CN116751811A - 一种陆地棉高效遗传转化受体的培育方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种陆地棉高效遗传转化受体的培育方法及应用，以湖北省高产阔叶品种‘鄂棉22’(E22)为母本，以高再生能力的鸡脚叶‘豫早1号’(YZ‑1)为父本，构建遗传稳定的F9的重组自交系，利用IK(IBA+KT)和DK(2,4‑D+KT)两种不同激素组合的培养体系对群体进行再生能力的评估，并对筛选到的高再生阔叶棉进行遗传转化效率鉴定以及农艺性状考察，通过该方法最终制备得到了农艺性状优良且遗传转化效率较高的棉花受体，拓宽了可再生的陆地棉基因型，为棉花遗传转化提供优良受体材料，丰富了目前主流的棉花转基因受体材料。

Description

一种陆地棉高效遗传转化受体的培育方法及应用
技术领域
本发明属于植物育种技术领域，具体涉及一种陆地棉高效遗传转化受体的培育方法及应用。
背景技术
棉花是世界上重要的纤维和油料作物，在我国的经济发展中有着举足轻重的地位。传统的杂交育种法已经难以满足棉花遗传改良的需要，分子水平育种是棉花种质创新的热点。体细胞胚胎发生利用植物细胞全能性重演了合子胚形态发生。而现代分子生物技术的应用大都基于植物的组织培养技术才能取得成功，因此在棉花的新品种选育过程中，组织培养技术变得至关重要。Steward和Reinert通过悬浮培养的手段对胡萝卜韧皮部细胞进行诱导，并获得了体细胞胚，进一步培养获得了首例再生植株，开启了探索如何使植株再生的新时代。1912年Robins通过在培养基中添加不同种类的物质，利用该培养基对棉花的根尖进行培养，获得了缺绿的茎和根，这是首次关于棉花组织培养的报道。
棉花组织培养体系的构建起步较晚，但发展迅速。1971年Beasiey首次诱导出愈伤组织，Price和Smith(1979)利用悬浮培养技术成功的诱导出了棉花体细胞胚，1983年Davidonis经过长时间的继代培养，成功获得第一株棉花再生植株。张献龙提出棉花的基因型是影响体细胞胚胎发生和植株再生的首要因素。通过对四个栽培品种的比较发现，再生能力高低在栽培种之间也存在较大的差异：陆地棉＞亚洲棉＞海岛棉＞非洲棉；同一栽培种的不同棉花品种间也存在差异，例如陆地棉中，珂字棉＞岱字棉＞斯字棉。历经十几年的研究探索，棉花组织培养体系逐渐完善，随后进入快速发展时期。通过对再生能力相关的基因进行定位和克隆，用以改造农艺价值高但再生能力低的基因型，是实现作物转基因生产的有效手段。
有研究表明，鸡脚叶陆地棉品种‘豫早1号’(YZ-1)的再生能力强，转化周期短，成苗率高，但是YZ-1具有超鸡脚叶，农艺性状差，以其为受体的转基因难以应用在生产实践上。由于棉花体细胞胚胎发生和植株再生对棉花基因型的依懒较大，根据已报道的不同棉花品种的再生培养体系，选择与亲本相关的再生体系对构建的群体进行再生能力进行评估，并尝试定位与体细胞胚发生和再生能力相关的位点，有针对性的将这些位点导入到农艺性状优良的品种中去，可拓宽优良品种作为转基因受体的选择。
发明内容
本发明的目的之一在于提供了一种陆地棉高效遗传转化受体的培育方法，包括以下步骤：材料创制→高再生材料筛选→高遗传转化材料筛选，其中所述材料创制包括：以‘鄂棉22’为母本，以‘豫早1号’为父本杂交后，多代自交构建遗传稳定的F9代重组自交系。
进一步地，所述高再生材料筛选包括：对所述遗传稳定的F9代重组自交系的无菌苗下胚轴进行愈伤组织诱导、分化出胚和植株再生培养，筛选出高再生材料。
进一步地，步骤包括：
(1)愈伤组织诱导：采用IBA+KT和/或2,4-D+KT两套愈伤组织诱导培养体系，对所述无菌苗下胚轴进行培养；
(2)分化出胚：培养得到胚性愈伤组织，对棉花再生能力性状进行统计筛选，得到所述高再生材料；
(3)将所述胚性愈伤组织依次接种至分化培养基、生根培养基中，并水培获得再生植株。
进一步地，所述棉花再生能力性状包括：愈伤组织诱导率、愈伤组织继代繁殖力、愈伤组织出胚时间、愈伤组织出胚率。
进一步地，所述棉花再生能力性状的计算方法为：
愈伤组织诱导率：出愈伤块数/诱导愈伤总块数×100％；
愈伤组织继代繁殖力：继代25d后的愈伤重-继代0d的愈伤重；
愈伤组织出胚时间：单个家系中最早出现胚性愈伤的时间；
愈伤组织出胚率：出现胚性愈伤的块数/继代总块数×100％。
进一步地，筛选其中愈伤组织诱导率高于98％；愈伤组织继代繁殖力高于4.2g、愈伤组织出胚时间不高于116d、愈伤组织出胚率高于82.4％的家系，得到所述高再生材料。
