CN108949822A - Hrvvp7转基因红花种子的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HRVVP7转基因红花种子的培育方法，包括如下步骤：S1、将构建的pPhaP3301‑HRVVP7植物表达载体质粒冻融法转化农杆菌感受态细胞EHA105；S2、通过农杆菌侵染法，将HRVVP7目的基因转入红花子叶中，利用组织培养技术，草铵膦筛选获得转基因红花苗；S3、以红花实生苗为砧木，劈接法嫁接转基因红花苗，对成活植株进行PCR验证，阳性植株收获种子后继续扩繁；收获T3代稳定遗传的转基因红花种子。本发明为植物生产轮状病毒疫苗提供新的可行途径。

Description

HRVVP7转基因红花种子的培育方法

技术领域

本发明涉及转基因领域，具体涉及一种HRVVP7转基因红花种子的培育方法。

背景技术

红花是中国传统药物，主要应用其花冠作为药用部位，红花种子并未作为药物引起人们重视。随着基因工程技术的发展，研究者发现红花是白花授粉植物，具有基因污染小的特点，且红花籽中富含蛋白，用其生产药用蛋白，能获得较高的产量。利用转基因红花种子生产药用蛋白的研究，引起了人们的重视。

加拿大SemBioSys Genetic，Inc公司利用红花表达了胰岛素蛋白，且从实验室水平达到了商业化生产标准；国内研究者利用红花表达了水蛙素、降钙素、FGF2等外源蛋白。本研究利用红花子叶再生手段，将HRVVP7基因转入红花中，利用PCR、SDS-PAGE、Westernbloting、ELISA等分子生物学方法对表达结果进行鉴定，最终获得了1株转基因红花植株。前期研究发现组培生根法很难获得阳性红花植株，本试验采用嫁接法获得HRVVP7转基因红花植株，但是植株获得过程难度较大，黄建等利用红花种子表达rhFGF10实验中，在转化3640个红花外植体后获得了11株阳性转基因植物，可见转基因红花获得依旧比较困难。困难原因推测为外源蛋白不易整合到庞大复杂的红花基因组中，红花组培过程极易出现愈伤组织玻璃化、生根困难、嫁接成活率低、生长周期长等情况。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种HRVVP7转基因红花种子的培育方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

HRVVP7转基因红花种子的培育方法，包括如下步骤：

S1、将构建的pPhaP3301-HRVVP7植物表达载体质粒冻融法转化农杆菌感受态细胞EHA105；

S2、通过农杆菌侵染法，将HRVVP7目的基因转入红花子叶中，利用组织培养技术，草铵膦筛选获得转基因红花苗；

S3、以红花实生苗为砧木，劈接法嫁接转基因红花苗，对成活植株进行PCR验证，阳性植株收获种子后继续扩繁；收获T3代稳定遗传的转基因红花种子。

进一步地，所述步骤S2具体包括如下步骤：

(1)种子培养

A.选取籽粒饱满的红花种子置于灭过菌的三角瓶中，加入0.5％升汞浸泡消毒10min，无菌条件下弃掉升汞，无菌水清洗5次，每次5min；

B.消毒后的种子置于种子培养基中，每个培养皿播种20粒红花种子，每次播种20个培养皿；

C.培养皿封口后置于培养箱中25℃暗培养3天，观察红花出芽情况；

(2)侵染及共培养

A.种子萌发生长出两片子叶后，观察有无染菌情况，如果种子有染菌情况，在培养皿对应位置做好标记；

B.在无菌条件开启培养皿，75％酒精棉球迅速覆盖染菌区域；

C.用无菌刀片沿红花子叶生长点处切开，弃掉下胚轴，子叶置于含有pPhaP3301-HRVVP7的OD＝0.6-0.8的农杆菌溶液中，侵染10min，侵染期间摇晃三角瓶使菌液与子叶切口充分接触增加侵染几率；

