CN105274131B - 一种peg介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种PEG介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法，通过胶孢炭疽病菌原生质体的制备、转化和转化子的筛选，将含有筛选标记的外源DNA片段转到胶孢炭疽病菌基因组中；本发明实现了胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化，建立了一套完整的遗传转化方法，获得大量高强度表达绿色荧光蛋白且稳定遗传的转化子，转化效率可达20‑22个转化子/ug DNA，转化效率高、稳定性好。

Description

一种PEG介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是一种PEG介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法。

背景技术

胶孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的梨炭疽病是一种世界性的植物病害，给世界农业生产造成严重的经济损失。近几年来，梨炭疽病多在我国黄河故道梨产区发生，尤其对砀山酥梨危害明显。2008年，砀山地区暴发梨炭疽病，病果率达到70%以上，给农业生产造成严重的经济损失（“梨胶胞炭疽病菌的分离、鉴定及其生物学特性”，刘邮洲等，江苏农业学报，2013，29（1）：60-64）。由于炭疽菌种类繁多，同属不同种炭疽菌在生物学特性、遗传多态性及致病机理等方面存在较大差异，至今鲜有对梨胶孢炭疽病菌的致病机理的报道，这也限制了对胶孢炭疽病菌侵染和致病机制的深入认识。

胶孢炭疽病菌的遗传转化是研究其生长发育与致病过程分子机制的基本工具，目前已有多种遗传转化技术在炭疽菌研究中得到应用，其中包括CaCl₂/PEG介导的原生质体转化法（“杨树炭疽病菌原生质体遗传转化的建立及绿色荧光蛋白的表达”，李思蒙等，林业科学，2013，49（5）：121-127）、根癌农杆菌介导的方法（ATMT）（“The use of T-DNA taggingto isolate mutants of Colletotrichum gloeosporioides and Colletotrichum acutatum with reduced virulence against Hevea brasiliensis”，Lin，ForestPathology，2013，43：289-296）、电穿孔转化（“Genetic transformation with the gfpgene of Colletotrichum gloeosporioides isolates from coffee with blisterspot”，Armesto et al，Brazilian Journal of Microbiology，2012：1222-1229）等。ATMT虽操作简便，但转化时间长，工作量大，适用于突变体库的构建；电穿孔转化法转化效率低，目前极少在真菌转化中应用；CaCl₂/PEG是目前较为传统的转化方法，其操作步骤简便有效，可用于目的基因敲除和替换，已成为获得转化子的最普遍的转化技术。

在CaCl₂/PEG转化过程中，原生质体的数量和转化质粒在胶孢炭疽病菌的转化过程中至关重要，直接影响转化效率，一是因为原生质体的数量与菌龄、菌量、酶解液的组分及酶解时间等因素密切相关；二是转化质粒与所用载体（包括启动子、报告基因和所含的抗性标记等）以及质粒浓度等密切相关。因此，目前尚未见高效、稳定的胶孢炭疽病菌遗传转化体系相关报道。

发明内容

针对上述内容，本发明提供一种高效、稳定的PEG介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法，本发明是这样实现的：

一种PEG介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法，具体步骤如下：

（A）将胶孢炭疽病菌菌丝置于盛有5ml酶解液的10ml离心管中，离心管平躺，30℃，60rpm振荡2h，以双层Miracloth（Calbiochem，USA）过滤收集胶孢炭疽病菌原生质体后置于离心管中，然后置于冷冻离心机中，于4℃，3000rpm离心10min；离心后弃上清，取沉淀（即原生质体）加入1ml的STC缓冲液悬浮原生质体，于4℃，3000rpm离心5min；再次弃上清，取沉淀（即原生质体），加入STC缓冲液悬浮胶孢炭疽病菌原生质体，使其终浓度为10⁸个/ml；

（B）将2µg质粒DNA（5-10µl）加入200µl步骤（A）获得的胶孢炭疽病菌原生质体中，混匀后室温静置25min；然后加入1mlPTC缓冲液，混匀后室温静置25min；然后倒入10ml 含200µg/ml博莱霉素的TB3固体培养基，混匀后倒入培养皿中，26℃，黑暗培养24h；向培养皿中倒入10ml含400µg/ml博莱霉素的TB3固体培养基，26℃下黑暗培养7-10d挑出转化子；

（C）将转化子加入含有400µg/ml博莱霉素的PSA培养基中，26℃黑暗培养，连续培养3代，筛选获得性状稳定的转化子,所述性状稳定是指菌丝和分生孢子发出较强的绿色荧光且生长发育没有发生变化

