CN104480138A - 一种PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法，具体步骤如下（a）制备根分泌液；（b）收集休眠孢子液；（c）制备感受态休眠孢子液；（d）芸薹根肿菌遗传转化；（e）博莱霉素抗性筛选，重复接种筛选三代后，即获得稳定遗传转化孢子；本发明实现了PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌的遗传转化，获得了高强度表达绿色荧光蛋白且稳定遗传的转化菌株，转化效率达到1000个转化子/mg DNA（以单位质量的DNA计），此外，本发明转化所用载体具有增强型绿色荧光蛋白基因以及真菌中的强启动子RP27，有效提高了转化菌株的荧光强度。

Description

一种PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法

技术领域

   本发明属于生物技术领域，特别是一种PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法。

背景技术

    由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woronin）侵染引起的根肿病是一种世界性的重要土传病害，据统计，全球每年因根肿病造成的十字花科作物产量损失约占总产量的10%-15%（The occurrence and economic impact of Plasmodiophora brassicae and clubroot disease, Dixon et al, Journal of Plant Growth Regulation, 2009, 28(3):194-202），在我国，十字花科根肿病常年危害面积占总种植面积的1/3以上，严重时田块损失达60%以上，严重影响十字花科作物的产量和品质（十字花科根肿病研究进展，王靖等, 植物保护, 2011, 37(6):153-158）。由于芸薹根肿病是专性寄生菌，目前研究基础相对薄弱，进展十分缓慢，对其致病机理知之甚少。

   以分子生物学手段研究芸薹根肿菌的生长发育及致病机理，可为抗病品种的选育及新型药剂靶标的开发提供新的思路，因为芸薹根肿菌的繁殖方式、生物学特性等与真菌类似，所以通常把它看作是一类低等的真菌（“Ainsworth & Bisby's Dictionary of the Fungi”, Hawksworth et al, International Mycological Institute, 1995），自1973年Mishra和Tatum首次报道真菌Neurospora crassa的遗传转化以来，许多真菌都建立了高效的遗传转化体系，然而与其他病原真菌相比，芸薹根肿菌的遗传转化研究起步较晚，直到2013年，Feng（Genetic transformation of the obligate parasite Plasmodiophora brassicae, Feng et al, Phytopathology, 2013, 103(10):1052-1057）首次将带有绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）的载体转入芸薹根肿菌基因组中，初步建立了芸薹根肿菌的遗传转化方法，然而该方法不仅存在转化时间长，而且转化子中未观察到绿色荧光。

   目前，国内还没有芸薹根肿菌遗传转化方面的报道，遗传转化体系已成为芸薹根肿菌分子生物学研究的瓶颈，因此，对现有的芸薹根肿菌遗传转化方法进行改进和创新，建立一种高效、稳定的遗传转化方法，对于阐明芸薹根肿菌的生长发育及致病机理具有即为重要的意义。

发明内容

针对上述芸薹根肿菌遗传转化难题，提供一种高效、稳定的遗传转化方法，本发明是这样实现的：

   一种PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法，包括休眠孢子悬浮液的收集和芸薹根肿菌的遗传转化，其具体步骤如下：

（a）制备根分泌液：将催芽2-3d的幼苗播种在Hoagland营养液中，24℃/18℃光暗交替培养，7d后将收集到的根分泌液用0.22um细菌过滤器过滤，即获得根分泌液；

（b）收集休眠孢子液：将芸薹根肿病根切碎后搅成匀浆，以8层纱布过滤后，滤液以6000rpm离心10min，取沉淀；向沉淀中加入质量分数为50%的蔗糖溶液，500rpm离心5min，取上清液和上层灰色层；将上清液和上层灰色层以6000rpm离心10min，取沉淀；向沉淀中加入ddH₂O重悬，6000rpm离心10min，取沉淀，重复加入ddH₂O离心三次，向第三次获得的沉淀中加入ddH₂O，再加入硫酸粘杆菌素和盐酸万古霉素至终浓度均为1ug/ml，24℃黑暗培养24h后，再以6000rpm离心10min，取沉淀用ddH₂O洗涤三次后，向沉淀中加入步骤a获得的根分泌液重悬至孢子浓度为5×10⁸个/ml，即获得休眠孢子液；