D.侵染完毕后，无菌镊子夹取子叶置于无菌滤纸上吸去多余菌液，置于共培养基上，子叶切口接触培养基，25℃暗培养3天；

(3)丛生芽分化培养

无菌条件下将暗培养3天的红花子叶转移至抑菌培养基内，每个培养皿置6个子叶，光照16h，黑暗8h，培养4周；

(4)丛生芽伸长及草铵膦筛选

A.待丛生芽长出芽点后，挑选生长健壮的丛生芽，切除子叶外植体并移至伸长培养基内，光照16h，黑暗8h，培养1周；

B.伸长培养1周的丛生芽移至0.1％(w/v)草铵膦伸长培养基中，继续培养1周，观察再生苗生长情况，无发黄现象的丛生苗，经PCR检测后，呈阳性的视为转基因苗。

进一步地，所述步骤S3具体包括如下步骤：

(1)砧木

A.腐殖土和蛭石按3∶1比例混合均匀置于培养钵中，浇水至湿润；

B.红花种子；播种于培养钵内，每钵两粒，置于人工气候室内21℃生长20天；

C.挑选长势健壮具有6-8片真叶的红花植株，在两片真叶上5cm处水平切除顶端，继而纵切3mm，作为嫁接砧木；

(2)接穗

再生抗性小苗主茎生长至3cm时，用刀片削成V字型，切削动作避免反复；

(3)嫁接

A.将接穗插入砧木切口中，封口膜紧密缠绕固定；

B.保鲜膜密封膜罩住嫁接的小苗以保持高的湿度，人工气候室光照16h，黑暗8h，21℃生长1周；

C.当嫁接苗生长出2-3片新叶时，在7天时间内，逐步打开保鲜膜进行炼苗，待嫁接苗完全适应外界环境时去掉保鲜膜；

(4)转基因植株的基因组PCR鉴定，阳性植株收获种子后继续扩繁；收获T3代稳定遗传的转基因红花种子。

上述方案中，通过嫁接法成功的解决了红花组培生根极难的问题，劈接的方法更是增加了嫁接的成活率；通过农杆菌介导、组织培养、嫁接等系列实验手段，成功的把HRVVP7基因转入红花植株中，最终获得了T3代HRVVP7转基因红花种子，并对其进行分子生物学检测，为植物生物反应器生产HRVVP7疫苗奠定基础。

附图说明

图1为PCR检测T0植株；

M：DL2000Marker；WT：阴性对照(野生型红花)；1：阳性对照(pPhaP3301-HRVVP7质粒)；2-10：嫁接成活植株。

图2为BSA标准品标准曲线。

图3为HRVVP7转基因红花种子SDS-PAGE分析。

图4为HRVVP7转基因红花种子Western分析。

图5为ELISA检测HRVVP7在红花种子中表达量。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

培养基配方

种子培养基：MS粉4330mg/L，维生素B10.4mg/L，维生素B30.2mg/L，维生素B60.5mg/L，甘氨酸2mg/L，肌醇100mg/L，蔗糖20000mg/L，琼脂8000mg/L。调节pH至5.8-6.0，121℃，灭菌20min。

共培养基：MS粉4330mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B3 0.4mg/L，维生素B60.4mg/L，甘氨酸2mg/L，肌醇100mg/L，蔗糖30000mg/L，NAA 1.5mg/L，6BA 0.5mg/L，乙酰丁香酮11.62mg/L，琼脂8000mg/L。调节pH至5.8-6.0，121℃，灭菌20min。

芽分化培养基：MS粉4330mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B3 0.4mg/L，维生素B60.4mg/L，甘氨酸2mg/L，肌醇100mg/L，蔗糖30000mg/L，NAA 1.5mg/L，6BA 0.5mg/L，琼脂8000mg/L，头孢霉素100mg/L，羧苄西林200mg/L。调节pH至5.8-6.0，121℃，灭菌20min。

伸长培养基：MS粉4330mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B3 0.4mg/L，维生素B60.4mg/L，甘氨酸2mg/L，肌醇100mg/L，蔗糖30000mg/L，KNO₃ 3800mg/L琼脂8000mg/L，头孢霉素200mg/L，羧苄西林100mg/L。调节pH至5.8-6.0，121℃，灭菌20min。

实验方法

构建pPhaP3301-HRVVP7植物表达载体

(1)HRVVP7核酸序列合成及优化

本研究根据美国专利(US 7,285,28081)获得人RV G1P[8]型的RIX4414株，经89-12亲代株传代减毒而获得的人轮状病毒外壳蛋白VP7核苷酸序列。委托苏州金唯智公司将上述核酸序列按植物密码子偏好性进行优化合成，同时在5′端加Nco I酶切位点和组氨酸标签，在3′端加终止密码子和Hind III酶切位点。合成后得克隆载体命名为PUC19-HRVVP7。