所述酶解液配制方法为：取0.045g的裂解酶和0.005g的蜗牛酶，再加入0.7M NaCl溶液至5ml，用0.22um细菌过滤器过滤。

（D）转化子的检测：

PCR检测：

根据转入胶孢炭疽病菌eGFP序列设计引物验证转化子，以CTAB法快速提取转化子DNA作为模板进行PCR扩增，再用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的大小。

荧光显微镜观察：

将PCR检测到GFP片段的转化子菌丝和孢子分别制成临时玻片，用Nikon荧光显微镜观察，转化成功的转化子发出强的绿色荧光。

进一步，本发明中，步骤（A）所述胶孢炭疽病菌菌丝是这样获得的：

（1）将胶孢炭疽病菌菌丝块接种到PSA培养基上，26℃黑暗培养10d，过滤收集孢子；

（2）将步骤（1）收集的孢子接种到50ml的CM液体培养基中，26℃，150rpm振荡培养24h；

（3）向步骤（2）的培养基中再添加50ml新的CM液体培养基，26℃，150rpm继续振荡培养24h后，过滤收集菌丝，即获得所述胶孢炭疽病菌菌丝；

进一步，本发明中，步骤（A）中孢炭疽病菌菌丝与酶解液的加入比例为每5ml酶解液中加入0.25g孢炭疽病菌菌丝。

进一步，本发明中，步骤（B）所述质粒为pYF11质粒。

所述CM液体培养基是这样获得的：20×Nitrate salts 20ml，Vitamin solution1ml，Trace elements 1ml，D-Glucose 10g，加ddH₂O定容至1L；

其中，20×Nitrate salts配方为：NaNO₃ 120g，KCl 10.4g，MgSO₄·7H₂O 10.4g，KH₂PO₄ 30.4g，加ddH₂O定容至1L；

Vitamin solution配方为：Biotin 0.01g，Pyridoxin 0.01g，Thiamine 0.01g，Riboflavin 0.01g，PABA 0.01g，Nicotnic acid 0.01g，加ddH₂O定容至1L。

本发明实现了PEG介导的胶孢炭疽病菌原生质体的遗传转化，建立了一套完整的遗传转化方法，获得了高强度表达绿色荧光蛋白且稳定遗传的转化菌株。本发明通过改进转化条件包括菌龄、菌量、酶解时间、质粒加入量及抗性筛选浓度，成功获得了具强荧光表达的转化子，转化效率达到20-22个转化子/ug DNA（以单位质量的DNA计）；另外，本发明转化所用载体具有增强型绿色荧光蛋白基因以及真菌中的强启动子RP27，有效提高了转化菌株的荧光强度。

附图说明

图1为实施例中胶孢炭疽病菌对博莱霉素的抗性检测结果示意图。

图2为实施例中酶解液酶解原生质体2h后显微镜下效果图。

图3 为实施例中GFP转化子图片。

图4为实施例中转化子绿色荧光蛋白基因的PCR扩增电泳图谱；

图中：泳道M：DNA Marker；泳道1-9：不同转化子扩增eGFP基因部分片段；泳道10：野生型对照。

图5为实施例中转化子荧光显微检测结果图。

具体实施方式

为了更详细的理解本发明方法，下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

实施例中涉及的培养基配方：

50%蔗糖溶液：蔗糖50g，补水至100ml，121℃高压蒸汽灭菌20min。

PSA培养基：取马铃薯200g 洗净去皮后切成小块，加水煮烂，用四层纱布过滤，向滤液中加入20g蔗糖，补ddH₂O至1L，加入琼脂粉15 g，121℃高压蒸汽灭菌20min。

酶解液：取0.045g的裂解酶（Lysing enzyme，购自美国sigma-aldrich公司）和0.005g的蜗牛酶（Snailase ，购自索莱宝Solarbio公司）加入0.7M NaCl溶液至5ml，充分溶解后，用0.22um细菌过滤器过滤除菌后获得。

STC缓冲液：蔗糖50g，0.5M Tris-HCl（pH=8.0）25ml，CaCl₂·2H₂O 1.838g，用ddH₂O充分溶解后定容至250ml，121℃高压蒸汽灭菌20min。

PTC缓冲液：取PEG4000 60g溶于STC缓冲液中，定容至100ml，65℃水浴锅加热完全溶解后，用0.22um细菌过滤器过滤除菌。

TB3培养基：取酵母提取物（Yeast extract）3.0g，酸水解酪蛋白3.0g，蔗糖200g，充分溶解后补ddH₂O至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。

