CN1356389A - 一种无选择标记的植物转基因方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种无选择标记的植物转基因方法,所构建的转化DNA片段中没有选择标记基因,通过设置在转化DNA片段两端的植物核DNA的保守序列与植物核DNA之间的同源交换重组实现基因转化。这种方法能够提高转化效率;转化受体植株中没有选择标记基因,解除了选择标记基因对转基因植物和转基因食品的影响。本发明适合于可通过花粉管通道介导转化的植物,对转化的外源基因也没有特别的限制。
Description
本发明为一种无选择标记的植物转基因方法，属于生物学领域，特别涉及到基因工程技术。
目前，植物转基因系统均以抗生素类药物基因或除草剂类药物基因作为选择标记基因，用于转化体的筛选。这些标记基因在环境和食品的安全性上存在许多问题：编码抗生素或除草剂的基因是否会通过基因逃逸渠道使转基因植物的近缘野生种转变成杂草，破坏自然生态环境，打破原有生物种群动态平衡；转基因植物进入土壤后是否会对土壤多样性产生影响；抗生素编码基因是否会发生水平转移，导致微生物的抗药性等等。目前，对这些问题的解决方法是对转基因植物进行安全性评价，但并没有解决选择标记基因对转基因植物和转基因食品的安全性的影响。
本发明提供了一种无选择标记的植物转基因方法。利用本发明技术进行植物转基因，能够解决选择标记基因对转基因植物及转基因食品的影响。
本发明利用PCR技术构建含有目的基因和位于目的基因两侧的植物蛋白编码基因的保守序列，花粉管通道介导转化植物，通过转化基因两端的植物基因同源序列与植物基因组DNA的同源重组实现外源目的基因的转化。本发明的转化系统无选择标记基因，设计在转化基因两端的植物基因序列是植物基因组DNA中的保守序列，它在分子水平上为提高外源基因的转化率奠定了基础，实现了无选择标记基因条件下的转化体的筛选。
花粉管通道介导的种质转化系统能够将裸露的DNA依靠生物自身的种质系统，使外源DNA片断与植物受体DNA在复制过程中重组，实现外源基因在植物整体水平上的转化。重组的基础是外源DNA与植物受体DNA存在同源序列。
已知高等植物编码蛋白质的基因结构如下：
在转录起始位点上游的启动子区域中存在着两个核苷酸序列高度保守区域：TATAbox和CAATbox。TATAbox的保守序列为：TCACTATATATAG；CAATbox的保守序列为GG(T/C)CAATCT。
本发明构建用于基因转化的DNA片断(DNAphy)如下：5′-CAATbox-TATAbox-CaMV35S-phyAII-CUS-Nos-Tem-3′
构建策略如下：
(1)将外源目的基因置于启动子CaMV35S和终止子Nos-Tem之间，以保证外源目的基因的正常转录。本发明的外源目的基因为来自于无花果曲霉(A.ficuum)AS3.324编码PHYA的植酸酶基因phyAII。
(2)使报告基因GUS与外源目的基因紧密连锁，以鉴定基因转化效果。
(3)5′端的CAATbox、TATAbox保守序列和3′端Nos-Tem中的多聚腺苷酸信号序列分别为高等植物核基因组中的保守序列，在欲转化的DNA序列中加上这两个片断，为外源DNA提供与受体DNA同源序列，基因转化后，通过双位点的基因交换实现基因重组。因为高等植物核基因组中有大量的蛋白编码基因，这些基因其上游均存在CAATbox和TATAbox，下游均存在多聚腺苷酸信号序列所以，这种转化系统的构建策略，能够提高外源基因与受体DNA发生同源交换重组的机率，转化后，可不依赖于选择标记基因进行转化体的筛选，直接在分子水平和表型水平上筛选。
本发明用上述方法实现了植酸酶基因花粉管通道介导无筛选标记转化玉米。在转化玉米的子代中PCR检测出转植酸酶基因阳性玉米植株。具体方案如下：
1.构建无选择标记基因的DNA转化片段DNAphy
从克隆载体pUC19/phyAI中PCR方法扩增出去掉内含子的植酸酶基因phyAII，并亚克隆至植物中间表达载体pBI121中，成为pBI121/phyAII。以pBI121/phyAII为模板，PCR扩增欲转化的DNA片段DNAphy。PCR引物位置：5′端引物(F2)位于CaMV35S的上游，3′端引物(R2)位于Nos-Tem的下游，并且在5′端引物(F2)上加上TATAbox和CAATbox的保守序列。
DNAphy结构如下：
5′-CAATbox-TATAbox-CaMV35S-phyAII-CUS-Nos-Tem-3′
DNAphy为用于基因转化的DNA片段。外源目的基因phyAII的上游是组成型启动子CaMV35S，其下游是报告基因GUS，GUS的下游是终止子Nos-Tem，这样的结构作为外源转化基因表达及检测的分子基础。该DNA片段5′端的CAATbox和TATAbox保守序列、3′端多聚腺苷酸信号序列分别与植物编码蛋白基因高度同源，是外源转化基因与植物受体基因同源交换重组的分子基础。
2.花粉管通道介导转化玉米
种植玉米，待生长至开花期时先后做雌、雄套袋隔离，雄套袋隔离24小时后自花授粉，16小时-20小时做雌柱头切除，并将DNA导入液滴于切口，套袋，20天后，去雌隔离套袋。