进一步地，所述高遗传转化材料的筛选包括：对所述高再生材料利用农杆菌介导的棉花遗传转化体系，以荧光蛋白为报告基因，获得转基因植株，并筛选得到遗传转化效率不低于80％的转基因家系。
进一步地，高遗传转化材料的筛选步骤如下：
(1)培养方法的选择，针对在两种体系下均可以再生的家系，采用IBA+KT培养体系；只能在IK体系或者DK体系下再生的家系采用IK或者DK体系。
(2)培养基的选择，包括无菌苗萌发培养基、农杆菌活化培养基、共培养基、愈伤组织诱导培养基、体细胞胚分化培养基、植株生根培养基；
(3)遗传转化效率分析，对每个家系获得的转基因植株，用体式荧光显微镜观察植株中荧光蛋白的表达情况，统计转基因阳性单株，分析遗传转化效率。
进一步地，所述步骤还包括：对所述高遗传转化材料的农艺性状进行考察，最终筛选得到农艺性状优良且再生能力和遗传转化效率高的再生材料。
本发明的目的还在于提供了一种陆地棉高效遗传转化受体的培育方法在培养陆地棉高效遗传转化受体中的应用。
本发明的目的还在于提供了一种陆地棉高效遗传转化受体的培育方法所获得的陆地棉高效遗传转化受体。
本发明的目的在于提供了一种陆地棉高效遗传转化受体的培育方法及应用。本发明以湖北省高产阔叶品种‘鄂棉22’(E22)为母本，以高再生能力的鸡脚叶‘豫早1号’(YZ-1)为父本杂交后，多代自交构建遗传稳定的F9代重组自交系，利用IK(IBA+KT)和DK(2,4-D+KT)两种不同激素组合的培养体系对群体进行再生能力的评估，并对筛选到的高再生阔叶棉进行遗传转化效率鉴定，得到遗传转化效率较高的棉花受体，进一步通过对农艺性状考察，从而可制备得到农艺性状优良且遗传转化效率较高的棉花受体，拓宽了可再生的陆地棉基因型，为棉花遗传转化提供优良受体材料，丰富了目前主流的棉花转基因受体材料。
附图说明
图1为本发明的技术路线。
图2为本发明中IK和DK体系下再生能力评估流程图。
图3为本发明中IK和DK两种培养体系的培养过程图。图(a)和(b)所示分别为IK体系和DK体系下的再生过程图，其中A为切好的下胚轴段在愈伤组织诱导培养基上培养，B为诱导出来的非胚性愈伤组织，C为胚性愈伤组织，D为分化出来的胚状体，E为分化出来的生根苗，F为水培的再生植株。
图4为愈伤组织的CSC、CET和CRE的频率分布直方图。(a)和(b)所示分别为在IK和DK体系下愈伤组织的CSC、CET和CRE的频率分布图以及在IK和DK体系下均可再生家系的愈伤组织CSC、CET和CRE的频率分布图。其中A为CSC，B为CET，C为CRE。
图5为高再生家系再生植株一览图。
图6为高再生阔叶家系遗传转化过程图。对高再生阔叶棉家系进行无菌苗培养，以RFP为报告基因，利用农杆菌介导的棉花遗传转化体系进行转化。A为培养好的无菌苗，B为切好的下胚轴段与转化了RFP基因的农杆菌进行共培养，C为转化到筛选培养基上进行愈伤组织的诱导，D为诱导出来的非胚性愈伤组织，E为分化出来的胚性愈伤组织以及胚状体，F为分化出来的再生植株，G为水培的转基因T0植株。
图7为高再生阔叶家系转化RFP效率鉴定图。对获得的转基因T0代植株进行阳性鉴定，利用荧光体式显微镜观察转基因叶片的RFP表达情况。A、B、C、D为白光下的图片，E、F、G、H为对应的在荧光下的图片，A和E为培养过程中的胚性愈伤组织，B和F为培养过程中的胚状体，C和G为转基因植株的叶片，D和H为转基因植株的叶片，其中左边所示为阳性植株，右边所示为转基因阴性植株。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1材料创制及再生能力的评估
以湖北省高产阔叶品种‘鄂棉22’(E22)为母本，以高再生能力的鸡脚叶‘豫早1号’(YZ-1)为父本杂交后，多代自交构建遗传稳定的F9代的重组自交系YE。
对YE家系及亲本E22和YZ-1的种子的下胚轴进行愈伤组织的诱导、分化出胚和植株再生培养，筛选出高再生材料。步骤如下：
(1)无菌苗培养。
选择籽粒饱满、发育正常的种子，剥去棉籽种皮，浸泡于10％的升汞溶液中10min，再用无菌水冲洗3次以上，接种于无菌苗培养基上，待种子露白之后将根插入培养基中进行扶苗，封口置于28℃黑暗恒温箱中培养2-3d。
(2)再生材料的获得。
