。

2、转基因烟草T₁株系GUS表达性状与GFP表达性状、卡那霉素抗性性状的遗传分离

烟草幼苗在检测GFP性状后移植于温室中。对上述进行GFP表达性状和卡那霉素抗性性状遗传分析的T₁株系进一步进行GUS活性检测。方法同实施例3。结果如表2所示，表明在29个T₁代株系中，共有12(41.4％)个株系出现GUS表达性状与GFP表达性状、卡那霉素抗性性状分离，从而可以筛选出无选择标记转基因植株。分析结果还表明，在29个T₁代株系中，除来源于G-33的T₁代株系无GUS活性表达外，其余的28个株系的GUS表达活性均以符合3∶1、15∶1或63∶1的比例分离，说明GFP的表达对T-DNAs的共转化及其独立分离无负面的影响。

         表2转基因烟草T₁株系GUS表达性状与GFP表达性状、

                  卡那霉素抗性性状的遗传分离

T0代株号	T1代株数					T0代基因座位数b		T1代株数				T0代gus基因座位数b		无选择标记转化植株频率(％)
															总数	KanRa，GFP+a	KanR，GFP-	KanS，GFP+	KanS，GFP-	nptII	mgfp5	GUS+a，KanR，GFP+	GUS，KanS，GFP-	GUS-，KanR，GFP+	GUS-，KanS，GFP-	与nptII，mgfp5连锁	与nptII，mgfp5非连锁
	K-1K-5K-12K-15K-23K-24K-27K-40K-47K-50G-3G-7G-9G-10G-15G-19G-22G-30G-33G-34G-35G-36G-39G-41G-44G-49G-50G-51G-52	126126104126104124126126124126106106104126126126104126126104126126126126126104106126126	1079198951039011611792077757811985938211388751239811911691627610096	100000000870000000000000120000	100000000001000000200000000000	83563113410932392831267413322113829328793342302630	2121＞2122111112111211＞21221？e111	2121＞2122111112111211＞21221？e111	94c919895846695926787c78c757893859382115c0751146811993c93c62767296	026020027002400024602509019023002100200	24c00019242125250000260000880930024000280	896111710983928312141822238103579124230930	112110110111101112_d120211？e101															01010100100021010101010010010	020.6015.9021.70019.400023.14.8019.807.109.6018.30016.70015.90

注：^aKanR/S表示具卡那霉素抗性/对卡那霉素敏感；GFP+/-表示GFP阳性/GFP阴性；GUS+/-表示GUS阳性/GUS阴性；^bT₀代基因座位数通过对分离群体按3∶1，15∶1，63∶1的理论比例卡平方测验获得；^c包含KanR，GFP-或KanS，GFP+植株；^d未确定；^e不规律分离，未确定T₀代基因座位数。

3、转基因烟草T₁株系的分子鉴定

对上述方法筛出的所有GUS阳性，GFP和卡那霉素抗性阴性的植株及部分T₁代的整个株系进行PCR分析，部分植株同时进行Southern blot鉴定。DNA提取、PCR检测及Southern blot分析的方法同实施例4。PCR检测与Southern blot分析结果分别如图14和图15A、B和C所示，表明与GFP检测、叶片筛选法及GUS检测的结果一致，证实了所获得的GUS阳性，GFP和卡那霉素抗性阴性的植株为无选择标记的转基因植株。同时也说明利用双标记双T-DNA系统通过检测转基因烟草T₁代遗传分离植株GFP的表达快速筛除含有选择标记基因的植株能高效率地培育无选择标记的转基因植株。图14中，M为DNA marker；P为阳性质粒pCDTGNGUS；N为对照植株；1-11为T₀植株G-19的自交T₁代植株；4、9、10、14为分离所得的无选择标记转基因植株。图15A，B和C中，P为阳性质粒；N为对照植株；1-8为T₀植株G-19的自交T₁代植株；2、6、8为分离所得的无选择标记转基因植株。

Claims (10)

1、一种双标记双T-DNA植物表达载体，包含两个独立的T-DNA，其中一个T-DNA含有选择标记基因和绿色荧光蛋白基因，另一个T-DNA携带目的基因。

2、根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于：所述选择标记基因包括新霉素磷酸转移酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、潮霉素磷酸转移酶基因、膦丝菌素乙酰转移酶基因和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因。

3、根据权利要求1或2所述的植物表达载体，其特征在于：所述绿色荧光蛋白基因为能用于植物稳定表达的gfp基因。

4、根据权利要求1或2所述的植物表达载体，其特征在于：所述植物包括双子叶植物和单子叶植物。

5、根据权利要求4所述的植物表达载体，其特征在于：所述双子叶植物为烟草；所述双标记双T-DNA植物表达载体为pCDTGNGUS。

6、一种培育无选择标记转基因植物的方法，该方法包括以下步骤：

1)构建携带目的基因的双标记双T-DNA植物表达载体，并转入根癌农杆菌中；所述双标记双T-DNA植物表达载体，包含两个独立的T-DNA，其中一个T-DNA含有选择标记基因和绿色荧光蛋白基因，另一个T-DNA携带目的基因；

2)用步骤1)中含有所述双标记双T-DNA植物表达载体的根癌农杆菌转化植物受体组织，培养得到T₀代转化植株；

3)PCR或southern杂交分析T₀代转化植株，筛选得到目的基因、选择标记基因和绿色荧光蛋白基因共转化的T₀代转化植株；

4)培育目的基因、选择标记基因和绿色荧光蛋白基因共转化的T₀代转化植株自交所得的T₁遗传分离群体，检测T₁植株，去除所有表达GFP荧光的植株，对余下的无GFP表达的植株进行PCR分析，获得只含有目的基因而不含标记基因的植株。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法中，还包括筛选出纯合的无选择标记转基因株系的步骤：培育T₁代无选择标记转基因植株自交所得的T₂代植株，筛选出纯合的无选择标记转基因株系。

8、根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述植物包括双子叶植物和单子叶植物。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为棉花、烟草、大豆、花生、番茄、辣椒、油菜或白菜；所述单子叶植物为水稻、小麦、玉米、高梁、大麦、燕麦或黑麦。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为烟草；所述双标记双T-DNA植物表达载体为pCDTGNGUS。

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