CM液体培养基：20×Nitrate salts 20ml，Vitamin solution 1ml，Traceelements 1ml，D-Glucose 10g，加ddH₂O定容至1L；

其中，20×Nitrate salts配方为：NaNO₃ 120g，KCl 10.4g，MgSO₄·7H₂O 10.4g，KH₂PO₄ 30.4g，加ddH₂O定容至1L；

Vitamin solution配方为：Biotin 0.01g，Pyridoxin 0.01g，Thiamine 0.01g，Riboflavin 0.01g，PABA 0.01g，Nicotnic acid 0.01g，加ddH₂O定容至1L。

博莱霉素（Bleomycin），购自Invitrogen公司。

实施例中涉及菌株和载体的来源：

胶孢炭疽菌野生型菌株采自江苏省丰县大沙河砀山酥梨果园的病叶、病果，采用单孢分离的方法,经真菌通用引物 SEQ ID NO.1:

ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）;和SEQ ID NO.2:ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）PCR鉴定后保存，作为本实验用野生型菌株；

pYF11载体（含RP27启动子，博莱霉素抗性）来源于南京农业大学植保学院真菌实验室。

实施例1、胶孢炭疽菌对博莱霉素的敏感性测定

将胶孢炭疽菌野生型菌株接种在PSA培养基培养5d后，沿菌落边缘用直径为5mm的打孔器打取菌丝块，转接到博莱霉素浓度分别为0，100，200，300，350和400μg/ml的PSA培养基上，置于26℃培养箱中生长7d，观察生长情况并测量菌落大小，其生长结果如图1所示。

实施例2、梨胶孢炭疽菌菌丝的收集

（1）将胶孢炭疽病菌菌丝块接种到PSA培养基上，26℃黑暗培养10d，过滤收集孢子；

（2）将收集到的孢子接到50ml的CM液体培养基中，26℃，150rpm振荡培养24h；

（3）向步骤（2）培养基中再添加50ml新的CM液体培养基，26℃，150rpm振荡培养，24h后过滤收集菌丝，即为胶孢炭疽病菌菌丝。

实施例3 梨胶孢炭疽菌原生质体的制备

（1）将实施例2获得的胶孢炭疽病菌菌丝（0.25g）置于盛有5ml酶解液的10ml离心管中酶解，离心管平躺，30℃，60rpm振荡酶解2h；

（2）用双层Miracloth（Calbiochem，USA）过滤收集原生质体于离心管中，冷冻离心机3000r/min，4℃下离心10min；弃上清，取沉淀加1ml STC缓冲液悬浮，3000r/min，4℃离心5min；

（3）收集原生质体，去上清，加入STC缓冲液悬浮原生质体，光学显微镜下镜检原生质体，如图2所示；

（4）用STC缓冲液调节原生质体终浓度达到108个/ml，分装为200µl/管，备用。

实施例4、梨胶孢炭疽菌的遗传转化

（1）将2µg pYF11质粒DNA加于200µl实施例3获得的的梨胶孢炭疽菌原生质体中，轻轻混匀，室温静置25min；

（2）分2-3次加1ml PTC缓冲液，轻轻混匀，室温静置25min；

（3）将梨胶孢炭疽菌原生质体加到10ml含200µg/ml博莱霉素的TB3固体培养基中，轻轻混匀后倒入培养皿中，然后置于26℃，黑暗培养24h；

（4）往培养皿中再倒入10ml含400µg/ml博莱霉素的TB3固体培养基，26℃下黑暗培养7～10d至长出转化子，如图3所示；

（5）挑取转化子到含有400µg/ml博莱霉素的PSA平板上，26℃黑暗培养，再连续培养3代，筛选性状稳定的转化子，即能观察到较强的绿色荧光，且菌丝和分生孢子的生长发育没有发生变化的转化子。

实施例5、梨胶孢炭疽菌转化子的检测

1、PCR检测

（1）转化子基因组DNA的提取

（a）从实施例4获得的转化子菌落上刮取菌丝置于2ml离心管中，加2%CTAB和500µl酚氯仿，少量石英砂，振荡混匀，置于37℃，200rpm摇床摇1.5～2h；

（b）离心管12000 rpm，离心15min；

（c）吸取上清液，加等体积的氯仿，12000rpm，离心10min；

（d）吸取上清液，加两倍体积的无水乙醇，放于-20℃下冷冻30min；

（e）12000rpm，离心10min；

（f）用70%乙醇洗1-2次，晾干，加ddH₂O（含RNase）备用。

（2）转化子的PCR扩增

根据转入的绿色荧光蛋白基因的序列，分别设计两对特异性引物：

SEQ ID NO.3，GFPF：5’-AACGGCCACAAGTTCAGCGTGT-3’

