CN1338001A - 用新外植体进行农杆菌介导的棉花转化 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产生转基因棉花植物的方法,包括如下步骤:(a)获得棉花须根外植体,(b)培养须根外植体以诱导愈伤组织形成,(c)将根愈伤组织与一种根癌农杆菌培养物接触,所述根癌农杆菌携带包含一外源基因和一选择标记的载体,所述农杆菌能将该外源基因和选择因子抗性基因稳定转移进所述外植体细胞的基因组中,(d)在选择因子抗性基因赋予针对其的抗性的选择因子的存在下培养所述愈伤组织,以选择转化的细胞,(e)在所选择的愈伤组织培养物中诱导体细胞胚胎形成,以及(f)将所诱导的体细胞胚胎再生成完整转基因棉花植物。

Description

用新外植体进行农杆菌介导的棉花转化
技术领域
本发明一般地涉及植物基因工程领域，特别涉及经新外植体的农杆菌转化及体细胞胚胎再生将外源遗传物质导入棉花的方法。
背景
棉花是纺织工业中最广泛应用的天然纤维，其在世界范围内的年产量超过1亿包(bales)，价值为450亿美元。棉绒或种子纤维是来自锦葵科棉属的50多个物种的终末分化的单表皮细胞，其被归类为天然的、纤维素类、单细胞和常产纤维。已被栽培了5000多年的棉花栽培品种均来自两个二倍体(2n＝2x＝26)(G.herbaceum和G.arboreum)和两个异源四倍体(2n＝4x＝52)(G.hirsutum L.，Upland；和G.barbadense L.，Sea Island)。在1997年，世界棉花生产国前5名是美国、中国、印度、巴基斯坦和乌茨别克斯坦，共产出约6千3百万包。
在下个世纪，大多数作物包括谷类、油料作物、水果、蔬菜和其它经济重要作物将被遗传工程化，以具有添加的或改变的性状，从产量和品质的改良直至除草剂抗性和害虫抗性(Chappell，1996；Fraley等，1986；Herrera-Estrella等，1983；Hoekema等，1983；Horsch等，1985；Jefferson，1987；Ryals，1996)。在棉花中，将应用新技术以增加产量、改善纤维品质和产生抗除草剂、害虫、线虫和疾病的新品种(John，1996；John & Keller，1996；John & Stewart，1992；Murray等，1993；Rajasekaran等，1996；Schell，1997；Stewart，1992)。
1、棉花的组织培养：1935年，Skovsted报道了棉花的第一个胚胎培养物。Beasley(1971)报道了棉花中愈伤组织的形成，其在MS培养基上从受精胚珠的珠孔端长出。从G.klotzschianum的悬浮培养物实现了体细胞胚胎发生(Prive & Smith，1979)。1983年，Davidonis & Hamilton在两年栽培后首次成功地从愈伤组织中有效及可重复地再生出棉花(G.hirsutum L.)植物。从此棉花植物从不同的外植体经体细胞胚胎发生而再生(Zhang & Feng，1992；Zhang，1994)，这些外植体包括子叶(Davinonis等，1987；Davidonis &Hamilton，1983；Finer，1988；Firoozabady等，1987)，胚轴(Cousins等，1991；Rangan & Zavala，1984；Rangan & Rajasekaran，1996；Trolinder & Goodin，1988；Umbeck等，1987，1989)，茎(Altman等，1990；Finer & Smith，1984)，茎尖(Bajaj等，1985；Gould等，1991；Turaev & Shamina，1986)，未成熟胚胎(Beasley，1971；Eid等，1973；Stewart & Hsu，1977，1978)，叶柄(Finer & Smith，1984；Gawel等，1986；Gawel & Robacker，1990)，叶(Finer & Smith，1984；Gawel &Robacker，1986)，根(Chen & Xia，1991；Kuo等，1989)，愈伤组织(Finer & McMullen，1986；Trolinder等，1991)和原生质体(Chen等，1989)。
2、棉花转化：外植体(如胚轴、子叶、从胚轴和子叶产生的愈伤组织、以及未成熟胚胎)已被用于农杆菌介导的转化和粒子轰击(de Framond等，1983；Finer & McMullen，1990；Firoozabady等，1987；Perlak等，1990；Rangan & Rajasekaran，1996；Rajasekaran等，1996；Trolinder等，1991；Umbeck等，1987，1989，1992)。另外，切下的胚轴的分生组织也已用于经粒子轰击进行棉花转化(Chlan等，1995；John，1996；John & Keller，1996；McCabe & Martinell，1993)。Zhou等(1983)通过将DNA注射进自体受粉一天后的中轴胎座而转化了棉花。但是，棉花转化高度依赖于基因型(Trolinder，1985a，1985b，1986；Trolinder & Goodin，1987，1988a，1988b)。除了少数栽培品种如Gossypium hirsutum cv.Coker312和G.hirsutum Jin 7是可再生和可转化的之外，大多数重要的精锐商业栽培品种如Gossypium hirsutum cv.D &P5415和G.hirsutum cv.Zhongmian12是不可通过这些方法再生和转化的。
基于以前的报道和本发明人自己的实验资料，用胚轴作物外植体可实现高效愈伤组织诱导(60％)。但是，转化率仅为20％(Firoozabady等，1987；Umbeck等，1987)。几种因素可导致非转化愈伤组织的突破，或导致主要由非转化细胞组成的嵌合愈伤组织的突破：(1)低卡那霉素水平(高水平卡那霉素对于棉花外植体和愈伤组织是毒性的)；(2)在愈伤组织增殖的后期阶段的依赖于经验的选择；和(3)使用仅于选择培养基(Firoozabady等，1987)部分接触的外植体如胚轴。当子叶用作外植体时，虽然转化率比使用胚轴高，但是其在随后的培养中经常很难除去农杆菌(Jiao G.-L.和Chen，Z.-X.，个人通讯；Umbeck等，1987，1989)。经粒子轰击进行的分生组织的转化率与农杆菌介导的转化相比非常低(0.02％-0.22％)。
因此，目前仍需要提供高转化率以及在再生的体细胞胚胎中高转化子率的生产转基因棉花植物的方法。
发明概述
本发明涉及生产转基因棉花植物的方法，包括如下步骤：(a)获得棉花须根外植体，(b)培养须根外植体以诱导愈伤组织形成，(c)将根愈伤组织与一种根癌农杆菌培养物接触，所述根癌农杆菌携带包含一外源基因和一选择标记的载体，所述农杆菌能将该外源基因和选择因子抗性基因稳定转移进所述外植体细胞的基因组中，(d)在选择因子抗性基因赋予针对其的抗性的选择因子的存在下培养所述愈伤组织，以选择转化的细胞，(e)在所选择的愈伤组织培养物中诱导体细胞胚胎形成，以及(f)将所诱导的体细胞胚胎再生成完整转基因棉花植物。
本发明方法与采用胚轴和子叶组织的先前技术相比提供了改善的转化率，据信本发明方法对于各种棉花品种有广泛适用性。
附图简述
图1示出质粒pBK9，其含有用于检测由本发明方法获得阳性转化子的萤光素酶基因。