(2)构建植物表达载体

A.质粒提取：将含有pPhaP3301(本实验室保存)和PUC19-HRVVP7菌种培养于LB(含Amp+或Kan+)液体培养基内，置于恒温培养箱中37℃ 220rpm培养12h，取菌液离心收集约3mL菌体提取质粒，操作步骤简述如下：

a.取培养完毕的菌液置于EP管中，离心收集菌体。

b.吸取250μL RB加入离心管中，震荡悬浮细菌沉淀至无明显菌块。

c.取250μL LB加入离心管中，轻柔翻转混合，当颜色透明时表示裂解完全。

d.吸取350μL NB加入离心管中，轻柔翻转混合，直至形成紧实的的凝集块。

e.12000×g离心5min，吸取上清液加入离心柱中，12000×g离心1min。

f.将废液重新移入离心柱中，重复上述操作1次。

g.弃掉废液，吸取600μL WB缓慢加入离心柱中，离心，弃掉废液。

h.将空的离心柱10000×g离心2min，彻底去除WB，自然挥发至无醇味。

i.吸取50μL水浴预热的EB加入离心柱中，离心。

j.琼脂糖凝胶观察质粒提取效果，NanoDrop检测质粒浓度。-20℃冰保存。

B.酶切质粒：取pPhaP3301和PUC19-HRVVP7质粒，分别加入CutSmart10

×Buffer 2μL，Nco I和Hind III各1μL，补去离子水至总体系201μL，37℃恒温过夜反应，酶切载体和目的基因的组分和用量见表1。

表1酶切质粒的组分和用量

C.回收载体片段和目的基因片段：

载体片段和目的基因片段凝胶回收实验参照Easy Pure Quick Gel ExtractionKit说明书操作，简述如下：

a.在紫外光灯箱中，精准切取含有载体骨架基因片段和目的基因片段的胶块，切好的胶块分别放入已知质量的2mL离心管中。

b.取GSB加入到离心管中，加入量为胶块体积的3倍，继而置离心管于50℃水浴上热融10min，当胶块完全融化后降至室温时，转移液体至离心柱中，在离心机中10000×g离心1min，弃掉流出液。重复上述操作1次。

c.吸取600μL Washing Buffer(WB)加入到离心柱中10000×g离心30sec，弃掉流出液。重复上述操作一次。

d.离心柱置于离心机中10000×g离心2min，取出常温挥发至无醇味。

e.离心柱放置一干净离心管中，加入50μL 60℃水浴预热的Elution Buffer(EB)，静止1min后，离心机中10000×g离心1min。重复上述操作1次。

f.将洗脱的回收产物4℃短暂冷藏保存或-20℃低温保存。

D.载体片段和目的基因片段连接转化

具体实验方法简述如下：将HRVVP7基因片段分别与pPhaP3301载体骨架放入EP管中，加入10×T4 buffer和T4 Ligase，加去离子水至总体积10μL。16℃过夜连接后转化Trans1-T1感受态细胞，转化的细胞置于LB(含有Kan+)固体培养基中37℃培养。

a.载体片段和目的基因片段连接体系如下：

表2载体骨架和目的基因的连接组分和体积

E.连接产物转化Trans1-T1感受态细胞

通过热激法将连接产物转化至感受态细胞中(Trans1-T1)，并在LB固体培养基上(含有Amp+，Kan+)筛选培养抗性克隆，同时利用添加的IPTG和X-gal进行蓝白斑筛选，挑选白斑菌落进行PCR鉴定，对PCR验证为阳性的克隆进行液体培养并提取质粒后进行测序。具体步骤如下：

a.从超低温冰箱中取出保存的感受态细胞(Trans1-T1)在冰浴上融化，当感受态细胞处于半融化状态时加入5μL连接产物，轻轻混匀，置于冰浴中30min。

b.冰浴30min结束后，立即取出感受态细胞置于42℃水浴中热激30sec，然后快速将感受态细胞转移至冰浴中2min，此过程切勿摇动离心管。

c.在无菌条件下向感受态细胞的离心管中加入1mL的液体LB培养基(不含抗生素)，37℃恒温摇床200rpm培养1h。

d.取装有复苏细菌的离心管，置于离心机中3000×g常温离心5min。超净工作台内无菌条件下弃去大部分上清液，移液器缓慢吸打重悬沉淀，吸取全部重悬后的细胞，置于固体LB培养基上(含有Amp+，Kan+)，利用无菌涂布器把感受态细胞涂匀，封口膜密封装有LB培养基的平板培养皿，将平板置于恒温37℃培养箱中，倒置平板，过夜培养。