SEQ ID NO.4，GFPR：5’-ATGTGATCGCGCTTCTCGTT-3’

分别以步骤（1）提取的DNA为模板，进行PCR扩增。

PCR反应体系为：模板0.5ul，10×Taq Buffer（含Mg²⁺）2.5ul，上下游引物（20uM）各0.25ul，2.5mM dNTP Mix 2.5ul，Taq DNA polymerase 0.25ul，补ddH₂O至25ul。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s；32个循环数；72℃延伸10min；16℃保温。

PCR扩增后产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，其如图4所示，图中：泳道M：DNAMarker；泳道1-9：不同转化子扩增eGFP基因部分片段；泳道10：野生型对照；

同时以未进行GFP转化的胶孢炭疽菌野生型菌株作为对照，其不能扩增出目的条带，其他转化子均扩增到绿色荧光蛋白基因的部分片段约为600bp，与预期片段大小一致，可以确定转化成功。

2、转化子的荧光显微观察

挑取PCR检测为阳性的转化子的菌丝和孢子制成临时玻片，用Nikon荧光显微镜观察发现转化成功的菌丝和孢子能发出较强的绿色荧光，转化效率达到20-22个转化子/ugDNA（以单位质量的DNA计），如图5所示。转化子经过博莱霉素抗性选择继代培养3代后，仍能观察到较强的绿色荧光，且菌丝和分生孢子的生长发育没有发生变化，表明其具有较高的遗传稳定性。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种PEG介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aacggccaca agttcagcgt gt 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atgtgatcgc gcttctcgtt 20

Claims (1)

1.一种PEG介导梨胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法，其特征在于，步骤如下：

（A）将胶孢炭疽病菌菌丝置于酶解液中，30℃，60rpm振荡2h，以双层Miracloth过滤后取胶孢炭疽病菌原生质体，于4℃，3000rpm离心10min；离心后取沉淀加入STC缓冲液悬浮原生质体，于4℃，3000rpm离心5min；再次取沉淀，加入STC缓冲液悬浮胶孢炭疽病菌原生质体，使其终浓度为10⁸个/ml，胶孢炭疽病菌菌丝与酶解液的加入比例为每5ml酶解液中加入0.25g胶孢炭疽病菌菌丝；

所述胶孢炭疽病菌菌丝是这样获得的：

（1）将胶孢炭疽病菌菌丝块接种到PSA培养基上，26℃黑暗培养10d，过滤收集孢子；

（2）将步骤（1）收集的孢子接种到CM液体培养基中，26℃，150rpm振荡培养24h；

（3）向步骤（2）的培养基中再添加新的CM液体培养基，26℃，150rpm继续振荡培养24h后，过滤收集菌丝，即获得所述胶孢炭疽病菌菌丝；

所述CM液体培养基是这样获得的：20×Nitratesalts 20ml，Vitaminsolution 1ml，Traceelements 1ml，D-Glucose10g，加ddH₂O定容至1L；

其中，20×Nitratesalts配方为：NaNO₃ 120g，KCl 10.4g，MgSO₄·7H₂O 10.4g，KH₂PO₄ 30.4g，加ddH₂O定容至1L；

Vitaminsolution配方为：Biotin 0.01g，Pyridoxin 0.01g，Thiamine 0.01g，Riboflavin 0.01g，PABA 0.01g，Nicotnicacid 0.01g，加ddH₂O定容至1L；

（B）将2μg pYF11质粒DNA加入200μl步骤（A）获得的胶孢炭疽病菌原生质体中，混匀后室温静置25min；然后加入1mlPTC缓冲液，混匀后室温静置25min；然后倒入10ml含200μg/ml博莱霉素的TB3固体培养基，混匀后倒入培养皿中，26℃，黑暗培养24h；向培养皿中倒入10ml含400μg/ml博莱霉素的TB3固体培养基，26℃下黑暗培养7～10d挑出转化子；

（C）将转化子加入含有400μg/ml博莱霉素的PSA培养基中，26℃黑暗培养，连续培养3代，筛选性状稳定的转化子，即为原生质体遗传转化转化后的胶孢炭疽病菌；

所述酶解液是这样获得的：取0.045g的裂解酶和0.005g的蜗牛酶，加入0.7M NaCl溶液至5ml，再用0.22um细菌过滤器过滤。