取无菌苗下胚轴切成0.5cm-0.8cm小段分别接种于两种愈伤诱导培养基上(IK和DK)。IK和DK体系下再生能力评估流程图如图2所示，其中IK体系包括：MS培养基+1mg/L IBA+0.2mg/L KT；DK体系包括：MS培养基+1mg/L2,4-D+0.2mg/L KT。每个家系培养3瓶，每瓶初始放置10段下胚轴，称取0d的重量并记录。所有培养物均置于28±2℃，光照强度(冷光源135umolm-2s-1)，每天光照14h的条件下进行培养。每隔25d-30d后采用各自所属体系进行继代直至出现胚性愈伤组织，然后将其转接于分化培养基(MS大量元素50ml，微量元素10ml，铁盐10ml，肌醇10ml，硝酸钾50ml，L-Gly 1ml，B5有机物1ml，IBA 1ml，KT 0.3ml，谷氨酰胺1g，天冬酰胺0.5g，葡萄糖30g，Phytagel2.6g，pH值6.1-6.2，ddH2O定容至1升)，直至培养出体细胞胚及幼苗；将幼苗转接于生根培养基(MS大量元素25ml，微量元素5ml，铁盐5ml，肌醇10ml，L-Gly1ml，B5有机物1ml，葡萄糖15g，Phytagel 2.6g，pH值5.90-5.9，ddH2O定容至1升)，直至获得再生植株。将获得的再生植株进行水培、炼苗，然后移栽到温室土钵中并统计每个家系最终获得的再生苗。
(3)愈伤组织相关性状鉴定。
愈伤组织诱导过程中，每隔25d后采用各自所属体系进行继代，统计出愈伤组织的诱导率(CIF)。第一次(25d)继代时称取每个家系的增殖重量，求取平均值，计算愈伤组织继代繁殖力(CSC)。随着愈伤的快速增长，在继代过程中随机减少愈伤的块数，在继代过程中统计愈伤组织出胚时间(CET)和愈伤组织的出胚块数以及瓶数，从而计算愈伤组织的出胚率(CRE)。具体计算方法如下所示：
愈伤组织诱导率(CIF)：出愈伤块数/诱导愈伤总块数×100％；
愈伤组织继代繁殖力(CSC)：继代25d后的愈伤重-继代0d的愈伤重；
愈伤组织出胚时间(CET)：单个家系中最早出现胚性愈伤的时间；
愈伤组织的出胚率(CRE)：出现胚性愈伤的块数/继代总块数×100％；
结果如图4所示，结果显示，所有家系的愈伤组织诱导率均接近100％，在两种体系下无差异；在愈伤组织继代繁殖力、最早出胚时间和出胚率这些关键的再生指标上，IK(IBA+KT)和DK(2,4-D+KT)体系存在一定差异，如图4(b)所示，对于CSC性状，DK体系为：2.1g-7.4g，平均值为4.8g，IK体系为：2.8g-5.7g，平均值为4.2g；对于CET性状，DK体系为：75d-154d，IK体系为：67d-116d；对于CRE性状，DK体系为：33.3％-100％，平均值为86.3％，IK体系为：25％-100％，平均值为82.4％。综合以上三种性状统计结果，DK体系愈伤增殖较快，IK体系最早出胚时间早于DK体系，可见过度的愈伤增殖并不会加快胚性愈伤的出现。对YE家系的培养体系的选择上，IK体系更为适合。
筛选其中愈伤组织诱导率高于98％，接近100％；愈伤组织继代繁殖力高于4.2g、愈伤组织出胚时间不高于116d、愈伤组织出胚率高于82.4％的植株，得到所述高再生材料。所述高再生植株一览图如图5所示。
实施例2高再生阔叶棉遗传转化效率鉴定。
对所得高再生阔叶棉家系，进行遗传转化效率分析，以红色荧光蛋白(RFP)为报告基因，利用农杆菌介导的棉花遗传转化体系，获得转基因植株，其过程图如图6所示。具体步骤如下：
(1)培养体系的选择。针对在两种体系下均可以再生的家系，采用IBA+KT(IK)培养体系；只能在IK体系或者DK体系下再生的家系采用IK或者DK体系。
(2)转基因植株的获得。
选择籽粒饱满、发育正常的种子，剥去棉籽种皮，浸泡于0.1的升汞溶液中10min，再用无菌水冲洗3次以上，接种于无菌苗培养基上，待种子露白之后将根插入培养基中进行扶苗，封口置于28℃黑暗恒温箱中培养2-3d；取无菌苗下胚轴切成0.5cm-0.8cm小段接种于愈伤诱导培养基上上，每个家系培养6瓶，所有培养物均置于28±2℃，光照强度(冷光源135umolm-2s-1)，每天光照14h的条件下进行培养。每隔25d-30d后采用各自所属体系进行继代直至出现胚性愈伤组织，然后将其转接于分化培养基中直至培养出体细胞胚及幼苗，将幼苗转接于生根培养基中培养直至获得转基因植株，将获得的转基因植株进行水培、炼苗，然后移栽到温室土钵中并统计每个家系最终获得的转基因植株。
(3)可遗传转化家系的转化效率分析以及主要农艺性状考察。
对每个家系获得的转基因植株，用体式荧光显微镜观察植株中红色荧光蛋白表达情况，统计转基因阳性单株，分析遗传转化效率；