图2示出质粒pVIP96，通过将萤光素酶基因插入其中而衍生出pBK9。
详细描述
为了克服现有技术中的缺点并提高转化效率，使用须根外植体进行农杆菌介导的棉花转化。尽管在拟南芥属中，用须根外植体实现了农杆菌介导的转化的高转化效率(Valvekens等，1988)，但是已报道在含2.0mg/L IAA，0.02-0.04mg/L IBA的MS培养基上来自棉花的嫩须根会分化(Kuo，C.C.等，1989)，文献中没有报道用须根作为外植体进行棉花转化。
本文中须根成功地用作外植体以进行农杆菌介导的转化和植物再生。在本方法中使用改良的籽苗培养用培养基，以及胚胎愈伤组织的再生和分化。
用于培养籽苗获得外植体材料的培养基设计成使根的褐变最小化(褐变负面影响外植体在培养物中生长及形成愈伤组织的能力)，并且促进完整健壮根的生长。在一优选的实施方案中，MET(多效三唑，农业中用于促进根生长的化学试剂)和NAA(α-萘乙酸)一起用于籽苗培养基中以降低褐变根的比例并增加愈伤组织发生率。MET优选地以约0.05mg/l-0.2mg/l的浓度应用，最优选约0.1mg/l。NAA优选地以约0.01mg/l-0.2mg/l的浓度应用，最优选约0.05mg/l。MET和NAA还优选地以类似于用于籽苗培养基的量用于从愈伤组织再生的根转基因籽苗的培养基。在愈伤组织形成培养基的一优选实施方案中，使用维生素B5，2，4-D((2，4-二氯苯氧基)乙酸)，MgCl2和葡萄糖，优选地约0.05mg/l-0.15mg/l 2，4-D，约0.4mg/l-1.2mg/l MgCl2，和约1％-5％葡萄糖，最优选地约0.1mg/l 2，4-D，约0.8mg/l MgCl2，和约3％葡萄糖。在在愈伤组织形成培养基的一替代优选实施方案中，使用肌醇、维生素B1和二甲基烯丙基(氨基)嘌呤，优选地约50mg/l-约150mg/l肌醇，约1mg/l-约10mg/维生素B1和约0.1mg/l-约7.5mg/l二甲基烯丙基(氨基)嘌呤，最优选地约100mg/l肌醇，约0.4mg/l维生素B1和约5mg/l二甲基烯丙基(氨基)嘌呤。在用抗生素选择的过程中也可使用用于诱导愈伤组织的相同培养基，例如含300-400mg/L头孢噻肟或15-30mg/L卡那霉素。存在高浓度(优选地约1900mg/l-约5700mg/l、最优选地约3800mg/l)硝酸盐(优选地NaNO3)对于分化培养基的观察到的有效性是关键的。用须根作为外植体虽然愈伤组织诱导率比子叶和下胚轴作外植体时低，但是能达到较高的转化率。
将外源基因导入农杆菌从而使其稳定地转移进与农杆菌接触的植物或植物组织中的技术是熟知的现有技术，而不是本发明的一部分。有利的是使用所谓的“去毒(disarmed)”农杆菌菌株或Ti质粒，即在这种菌株或质粒中负责形成由野生型农杆菌导致的冠瘿病的肿瘤特征的基因已被去除或失活。文献中可发现许多去毒农杆菌菌株的例子(例如，pAL4404，pEHA101和pEH105(Walkerpeach & Veltern，1994))。还有利的是使用所谓的双向载体系统，如美国专利4,940,838和5,464,763所述(Schilperoort等)和Hoekema等，1983。双向载体系统使得可以在大肠杆菌中操作携带欲导入植物的外源基因的质粒，从而使得载体构建过程更易于进行。