e.通过PCR方法对单克隆菌落进行鉴定，结合1％琼脂糖凝胶进行观察。将上述鉴定为阳性的菌液进行测序。利用DNAMAN 7.0等软件，将测序结果同密码子偏好优化后的HRVVP7核酸序列进行比较分析，测序结果正确的克隆命名为pPhaP3301-HRVVP7。

pPhaP3301-HRVVP7质粒冻融法转化农杆菌

(1)制备农杆菌EHA105感受态

A.取低温保存的农杆菌EHA05接种于YEP(含有Rif)固体培养基上，待长出单菌落后，挑取单菌落置于10mL YEP(含有Rif)液体培养基中，恒温培养箱28℃ 180rpm过夜培养。

B.取活化后的菌液100μL置于50mL YEP(含有Rif)液体培养基内扩大培养。

C.扩大培养的菌液OD600＝0.5时，取菌液4500rpm离心8min，收集菌体。

D.取离心收集的菌体1mL置于EP管中，加预冷的CaCl2 1mL混合均匀，离心。

E.取提前预冷含有20％甘油的CaCl2，按1∶10体积比加入重悬沉淀，取100μL重悬液置于预冷的EP管中，4℃短期保存备用或液氮速冻-80℃长期保存备用。

(2)pPhaP3301-HRVVP7转化EHA105感受态

A.取制备好的EHA105感受态100μL冰浴融化。

B.取pPhaP3301-HRVVP7质粒2μL加至EHA105感受态中，轻柔混合均匀。

C.将装有质粒和感受态细胞的EP管置于液氮中速冻5min，取出EP管置于水浴中37℃加热10min。

D.加入YEP(无抗性)液体培养基500μL，恒温培养箱中28℃ 180rpm培养4h。

E.取出复苏的菌液置离心机中5000rpm离心2min，弃掉上清，加入YEP液体培养基80μL重悬沉淀，重悬液用涂布器均匀涂布在YEP(含有Rif，Kan+)固体培养基上，倒置放入恒温培养箱中28℃培养40h

F.挑取圆润光滑的菌斑置于YEP(含有Rif，Kan+)液体培养基中，恒温震荡培养箱28℃ 180rpm培养13-15h。以此菌液为模版，

F1 5’catgCCATGGGACATCATCATCATCATCAT 3’；

R1 5’catgAAGCTTAAACTCTATAGTAGAAAGCAGC 3’为特性上下游引物扩增目的基因。取PCR鉴定为阳性的EHA105克隆，按体积比3∶7加入甘油和菌液混匀，-80℃保存备用。

红花的遗传转化

(1)种子培养

A.选取籽粒饱满的红花种子置于灭过菌的三角瓶中，加入0.5％升汞浸泡消毒10min，无菌条件下弃掉升汞，无菌水清洗5次，每次5min。

B.消毒后的种子置于种子培养基中，每个培养皿播种20粒红花种子，每次播种20个培养皿。

C.培养皿封口后置于培养箱中25℃暗培养3天，观察红花出芽情况。

(2)侵染及共培养

A.种子萌发生长出两片子叶后，观察有无染菌情况，如果种子有染菌情况，在培养皿对应位置做好标记。

B.在无菌条件开启培养皿，75％酒精棉球迅速覆盖染菌区域。

C.用无菌刀片沿红花子叶生长点处切开，弃掉下胚轴，子叶置于含有pPhaP3301-HRVVP7农杆菌中(OD＝0.6-0.8)，侵染10min，侵染期间摇晃三角瓶使菌液与子叶切口充分接触增加侵染几率。