（c）制备感受态休眠孢子液：将步骤b获得的休眠孢子液于24℃以60rpm震荡培养6h，6000rpm离心5min，取沉淀悬浮于0.1M TE/LiAc溶液，37℃，60rpm震荡培养30min，获得感受态休眠孢子液；

（d）芸薹根肿菌遗传转化：将带有绿色荧光蛋白eGFP的质粒pYF11-GFP-GFP和鲑鱼精DNA加到步骤c获得的感受态休眠孢子液中，冰浴1h后，加入PTC缓冲液，24℃黑暗培养1h，再加终浓度为300ug/ml的博莱霉素，24℃黑暗培养3h，然后2000rpm离心5min；取沉淀，向沉淀中加入STC缓冲液重悬，然后2000rpm离心5min，重复离心两次，取第二次离心获得的沉淀，加入ddH₂O调整孢子浓度至5×10⁸个/ml，即获得遗传转化孢子液；

（e）博莱霉素抗性筛选：将步骤d获得的遗传转化孢子液接种寄主，60d后采用与步骤b相同的方法收集病根休眠孢子液，经300ug/ml的博莱霉素24℃培养24h后，用ddH₂O洗3次，调节孢子浓度5×10⁸个/ml，再次接种寄主，重复接种筛选三代后，所得休眠孢子液中的孢子即为稳定遗传转化孢子。

    本发明中，步骤c中所述质粒pYF11-GFP-GFP和鲑鱼精DNA的加入量均为每200ul感受态休眠孢子液中加入10ug。

    本发明中，步骤b所述0.1M TE/LiAc溶液的配制方法为：10×TE缓冲液10ml，1M LiAc 10ml，加ddH₂O至100ml，调节pH=7.5，再用0.22um细菌过滤器过滤。

    本发明中，步骤c所述STC缓冲液的配制方法为：蔗糖50g，0.5M pH=8.0的Tris-HCl 25ml，CaCl2· 2H₂O 1.838g，用ddH₂O定容至250ml，然后121℃高压蒸汽灭菌20min。

    本发明中，步骤c所述PTC缓冲液的制备方法为：取PEG4000 60g，用STC缓冲液定容至100ml，65℃水浴锅加热溶解后，再用0.22um细菌过滤器过滤。

本发明实现了PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌的遗传转化，建立了一套完整的遗传转化方法，获得了高强度表达绿色荧光蛋白且稳定遗传的转化菌株，本发明通过改进转化条件包括休眠孢子的摇菌时间、载体质粒的加入量及PEG浓度，成功获得了具强荧光表达的转化子，转化效率达到1000个转化子/mg DNA（以单位质量的DNA计），此外，本发明转化所用载体具有增强型绿色荧光蛋白基因以及真菌中的强启动子RP27，有效提高了转化菌株的荧光强度。

附图说明

图1 实施例1病组织扫描电镜图，标尺为10um。

图2 实施例1中休眠孢子形态图。

图3 实施例3中甘蓝根部发病情况图；

图中：A：野生型菌株HSP2接种寄主发病示意图；B：转化菌株接种寄主发病示意图。

图4 实施例3中转化子荧光显微观察；

图中：WT：野生型菌株HSP2；TS：转化菌株。

图中：DIC为微分干涉显微图片；GFP为绿色荧光蛋白表达图片；Merge为DIC和GFP相叠加图片。

图5 实施例4中转化子绿色荧光蛋白基因的PCR扩增电泳图谱；

图中：泳道M：DNA Marker；泳道TS1-TS4：不同转化子扩增eGFP基因部分片段；泳道CK1：野生型对照；泳道CK2：ddH₂O对照。

具体实施方式：

为了更详细的理解本发明方法，下面结合具体实施例作进一步的说明：

实施例中所使用甘蓝根肿病病根分离自湖北长阳火烧坪，所感染根肿菌为甘蓝根肿菌菌株HSP2，与野生型菌株HSP2一同由本实验保存。

甘蓝幼苗来源于江苏省农科院蔬菜所-启夏品种。

鲑鱼精DNA购买于Clontech公司；

带有绿色荧光蛋白eGFP的pYF11-GFP-GFP质粒：pYF11-GFP质粒来源于南京农业大学植保学院真菌实验室，再经本实验室改造为pYF11-GFP-GFP，改造采用酵母同源重组的方法，将含同源臂的GFP片段与选择用含同源臂的pYF11-GFP质粒（经XhoI线性化）共转化酵母XK125，构成载体pYF11-GFP-GFP。