类似地，载体构建、包括包含希望导入植物的外源基因的嵌合基因的构建可用现有技术熟知的技术进行，其不是本发明的组成部分。嵌合基因应包含在希望表达的宿主中有活性的启动子。例如，有利的是包含一系列选择标记以便在转化方法的不同阶段选择转化的细胞。与在细菌中有活性的启动子相连的一个选择标记(例如赋予抗生素如卡那霉素、头孢噻肟或链霉素抗性的基因)使得能选择含有该标记的细菌(即转化子)。与植物活性启动子(如CaMV 35S启动子或一种T-DNA启动子如NPT II NOS启动子)相连的另一选择标记使得可选择转化的植物细胞。希望导入植物细胞的外源基因应包含与编码序列功能相关植物活性启动子，从而该启动子驱动基因在转化的植物中表达。同样，植物活性启动子如CaMV 35S启动子，NPT II NOS启动子或任何组织特异性启动子是本领域熟知的，且合适启动子的选择属于本领域常识。
本发明方法可用于产生表达任何外源基因的转基因植物，而不限于所选的基因。所需外源基因的选择取决于研究者的目的，现有技术中已知许多可用于本发明的所需基因的例子(例如，苏云金芽孢杆菌毒素基因家族，除草剂抗性基因如赋予草甘磷抗性的莽草酸合酶基因，美国专利5,188,642，或赋予2，4-D抗性的2，4-D单加氧酶基因，Bayley等，理论和应用遗传学，82卷，645-49页，雄性不育基因如美国专利5,741,684(Fabijanski等)的反义基因，或甚至是美国专利5,123,765(Oliver等)描述的精制作物保护系统)。
现有技术中认为农杆菌介导的棉花转化是高度依赖于品种的。已证实Coker系列的棉花品种相对易于转化。但是，DP5412，Zhongmain 12和许多其它品种的转化仍有困难。G.barbadense和其它双倍体物种的情况也是如此。理论上，粒子轰击、DNA注射和用农杆菌感染分生组织上可用于转化所有棉花品种的一些替代方法。这些方法相关的问题为转化效率低以及结果不稳定/不可靠。据信本发明方法在棉花品种转化方面具有广泛的适用性，因为它通过应用须根外植体克服或减轻了以前研究中遇到的与棉花转化相关的几个问题(如未转化愈伤组织的贯穿、外植体生长不良以及低转化率、体细胞再生差)。
下述缩写用于表示本发明所用的培养基：
LB培养基(10g bacto胰胨+5g bacto酵母膏+10g NaCl)；
B5培养基(Gamborg等，1968；Sigma，目录号G-5768)；
MS培养基(Murashige等，1962；Sigma，目录号M-5524)；
SH培养基(Stewart & Hsu，1977，Planta 137，113-117)；
CB-1.1(1/2MS+1/2B5维生素+0.1mg/L NAA)；
CB-1.2(1/2B5培养基)；
CB-2.1(MS macro+B5 micro+0.05mg/L 2，4-D+0.1mg/L细胞分裂素+3％葡萄糖+2g/L吉兰糖胶(PhytaGelTM，Sigma)+0.93mg/LMgCl2·6H2O，pH5.8)；
CB-2.2(MS macro+100mg/L肌醇+0.4mg/L维生素B1+5mg/L2iP(6-(γ-二甲基烯丙基(氨基)嘌呤)+0.2mg/L NAA+3％葡萄糖+2g/L吉兰糖胶(PhytaGelTM，Sigma)+0.93mg/L MgCl2·6H2O，pH5.8)；
CB-3.1(CB-2.1+500mg/L头孢噻肟+50mg/L卡那霉素)；
CB-3.2(CB-2.2+500mg/L头孢噻肟+50mg/L卡那霉素)；
CB-4(含有250mg/L头孢噻肟和20mg/L卡那霉素的通过加入双倍量的KNO3并除去NH4NO3而改进的CB-3.1或CB-3.2)；
CB-5(SH+1.5％蔗糖+2g/L吉兰糖胶(PhytaGelTM，Sigma)+0.93g/L MgCl2，pH7.0)。
下述实施例旨在描述本发明而非限制其范围，本发明的范围由权利要求书限定。实施例1：从根组织培养物中再生棉花植物