3.转化植株的筛选
按上述方法转植酸酶基因的玉米生长成熟后，收获种子，做种子发芽，10天后检测在特定引物PCR扩增条件下琼脂糖凝胶电泳有1.5Kb条带的玉米苗，进一步做GUS和phyAII表达的检测。
花粉管通道法DNAphy转化4个品系的自交系玉米，收获69穗经转化操作的玉米。PCR检测80粒，呈阳性的5粒。
本发明是一种无选择标记的植物转基因方法，转化的DNA片段中没有选择标记基因，通过设置在转化DNA片段两端的植物核DNA的保守序列提高转化率，并通过PCR检测法直接筛选转化植株。这种无选择标记的植物转基因方法，其转化受体植株中没有抗生素类药物和抗除草剂类药物基因，解除了选择标记基因对转基因植物和转基因食品的影响。这种方法适合于可通过花粉管通道介导转化的植物，对所转化的外源基因也没有特别的限制。
以下是本发明的最佳实施例。
实施例1：
构建无选择标记基因的DNA转化片段DNAphy
从克隆载体pUC19/phyAI中PCR方法扩增出去掉内含子的植酸酶基因phyAII，并亚克隆至植物中间表达载体pBI121中，成为pBI121/phyAII。以pBI121/phyAII为模板，PCR扩增DNAphy。
DNAphy基因结构如下：5′-CAATbox-TATAbox-CaMV35S-phyAII-CUS-Nos-Tem-3′引物序列：
F2：5′-GCCTGCAGGGTCAATCTTCACTATATATAGG
TCCCCAGATTAGCCTTTTCAATTTCAG-3′
R2：5′-GTGAATTCCCGATCTAGTAACATAGATGACACC-3′
PCR扩增条件：
Template 1μl
LATaq 0.5μl
dNTP 8μl
buffer 5μl
F2 1μl
R1 1μl
dH2O 33.5μl
实施例3：转DNAphy基因玉米的筛选
按实施例2获得的无选择标记转DNAphy玉米及其两种对照玉米做种子发芽，10天后PCR方法筛选转化玉米苗。PCR引物设置在phyAII植酸酶基因的两侧，PCR反应条件及运行程序同实施例2。对PCR产物做琼脂糖凝胶电泳，结果如下：检测的6株对照I全部为阴性，没有1.5kb特异条带；检测的80株对照II也全部为阴性，没有1.5kb特异条带；检测的80株DNAphy转化玉米苗有5株为阳性，有1.5kb特异条带。
Claims (5)
1.一种无选择标记的植物转基因方法，其特征在于转化的DNA片段中没有选择标记基因。
2.根据权利要求1所述的无选择标记的植物转基因方法，其特征还在于在转化DNA片段两端设置植物核DNA的保守序列。
3.根据权利要求1所述的无选择标记的植物转基因方法，其特征还在于所构建的DNA片段，结构如下：
5′-CAATbox-TATAbox-CaMV35S-phyAII-CUS-Nos-Tem-3′
4.根据权利要求1所述的无选择标记的植物转基因方法所获得的无选择标记的转植酸酶基因玉米。
5.根据权利要求1所述的无选择标记的植物转基因方法所获得的转基因植物。
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| CN00123382A CN1356389A (zh) | 2000-12-08 | 2000-12-08 | 一种无选择标记的植物转基因方法 |
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN1298213C (zh) * | 2003-09-10 | 2007-02-07 | 王海波 | 一种通过分割处理获得无选择标记转基因植物的方法 |
| CN1324141C (zh) * | 2004-02-09 | 2007-07-04 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种培育无选择标记转基因植物的方法及其专用表达载体 |
| US20210171964A1 (en) * | 2006-08-31 | 2021-06-10 | Monsanto Technology Llc | Plant transformation without selection |
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2000
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|---|---|---|---|---|
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| CN1324141C (zh) * | 2004-02-09 | 2007-07-04 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种培育无选择标记转基因植物的方法及其专用表达载体 |
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