D.侵染完毕后，无菌镊子夹取子叶置于无菌滤纸上吸去多余菌液，置于共培养基上，子叶切口接触培养基，25℃暗培养3天。

(3)丛生芽分化培养

无菌条件下将暗培养3天的红花子叶转移至抑菌培养基内，每个培养皿置6个子叶，光照16h，黑暗8h，培养4周。

(4)丛生芽伸长及草铵膦筛选

A.待丛生芽长出芽点后，挑选生长健壮的丛生芽，切除子叶外植体并移至伸长培养基内，光照16h，黑暗8h，培养1周。

B.伸长培养1周的丛生芽移至0.1％(w/v)草铵膦伸长培养基中，继续培养1周，观察再生苗生长情况，无发黄现象的丛生苗，经PCR检测后，呈阳性的可初步视为转基因苗。

抗性苗嫁接

(1)砧木

A.腐殖土和蛭石按3∶1比例混合均匀置于培养钵中，浇水至湿润。

B.红花种子(吉红早熟)播种于培养钵内，每钵两粒，置于人工气候室内21℃生长20天。

C.挑选长势健壮具有6-8片真叶的红花植株，在两片真叶上5cm处水平切除顶端，继而纵切3mm，作为嫁接砧木。

(2)接穗

再生抗性小苗主茎生长至3cm时，用刀片削成V字型，切削动作避免反复。

(3)嫁接

A.将接穗插入砧木切口中，封口膜紧密缠绕固定。

B.保鲜膜密封膜罩住嫁接的小苗以保持高的湿度，人工气候室光照16h，黑暗8h，21℃生长1周。

C.当嫁接苗生长出2-3片新叶时，在7天时间内，逐步打开保鲜膜进行炼苗，待嫁接苗完全适应外界环境时去掉保鲜膜。

转基因植株的基因组PCR鉴定

(1)取成活植株和野生植株新鲜叶片，根据植物基因组DNA提取试剂盒操作说明进行实验。

(2)上述提取的DNA为模版，F1、R1为上下游引物，PCR扩增体系见表3。

表3PCR反应体系及其中各组分用量

PCR反应过程为：94℃预变性7min，94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸90sec，共30个循环，72℃延伸7min后降温到4℃，4℃冷藏保存。PCR产物经1％琼脂糖电泳分离检测。

BCA法测定红花种子中总蛋白浓度

(1)种子蛋白的提取

A.取稳定遗传的T3代转基因红花种子，去掉种皮的红花种子置于EP管中。

B.EP管置于液氮中速冻后，研磨充分，加100μL 50mM Tris-HCl(pH 8.0)溶解，经12000×g离心5min后，弃沉，4℃贮存备用。

(2)BCA测定总蛋白浓度

A.工作液A和工作液B按50∶1比例混合均匀。

B.取取5mg/mL蛋白标准品(BSA)倍比稀释，置于96孔板中。

C.各样本分别取20μl加到96孔板，各样本重复三次

D.各孔加入200μL工作液，混匀，恒温培养箱37℃培养30min。

E.酶标仪(562nm)测定吸光度，计算样品中总蛋白的浓度。

3.1.4.6 SDS-PAGE检测红花种子中HRVVP7蛋白的表达

取上述测定已知浓度的红花种子总蛋白，用50mM Tris-HCl(pH 8.0)溶解，加入5×loading buffer，沸水浴中煮沸10min，经10000rpm离心10min后，取上清于10％的浓缩胶上样。具体步骤：

a.取转基因拟南芥种子2mg置于1.5mL EP管中，液氮速冻后研磨充分。

b.加入50mM Tris-HCl(pH 8.0)100μL溶解，冰浴30min，加入5×loading buffer，沸水浴中煮沸10min，经10000rpm离心10min后，取上清于10％的浓缩胶上样。

c.调节电泳仪电压为30V恒压，当样品前沿到达分离胶时，调整电压为120V，恒压至溴酚蓝指示剂进入分离胶底部时结束电泳。

d.取出胶片以考马斯亮蓝R250染色6h，脱色，观察电泳条带。

Western检测红花种子中HRVVP7蛋白的表达

取SDS-PAGE电泳凝胶进行Western检测操作，具体方法：

a.参照1.1.2.4方法进行SDS-PAGE电泳，取SDS-PAGE电泳凝胶置于转膜液中浸泡平衡15min。

b.裁剪6片Whatman 3mm滤纸与转膜用海绵置转膜液中浸泡平衡5min；裁剪PVDF膜1张，尺寸大小应同胶片大小一致，用前甲醇浸泡激活30s。

c.按照阴极至阳极的顺序分别将杂交滤纸、PVDF膜、凝胶、杂交滤纸水平铺于膜转移夹中，排出气泡，置于Bio-Rad标准湿式转膜装置内，接通电极，横流300mA，转膜60min(转膜槽置冰水混合物中降温进行转膜)。