制备根外植体：棉花种子在70％乙醇中消毒10-15分钟，然后用10％H2O2处理30-120分钟。处理的种子在28℃于无菌水中湿润24小时，然后在28-30℃、16小时光照(60-90μE m-2s-1)下于CB-1.1培养基或CB-1.2培养基上萌发。7-10天后，用如此生长的无菌籽苗用于制备外植体。发现用CB-1.1培养基获得白色多发健康根(较长且较粗)，而用CB-1.2培养基获得灰色至棕色的较短且较细的根。因此，选择CB-1.1进行进一步工作。
愈伤组织的诱导：从籽苗中切下须根并于28-30℃在CB-2.1或CB-2.2培养基上培养3天，光照为16小时(60-90μE m-2s-1)。根外植体的最佳大小为5-7mm。在短至3天即在根段的切割部位出现少量小愈伤组织。通常，转化的胚轴或子叶外植体在培养3天后在诱导培养基上开始长出愈伤组织。但是，在本发明之前，通常发现转化的根外植体在培养10天后才出现愈伤组织。根外植体是白色的。一周后，从根段的其它部分也出现小愈伤组织。根外植体的变为灰色，甚至棕色。在培养2周后，愈伤组织出现于全部根外植体并生长良好。对于2种诱导培养基，发现CB-2.2能诱导良好的愈伤组织形成，而CB-2.1不能。在CB-2.2培养基上根外植体生长良好，在外植体的切割部位出现微型愈伤组织。约有10％的根外植体在培养基上仅3天后即出现愈伤组织。另一方面，尽管CB-2.1培养基很好地支持根外植体的生长，但是在切割部位未出现愈伤组织。在CB-2.2培养基上根外植体形成愈伤组织的效率为10％，其比胚轴或子叶外植体形成愈伤组织的效率(20-30％)低。下表1示出了愈伤组织诱导和转化效率的结果。
根愈伤组织的再生：一个月后，将愈伤组织转移至新培养基上以在CB-2.1或CB-2.2培养基上传代培养。传代培养2个月后，将成熟愈伤组织转移至CB-4(不合抗生素)以诱导体细胞胚胎。分别以0.5mg/L或0.2mg/L的量加入谷氨酰胺和L-天冬酰胺以促进胚胎发生。培养2个月后在胚胎发生愈伤组织上形成初级体细胞胚胎，其间在相同培养基上进行2次传代培养。一些体细胞胚胎发育成小植物，将这些小植物转移至CB-5培养基以诱导根。当小植物在CB-5培养基上产生根时(4-6周)，将其转移至土壤中并在高湿度下于28℃、16小时光照(60-90μE m-2s-1)下在温箱中保持，然后转移至温室中有土壤的大陶罐中。实施例2：农杆菌转化和培养
通过将来自质粒pGEMluc的BamHI/StuI片段的luc编码序列克隆进质粒pVIP96(见图2)的平端StuI位点以产生质粒pBK9(35S：LUC)(见图1)。
将-80℃的在Eppendorf管中的制备的感受态细胞(400微升)置于冰上融化，将质粒DNA加入到细胞中。温和混合后，将混合物在冰上保温45分钟。含有混合物的Eppendorf管置于液氮中1分钟，之后在水浴(37℃)中3分钟。保温后，将800微升LB培养基(不含抗生素)加入到混合物中，含有混合物的管在28℃保温3小时。在12000rpm短暂离心后，除去800微升上清。将其余的培养基与细胞沉淀完全混合并将混合物涂布于含100mg/L卡那霉素和100mg/L链霉素的LB平板上。在28°培养约48小时，成功转化的LBA4404细胞在平板上形成菌落。携带质粒pBK9(35S：LUC)的农杆菌菌株LB4404在含有卡那霉素(50mg/L)、链霉素(50mg/L)和refamycin(50mg/L)的LB平板上培养，用一个单个菌落接种不含抗生素的LB液体培养基，在28℃于旋转摇床上过夜培养约18小时。在使用前用液体LB培养基将光密度调整至0.1-0.4。实施例3：根外植体组织的转化以及转基因棉花植物的再生