遗传转化效率＝转基因阳性单株/转基因总单株数*100％。
转化RFP效率鉴定图如图7所示。
筛选得到遗传转化效率不低于80％的转基因阔叶家系YE3，其遗传转化效率为82.9％。
即通过本发明所述的方法最终可以筛选得到遗传转化效率较高的棉花受体，其中遗传转化效率最高可达到82.9％。
进一步考察遗传转化效率较高的阔叶家系以及母本E22和父本YZ-1主要的农艺性状，包括纤维长度、纤维强度、纤维细度、纤维伸长率和纤维整齐度以及衣分，具体如表1所示。
表1.可转化阔叶棉家系及其父母本农艺性状考察
结果表明，所得材料在纤维相关的主要农艺性状尤其是在纤维强度，纤维伸长率以及衣分上的表现明显优于可再生亲本。综上，通过本发明所述方法，结合遗传转化效率分析以及主要农艺性状考察，最终可得到转化效率高且农艺性状优良的转基因受体材料。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种陆地棉高效遗传转化受体的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：材料创制→高再生材料筛选→高遗传转化材料筛选，其中所述材料创制包括：以‘鄂棉22’为母本，以‘豫早1号’为父本杂交后，多代自交构建遗传稳定的F9代重组自交系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高再生材料筛选包括：对所述遗传稳定的F9代重组自交系的无菌苗下胚轴进行愈伤组织诱导、分化出胚和植株再生培养，筛选出高再生材料。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤包括：
(1)愈伤组织诱导：采用IBA+KT和/或2,4-D+KT两套愈伤组织诱导培养体系，对所述无菌苗下胚轴进行培养；
(2)分化出胚：培养得到胚性愈伤组织，对棉花再生能力性状进行统计筛选，得到所述高再生材料；
(3)将所述胚性愈伤组织接种至分化培养基，分化出的幼苗接种至生根培养基中，最后水培获得再生植株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述棉花再生能力性状包括：愈伤组织诱导率、愈伤组织继代繁殖力、愈伤组织出胚时间、愈伤组织出胚率。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述棉花再生能力性状的计算方法为：
愈伤组织诱导率：出愈伤块数/诱导愈伤总块数×100％；
愈伤组织继代繁殖力：继代25d后的愈伤重-继代0d的愈伤重；
愈伤组织出胚时间：单个家系中最早出现胚性愈伤的时间；
愈伤组织出胚率：出现胚性愈伤的块数/继代总块数×100％。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，筛选其中愈伤组织诱导率高于98％；愈伤组织继代繁殖力高于4.2g、愈伤组织出胚时间不高于116d、愈伤组织出胚率高于82.4％的家系，得到所述高再生材料。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高遗传转化材料的筛选包括：对所述高再生材料利用农杆菌介导的棉花遗传转化体系，以荧光蛋白为报告基因，获得转基因植株，并筛选得到遗传转化效率不低于80％的转基因家系。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤还包括：对所述高遗传转化材料的农艺性状进行考察。
9.权利要求1-8任一项所述方法在培育陆地棉高效遗传转化受体材料中的应用。
10.根据权利要求1所述方法获得的陆地棉高效遗传转化受体。
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金双侠: "棉花遗传转化体系的优化及突变体的创制", 中国博士论文全文数据库 农业科技辑, no. 02, 15 February 2007 (2007-02-15), pages 54 - 55 *
陈天子;杨郁文;邓惠清;刘正銮;刘蔼民;张保龙;: "新疆陆地棉高效体细胞胚胎发生系的培育及其遗传转化", 分子植物育种, no. 06, 28 November 2013 (2013-11-28), pages 775 - 782 *

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