实施例中涉及的试剂与培养基质：

   （1）10×TE缓冲液：1M Tris-HCl 10ml，0.5M EDTA 2ml，pH=7.5，加ddH₂O至100ml，121℃高压蒸汽灭菌20min。

   （2）0.1M TE/LiAc溶液：10×TE缓冲液10ml，1M LiAc 10ml，加ddH₂O至100ml（pH=7.5），用0.22um细菌过滤器过滤除菌。

   （3）50%蔗糖溶液：蔗糖50g，补水至100ml，121℃高压蒸汽灭菌20min。

   （4）硫酸粘杆菌素（1mg/ml）：取硫酸粘杆菌素1mg，用ddH₂O溶解后定容至1ml，用0.22um细菌过滤器过滤除菌后，于-20℃保存备用。

  （5）盐酸万古霉素（1mg/ml）：取盐酸万古霉素1mg，用ddH₂O溶解后定容至1ml，用0.22um细菌过滤器过滤除菌后，于-20℃保存备用。

   （6）STC缓冲液：蔗糖50g，0.5M Tris-HCl（pH=8.0）25ml，CaCl2·2H2O 1.838g，用ddH₂O充分溶解后定容至250ml，121℃高压蒸汽灭菌20min。

   （7）PTC缓冲液：称量PEG4000 60g，溶解于STC缓冲液中，定容至100ml，65℃水浴锅加热完全溶解后，用0.22um细菌过滤器过滤除菌。

 （8）Hoagland营养液：

Ca(NO₃)₂·4H₂O：称量Ca(NO₃)2·4H₂O 236.15g，溶解后加ddH₂O定容至1L；

KNO₃：称量KNO₃ 101.10g，溶解后加ddH₂O定容至1L；

MgSO₄·7H₂O：称量MgSO₄·7H₂O 246.48g，溶解后加ddH₂O定容至1L；

KH₂PO₄：称量KH₂PO₄ 136.09g，溶解后加ddH₂O定容至1L；

微量元素：称量H₃BO₃ 2.86g，MnCl₂·4H₂O 1.81g，ZnSO₄·7H₂O 0.22g，CuSO₄·5H₂O 0.08g，H₂MoO₄·H₂O 0.02g，溶解后加ddH₂O定容至1L；

Fe-EDTA：称量FeSO₄·7H₂O 5.57g，EDTA-Na2 7.45g，溶解后加ddH₂O定容至1L；

使用时加Ca(NO₃)₂·4H₂O 5ml；KNO₃ 5ml；MgSO₄·7H₂O 1ml；KH₂PO₄ 2ml；微量元素1ml；Fe-EDTA 1ml，加ddH₂O定容至1L。

实施例1

1、制备甘蓝根分泌液：在Hoagland营养液种植甘蓝苗，24℃/18℃光暗交替培养，7d后收集根分泌液，根分泌液用0.22um细菌过滤器过滤除菌后，即获得甘蓝根分泌液，4℃备用。

2、甘蓝根肿菌休眠孢子液的收集：

（a）取-20℃保存的甘蓝根肿病病根，并于扫描电镜下观察发病组织，如图1所示；

  将病根切碎后加ddH₂O于榨汁机内搅成匀浆，经8层纱布过滤，滤液6000rpm离心5min，弃上清液，取沉淀用5ml 50%蔗糖溶液悬浮，500rpm离心5min，取上清及上层灰色层；

（b）将步骤a获得的上清液及上层灰色层移入一个新的50ml离心管，6000rpm离心10min，取沉淀；向所述沉淀中加入ddH₂O重悬，6000rpm离心10min，取沉淀，重复离心三次，向第三次获得的沉淀中加入ddH₂O，再加入硫酸粘杆菌素和盐酸万古霉素至终浓度分别为1ug/ml，24℃黑暗培养24h后，再以6000rpm离心10min，收集沉淀用ddH₂O洗涤三次后，向沉淀中加入步骤1获得的根分泌液重悬至孢子浓度为5×10⁸个/ml，即获得根肿菌休眠孢子液，休眠孢子如图2所示。

3、甘蓝根肿菌感受态休眠孢子液的制备：

   将步骤2获得的根肿菌休眠孢子液于24℃以60rpm震荡培养6h，6000rpm离心5min，弃上清，取沉淀置于50ml离心管中，加入0.1M TE/LiAc溶液使沉淀悬浮，37℃，60rpm震荡培养30min，获得感受态休眠孢子液；