d.完成上述转膜操作后，镊子夹取PVDF膜置于预先配制好的封闭液中(5％脱脂牛奶的TBST)，冰箱4℃封闭过夜。

e.弃掉封闭液，TBST清洗10min，连续清洗3次。

f.一抗(1∶1000)鼠抗轮状病毒VP7单克隆抗体，37℃封闭60min；TBST清洗3次，每次10min。

ELISA检测红花种子中HRVVP7蛋白的表达水平，具体步骤为：

a.总可溶性蛋白加入到96孔板中50ug/孔，4℃包被过夜，弃包被液，采用洗板机以PBST对96孔板进行洗涤，纸巾拍干残余PBST。

b加5％脱脂奶粉200μL/孔，37℃封闭120min。

c.吸干封闭液，PBST洗板3次。

d.每孔加100μL鼠抗轮状病毒VP7单克隆抗体(1∶1000)，37℃孵育60min。

e.弃掉一抗溶液，PBST洗板3次。

f.每孔加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶15000)，37℃孵育90min，洗板。

g.每孔加入底物100μL TMB显色，室温避光孵育15min；每孔加入浓度为2mol/L的H₂SO₄ 50μL终止反应。在酶标仪上490nm吸光值检测各孔0D值。同时用轮状病毒VP7蛋白标准品绘制标准曲线，将样品的OD值带入标准曲线，计算拟南芥种子中目的蛋白的含量。结果

转基因红花苗的获得

通过组织培养获得红花子叶外植体，农杆菌介导HRVVP7转入红花植株中。播种在培养基中的红花种子培养3天后开始萌发，切取红花子叶置于含有HRVVP7的农杆菌菌液中侵染，侵染后的子叶置于共培养基中培养3天，共培养后的子叶置于抑菌培养基中进行芽分化培养，切除丛生芽(长出芽点)的外植体，置于伸长培养基中伸长培养1周后进行草铵膦筛选，转化失败的红花苗变得枯黄，转化成功的红花苗生长健壮，转化成功的红花苗培养1周后劈接法嫁接砧木，炼苗7天，最终在人工气候中培养获得成熟红花种子。

转基因红花叶片PCR检测结果

以红花叶片基因组为模版，PCR法检测HRVVP7基因是否成功转入红花植株，琼脂糖凝胶电泳结果见图1所示，在大约1011bp处，有7个株系嫁接成活植株，出现与目的基因长度一致的片段，阴性对照无此条带。本实验对3000个红花外植体进行了转化，嫁接124株，成活52株，转基因植株7株，转化率0.26％。

BCA测定总蛋白

T0代转基因红花种子继续扩繁，PCR跟踪检测T1代，T2代植株，根据孟德尔分离定律最终收获T3代成熟红花种子，对T3代种子提取总蛋白，绘制标准曲线(见图2)。按BCA法测定转基因红花种子总蛋白约为19.25mg/g，野生型红花种子中总蛋白约为19.05mg/g。

SDS-PAGE检测种子蛋白表达结果

应用SDS-PAGE对转基因红花种子蛋白进行分析。HRVVP7转基因红花T3-1与野生型比较，在38KDa处出现与预期相符合的条带，野生型株系未见明显条带，结果见图3所示。可以初步证明HRVVP7在红花种子中有所表达。

Western bloting检测种子蛋白表达结果

提取T3代转基因红花种子可溶性总蛋白，SDS-PAGE分离总可溶蛋白，将蛋白转移至PVDF膜上，利用抗原抗体特异结合的免疫原理，加一抗、二抗孵育，显色。杂交信号出现时即终止反应。HRVVP7转基因种子得到大小为38KDa的HRVVP7蛋白信号条带，显色结果如图4，野生型红花未见条带，结果表明T3-1、转基因株系表达了HRVVP7蛋白。

ELISA检测种子蛋白表达水平

ELISA检测HRVVP7在红花种子中表达量，HRVVP7蛋白占总可溶蛋白的0.28％，见图5，即每克转基因红花种子中含有目的蛋白53.9ug。野生型种子中未检测出目的蛋白。