如实施例1所述在CB-1.1培养基上培养消毒的棉花种子以获得根外植体。从籽苗上切下须根并在CB-2.2上培养2天，16小时光照(60-90μE m-2s-1)。随后将须根切成小段(5-10mm)并与实施例2的携带质粒pBK9(35S：LUC)的根癌农杆菌菌株LBA4404的细胞悬浮培养物(A600＝0.1-0.6)保温15分钟。吸去细菌溶液后，将根外植体在28℃、16小时光照(60-90μE m-2s-1)下培养2天。相对于根外植体的农杆菌菌株LBA4404的最佳浓度(A600＝0.1-0.4)低于相对于胚轴和子叶外植体的浓度(A600＝0.3-0.6)。最佳细菌浓度不影响根外植体的生长以及随后的愈伤组织诱导。
用无菌蒸馏水清洗共培养的外植体2次并将其转移至CB-3.1或CB-3.2培养基上以在28℃、16小时光照(60-90μEm-2s-1)下培养。
4周后，选择卡那霉素抗性愈伤组织并在相同培养基上传代培养以进行第二次选择。同时，选择一些愈伤组织用萤光素酶荧光成像系统检测LUC表达(见实施例4)。诱导愈伤组织的过程进行2个月。根外植体诱导愈伤组织的效率低于胚轴和子叶外植体。
将卡那霉素抗性愈伤组织转移至CB-4培养基上以诱导胚胎发生愈伤组织和体细胞胚胎。传代一次培养4-6周后，在愈伤组织上出现成熟体细胞胚胎。之后从一些胚胎中发育小植物，然后将绿色小植物转移至生根培养基(CB-5)以诱导根。当小植物长出根后，将其转移至土壤中并在高湿度下于28℃、16小时光照(60-90μE m-2s-1)下在温箱中保持3-4周，然后转移至温室中有土壤的大陶罐中。实施例4：萤光素酶活性检测
植物材料(如愈伤组织、叶和整个小植物)用含有0.5nM萤光素钾和0.01％(w/v)聚环氧乙烷山梨聚糖单月桂酸酯(Tween-20)的溶液喷洒并放置30分钟。用购自Prinston仪器公司(3660 QuakerbridgeRoad，Trenton，NJ08619)的增强成像照相机和光子计数图像处理器观察来自植物材料的萤光素酶荧光。曝光时间为6分钟。将电子图像转为Microsoft Powerpoint TIEF文件并从标准彩色打印机打印。
选择在所选的培养基上生长1个月的愈伤组织用视觉成像系统测试LUC表达。阳性转化的愈伤组织有白色斑点而未转化的愈伤组织没有。在139个卡那霉素抗性愈伤组织中有49个呈LUC活性阳性。因此转化成功率为35％，其比用子叶或胚轴作为外植体观察到的转化成功率(20％)要高得多。表1  用根作外植体进行转化的结果概述
品种  构建体 菌株浓度 所选培养基的日期 外植体数 愈伤组织数量 LUC测试数量 LUC+数
Coker312  35S-LUC  0.1-0.2  9/10/97  2574  156  16  12
 35S-LUC  0.43  23/10/97  1255  70  8  5
 35S-LUC  0.438  23/10/97  564  46  28  19
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Claims (30)

1、一种产生转基因棉花植物的方法，包括如下步骤：
(a)获得棉花须根外植体，
(b)培养须根外植体以诱导愈伤组织形成，
(c)将根愈伤组织与携带含外源基因和选择标记的载体的根癌农杆菌培养物接触，所述农杆菌能使该外源基因和选择因子抗性基因稳定转移进愈伤组织细胞的基因组，
(d)在所述选择因子抗性基因赋予针对其的抗性的选择因子存在下培养愈伤组织以选择转化的细胞，
(e)在所选的愈伤组织培养物中诱导体细胞胚胎形成，以及
(f)将诱导的体细胞胚胎再生成完整的转基因棉花植物。
2、权利要求1的方法，其中棉花须根外植体是通过在多效三唑存在下培养棉花籽苗而获得。
3、权利要求2的方法，其中多效三唑的浓度为约0.05mg/l-0.2mg/l。
4、权利要求3的方法，其中多效三唑的浓度为约0.1mg/l。