4、甘蓝根肿菌遗传转化：

（a）将带有绿色荧光蛋白eGFP的质粒pYF11:GFP:GFP DNA和鲑鱼精DNA加到步骤2获得的感受态休眠孢子液中，加入量为每200ul感受态休眠孢子液中加入10ug质粒pYF11-GFP-GFP和10ug鲑鱼精DNA，将离心管置于冰上1h，同时设置以不加质粒组作为对照；

（b）分别向离心管中加5ml PTC缓冲液（分2-3次加），轻轻混匀，置于24℃，黑暗培养1h后，向离心管中加终浓度为300ug/ml的博莱霉素，然后置于24℃，黑暗培养3h，然后2000rpm离心5min；取沉淀，向沉淀中加入STC缓冲液重悬，然后2000rpm离心5min，重复离心两次，取第二次离心获得的沉淀，加入ddH₂O调整孢子浓度至5×10⁸个/ml，即获得遗传转化孢子液；

5、博莱霉素抗性筛选：

共进行三代筛选：将步骤4获得的遗传转化孢子液迅速用于接种，同时设立野生型菌株（HSP2）对照组，本实施例中所用寄主为甘蓝幼苗，接种方法为：将生长7天的甘蓝幼苗用步骤4获得的遗传转化孢子液蘸根20-30min，然后将幼苗移栽到营养钵中，每钵1棵植株，每株苗定期浇自来水（pH 6.0～6.5），同时设置清水对照；

    60d后调查发病情况，如图3所示，其中，图3A为野生型菌株HSP2接种寄主发病情况，图3B为转化菌株接种寄主发病情况。

   60d后，采用与步骤2相同方法，由发病甘蓝幼苗病根收集休眠孢子液，再加终浓度为300ug/ml的博莱霉素24℃培养24h后，用ddH₂O洗3次，调节孢子浓度5×10⁸个/ml，再次接种寄主甘蓝幼苗，经过三代筛选后，所收集的休眠孢子液中的孢子，即为抗性稳定且强荧光表达的甘蓝根肿菌转化子，如图4所示，图中WT为野生型菌株HSP2；TS为本实施例获得的转化菌株，DIC为微分干涉显微图片，GFP为绿色荧光蛋白表达图片，Merge为DIC和GFP相叠加图片。

实施例2  甘蓝根肿菌转化子PCR检测

1、转化子基因组DNA的提取：

（a）分别收集野生型HSP2及实施例1获得的甘蓝根肿菌转化子的病根于自来水下冲洗干净，室温腐烂5d后，切碎，取适量于2ml离心管中，加入少量石英砂；

（b）向步骤a所述离心管中加500μl的2%CTAB和500μl由酚、氯仿、异戊醇以体积比25：24：1配制的混合溶液，200rpm室温振荡1h，12000rpm离心10min，取上清液，加入其2倍体积的无水乙醇，-20℃下放置2h，12000rpm离心10min；弃上清液，取沉淀；

（c）取步骤b获得的沉淀加入70%乙醇洗涤，12000rpm离心5min，再重复离心一次，取沉淀室温风干，加入30μlddH₂O溶解，即获得转化子基因组DNA提取液，-20℃保存备用。

2、转化子的PCR扩增

   根据转入甘蓝根肿菌菌株HSP2中绿色荧光蛋白基因的序列，分别设计两对特异性引物：

上游引物 GFPF：5’-AACGGCCACAAGTTCAGCGTGT-3’

下游引物 GFPR：5’-ATGTGATCGCGCTTCTCGTT-3’

   分别以步骤1获得的转化子和野生型HSP2基因组DNA提取液为模板，进行PCR扩增，

PCR反应体系为：模板0.5ul，10×Taq Buffer（含Mg²⁺）2.5ul，上下游引物（20uM）各0.25ul，2.5mM dNTP Mix 2.5ul，Taq DNA polymerase 0.25ul，补ddH₂O至25ul。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s；32个循环数；72℃延伸10min；16℃保温。