本发明由于转基因植株获得困难，本实验对3000个红花外植体进行了转化，嫁接124株，成活52株，转基因植株7株，转化率0.26％。T0代转基因红花种子继续扩繁，PCR跟踪检测T1代，T2代植株，根据孟德尔分离定律最终收获T3代成熟红花种子。利用SDS-PAGE、Western bloting、ELISA等分子生物学方法对表达结果进行定性定量。课题组将继续增加外植体转化数量，获得足量的转基因红花种子，根据孟德尔遗传规律获得更多的T3代稳定遗传株系，并对其免疫效果进行研究。为开发红花为宿主的植物反应器奠定基础，为轮状病毒疫苗的研发提供新的途径，为全面开发利用红花植物资源做出贡献。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.HRVVP7转基因红花种子的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将构建的pPhaP3301-HRVVP7植物表达载体质粒冻融法转化农杆菌感受态细胞EHA105；

S2、通过农杆菌侵染法，将HRVVP7目的基因转入红花子叶中，利用组织培养技术，草铵膦筛选获得转基因红花苗；

S3、以红花实生苗为砧木，劈接法嫁接转基因红花苗，对成活植株进行PCR验证，阳性植株收获种子后继续扩繁；收获T3代稳定遗传的转基因红花种子。

2.如权利要求1所述的HRVVP7转基因红花种子的培育方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括如下步骤：

(1)种子培养

A.选取籽粒饱满的红花种子置于灭过菌的三角瓶中，加入0.5％升汞浸泡消毒10min，无菌条件下弃掉升汞，无菌水清洗5次，每次5min；

B.消毒后的种子置于种子培养基中，每个培养皿播种20粒红花种子，每次播种20个培养皿；

C.培养皿封口后置于培养箱中25℃暗培养3天，观察红花出芽情况；

(2)侵染及共培养

A.种子萌发生长出两片子叶后，观察有无染菌情况，如果种子有染菌情况，在培养皿对应位置做好标记；

B.在无菌条件开启培养皿，75％酒精棉球迅速覆盖染菌区域；

C.用无菌刀片沿红花子叶生长点处切开，弃掉下胚轴，子叶置于含有pPhaP3301-HRVVP7的OD＝0.6-0.8的农杆菌溶液中，侵染10min，侵染期间摇晃三角瓶使菌液与子叶切口充分接触增加侵染几率；

D.侵染完毕后，无菌镊子夹取子叶置于无菌滤纸上吸去多余菌液，置于共培养基上，子叶切口接触培养基，25℃暗培养3天；

(3)丛生芽分化培养

无菌条件下将暗培养3天的红花子叶转移至抑菌培养基内，每个培养皿置6个子叶，光照16h，黑暗8h，培养4周；

(4)丛生芽伸长及草铵膦筛选

A.待丛生芽长出芽点后，挑选生长健壮的丛生芽，切除子叶外植体并移至伸长培养基内，光照16h，黑暗8h，培养1周；

B.伸长培养1周的丛生芽移至0.1％(w/v)草铵膦伸长培养基中，继续培养1周，观察再生苗生长情况，无发黄现象的丛生苗，经PCR检测后，呈阳性的视为转基因苗。

3.如权利要求1所述的HRVVP7转基因红花种子的培育方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括如下步骤：

(1)砧木

A.腐殖土和蛭石按3∶1比例混合均匀置于培养钵中，浇水至湿润；

B.红花种子；播种于培养钵内，每钵两粒，置于人工气候室内21℃生长20天；

C.挑选长势健壮具有6-8片真叶的红花植株，在两片真叶上5cm处水平切除顶端，继而纵切3mm，作为嫁接砧木；

(2)接穗

再生抗性小苗主茎生长至3cm时，用刀片削成V字型，切削动作避免反复；

(3)嫁接

A.将接穗插入砧木切口中，封口膜紧密缠绕固定；

B.保鲜膜密封膜罩住嫁接的小苗以保持高的湿度，人工气候室光照16h，黑暗8h，21℃生长1周；

C.当嫁接苗生长出2-3片新叶时，在7天时间内，逐步打开保鲜膜进行炼苗，待嫁接苗完全适应外界环境时去掉保鲜膜；

(4)转基因植株的基因组PCR鉴定，阳性植株收获种子后继续扩繁；收获T3代稳定遗传的转基因红花种子。