5、权利要求2的方法，其中棉花籽苗在还存在α-萘乙酸的条件下培养。
6、权利要求5的方法，其中α-萘乙酸的浓度为约0.01mg/l-0.2mg/l。
7、权利要求6的方法，其中α-萘乙酸的浓度为约0.05mg/l。
8、权利要求1的方法，其中体细胞胚胎再生步骤在多效三唑存在下进行。
9、权利要求8的方法，其中其中多效三唑的浓度为约0.05mg/l-0.2mg/l。
10、权利要求9的方法，其中多效三唑的浓度为约0.1mg/l。
11、权利要求8的方法，其中体细胞胚胎再生步骤在还存在α-萘乙酸的条件下培养。
12、权利要求11的方法，其中α-萘乙酸的浓度为约0.01mg/l-0.2mg/l。
13、权利要求12的方法，其中α-萘乙酸的浓度为约0.05mg/l。
14、权利要求1的方法，其中诱导愈伤组织形成的步骤在包含肌醇、维生素B1和二甲基烯丙基(氨基)嘌呤的愈伤组织诱导培养基中进行。
15、权利要求1的方法，其中诱导体细胞胚胎形成的步骤在包含肌醇、维生素B1和二甲基烯丙基(氨基)嘌呤的体细胞胚胎诱导培养基中进行。
16、权利要求14的方法，其中愈伤组织诱导培养基包含50mg/L-150mg/L的肌醇，0.2-10mg/L的维生素B1和0.1-7.5mg/L的二甲基烯丙基(氨基)嘌呤。
17、权利要求16的方法，其中愈伤组织诱导培养基包含100mg/L的肌醇，0.4mg/L的维生素B1和5mg/L的二甲基烯丙基(氨基)嘌呤。
18、权利要求15的方法，其中体细胞胚胎诱导培养基包含50mg/L-100mg/L的肌醇，0.2-10mg/L的维生素B1和0.01-0.5mg/L的二甲基烯丙基(氨基)嘌呤。
19、权利要求18的方法，其中体细胞胚胎诱导培养基包含100mg/L的肌醇，0.4mg/L的维生素Bl和5mg/L的二甲基烯丙基(氨基)嘌呤。
20、权利要求1的方法，其中诱导愈伤组织形成的步骤在包含维生素B5、(2，4-二氯苯氧基)乙酸、MgCl2和葡萄糖的愈伤组织诱导培养基中进行。
21、权利要求1的方法，其中诱导体细胞胚胎形成的步骤在包含维生素B5、(2，4-二氯苯氧基)乙酸、MgCl2和葡萄糖的体细胞胚胎诱导培养基中进行。
22、权利要求20的方法，其中愈伤组织诱导培养基包含0.2mg/L-10mg/L维生素B5、0.05mg/L-0.15mg/L(2，4-二氯苯氧基)乙酸、0.4mg/L-1.2mg/L MgCl2和1％-5％葡萄糖。
23、权利要求22的方法，其中愈伤组织诱导培养基包含0.4mg/L维生素B5、0.1mg/L(2，4-二氯苯氧基)乙酸、0.8mg/L MgCl2和3％葡萄糖。
24、权利要求21的方法，其中体细胞胚胎诱导培养基包含0.2mg/L-10mg/L维生素B5、0.05mg/L-0.15mg/L(2，4-二氯苯氧基)乙酸、0.4mg/L-1.2mg/L MgCl2和1％-5％葡萄糖。
25、权利要求24的方法，其中愈伤组织诱导培养基包含0.4mg/L维生素B5、0.1mg/L(2，4-二氯苯氧基)乙酸、0.8mg/L MgCl2和3％葡萄糖。
26、权利要求14-25任一项的方法，其中所述培养基还包含吉兰糖胶。
27、权利要求26的方法，其中吉兰糖胶的量为1.0g/L-3.0g/L。
28、权利要求1的方法，其中诱导体细胞胚胎培养物的步骤在包含1900mg/L-5700mg/L硝酸盐的体细胞胚胎诱导培养基中进行。
29、权利要求28的方法，其中体细胞胚胎诱导培养基包含3800mg/L硝酸盐。
30、权利要求28或29的方法，其中硝酸盐是NaNO3。
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