PCR扩增后产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，如图5所示，图中，泳道M为DNA Marker，泳道TS1-TS4为不同转化子扩增eGFP基因部分片段，泳道CK1为野生型HSP2对照，泳道CK2为ddH₂O对照，野生型HSP2对照组未扩增出目的条带，其他转化子均扩增到绿色荧光蛋白基因的部分片段约为600bp，与预期片段大小一致，确定转化成功。

实施例3 甘蓝根肿菌转化子的荧光显微观察

   将实施例2 PCR检测到GFP片段的病根提取其孢子并制成临时玻片，用Nikon荧光显微镜观察发现转化成功的孢子能发出较强的绿色荧光，转化效率达到1000个转化子/mg DNA（以单位质量的DNA计）。转化子经过博莱霉素抗性选择继代培养3代后，仍能观察到较强的绿色荧光，表明其具有较高的遗传稳定性。

Claims (5)

1.一种PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法，其特征在于，包括休眠孢子悬浮液的收集和芸薹根肿菌的遗传转化，其具体步骤如下：

（a）制备根分泌液：将催芽2-3d的幼苗播种在Hoagland营养液中，24℃/18℃光暗交替培养，7d后将收集到的根分泌液用0.22um细菌过滤器过滤，即获得根分泌液；

（b）收集休眠孢子液：将芸薹根肿病根切碎后搅成匀浆，以8层纱布过滤后，滤液以6000rpm离心10min，取沉淀；向沉淀中加入质量分数为50%的蔗糖溶液，500rpm离心5min，取上清液和上层灰色层；将上清液和上层灰色层以6000rpm离心10min，取沉淀；向沉淀中加入ddH₂O重悬，6000rpm离心10min，取沉淀，重复加入ddH₂O离心三次，向第三次获得的沉淀中加入ddH₂O，再加入硫酸粘杆菌素和盐酸万古霉素至终浓度均为1ug/ml，24℃黑暗培养24h后，再以6000rpm离心10min，取沉淀用ddH₂O洗涤三次后，向沉淀中加入步骤a获得的根分泌液重悬至孢子浓度为5×10⁸个/ml，即获得休眠孢子液；

（c）制备感受态休眠孢子液：将步骤b获得的休眠孢子液于24℃以60rpm震荡培养6h，6000rpm离心5min，取沉淀悬浮于0.1M TE/LiAc溶液，37℃，60rpm震荡培养30min，获得感受态休眠孢子液；

（d）芸薹根肿菌遗传转化：将带有绿色荧光蛋白eGFP的质粒pYF11-GFP-GFP和鲑鱼精DNA加到步骤c获得的感受态休眠孢子液中，冰浴1h后，加入PTC缓冲液，24℃黑暗培养1h，再加终浓度为300ug/ml的博莱霉素，24℃黑暗培养3h，然后2000rpm离心5min；取沉淀，向沉淀中加入STC缓冲液重悬，然后2000rpm离心5min，重复离心两次，取第二次离心获得的沉淀，加入ddH₂O调整孢子浓度至5×10⁸个/ml，即获得遗传转化孢子液；

（e）博莱霉素抗性筛选：将步骤d获得的遗传转化孢子液接种寄主，60d后收集病根休眠孢子液，经300ug/ml的博莱霉素24℃培养24h后，用ddH₂O洗3次，调节孢子浓度5×10⁸个/ml，再次接种寄主，重复接种筛选三代后，所获得的休眠孢子液中的孢子即为稳定遗传转化孢子。

2.根据权利要求1所述PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法，其特征在于，步骤c中所述质粒pYF11-GFP-GFP和鲑鱼精DNA的加入量均为每200ul感受态休眠孢子液中加入10ug。

3.根据权利要求2所述PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法，其特征在于，步骤b所述0.1M TE/LiAc溶液的配制方法为：10×TE缓冲液10ml，1M LiAc 10ml，加ddH₂O至100ml，调节pH=7.5，再用0.22um细菌过滤器过滤。

4.根据权利要求2所述PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法，其特征在于，步骤c所述STC缓冲液的配制方法为：蔗糖50g，0.5M pH=8.0的Tris-HCl 25ml，CaCl2· 2H₂O 1.838g，用ddH₂O定容至250ml，然后121℃高压蒸汽灭菌20min。

5.根据权利要求5所述PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法，其特征在于，步骤c所述PTC缓冲液的制备方法为：取PEG4000 60g，用STC缓冲液定容至100ml，65℃水浴锅加热溶解后，再用0.22um细菌过滤器过滤。