CN105567730A - 一种农杆菌介导的高效玉米骨干自交系遗传转化的方法 - Google Patents

一种农杆菌介导的高效玉米骨干自交系遗传转化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玉米自交系遗传转化的方法。本发明所提供的玉米自交系遗传转化的方法包括下述步骤：将含有目的基因的重组表达载体导入农杆菌，得到重组农杆菌；重组农杆菌对玉米自交系的幼胚进行侵染；取所述玉米自交系的幼胚，置于共培养培养基，进行共培养；取所述玉米自交系的幼胚，依次置于恢复培养基I、筛选培养基I、筛选培养基II、恢复培养基II和分化培养基进行培养，获得幼苗；取所述幼苗置于生根培养基进行培养，获得玉米自交系转化苗。将本发明提供的玉米自交系遗传转化的方法应用在玉米自交系遗传转化中，可获得较高的转化率，对玉米育种及玉米基因功能研究工作具有重要意义。

Description

一种农杆菌介导的高效玉米骨干自交系遗传转化的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的高效玉米骨干自交系遗传转化的方法。
背景技术
玉米(ZeamaysL.)是重要的粮食、饲料作物，也是现代工业的重要原料。随着畜牧业、工业的发展以及世界人口的增长，玉米在农业生产中占有越来越重要的地位，1998年以来，玉米已超过水稻和小麦成为全球第一大作物。建国以来，我国玉米播种面积、单产和总产量都呈持续增长趋势，2002年我国玉米播种面积超过小麦而仅次于水稻，玉米单产由1123.1kg/hm2增加到5394.0公斤/公顷，超过世界玉米平均单产水平，2006年玉米总产量达到1.45亿吨，2015年玉米总产达到2.25亿吨，单产为5891.9公斤/公顷。尽管我国玉米的总产和单产得到了大幅度提升，但与美国等玉米生产大国还存在较大差距。据相关研究推测，到2020年世界玉米需求量将达到7.53亿吨，届时中国玉米需求量为2.5亿吨。因此，在种植面积难以进一步扩大的情况下，玉米总需求量的不断攀升使得玉米生产面临巨大挑战。
1996至今，全球转基因玉米种植面积占全球转基因作物总面积的百分比稳定增长。目前，转基因玉米农艺性状改良主要涉及抗除草剂、抗虫、抗病、抗旱和品质改良等，商业化种植面积较多的是抗除草剂、抗虫和二者复合性状转基因玉米。毫无疑问,转基因技术在玉米生产中将发挥越来越重要的作用。
高效植物转化系统应具备以下几个特点：转化体系稳定；转化效率高；转化方法受基因型限制少，且便于操作；受体组织具有较强的分化和再生能力；。上世纪90年代，玉米的转基因研究迅速发展，转基因方法也出现了多样化。植物转基因方法主要分为两大类：一是DNA直接导入转化，包括基因枪转化法、聚乙二醇(PEG)法、电激穿孔法、超声波介导法、碳化硅纤维介导法、花粉管通道法和显微注射法等；二是载体介导转化，如农杆菌法等。基因枪转化法法、农杆菌介导法在玉米转基因上应用的较为成功，目前生产上所推广应用的转化体以及已经发表的科研论文中所使用的转化方法90％以上是由农杆菌和基因枪转化法。
玉米的遗传转化受体材料类型包括：
(1)原生质体：Lusardi(1994)利用PEG法成功转化玉米原生质体。原生质体作为受体系统的优点是可进行直接转化，转化频率相对较高。缺点是分离和再生植株较为困难，且培养周期长，限制了其应用与发展。
(2)悬浮细胞系：悬浮细胞系由均一小细胞团组成，易大量获得，便于转化体的筛选，常用于基因枪转化利用悬浮培养物为受体材料丰富，植株再生相对容易。但悬浮细胞系的建立耗时长，且长时期的继代培养可能使细胞丧失再生能力或产生变异。
(3)外植体：花药、幼穗、幼胚、芽尖、子房、花粉等都可以作为外植体。幼胚是应用较成功的外植体之一。幼胚易于产生胚性愈伤组织，且植株分化再生也较容易。尽管其转化频率可能低于胚性愈伤组织和胚性悬浮细胞系，但在分化和再生上优势明显，转化体获得容易。但受体系统的转化后代群体较大，需要简便可靠的筛选方法。
(4)胚性愈伤组织：玉米幼胚培养获得的胚性愈伤组织有较强的继代能力和植株再生能力，是目前应用最广泛的受体材料。胚性愈伤组织具有操作简单，可避开原生质体分离再生的困难的优点。但胚性愈伤组织的产生基因型依赖严重，限制了其应用范围。
以我国玉米骨干自交系或优良自交系为代表的基因转化平台研究具有广泛的应用价值。魏开发(2009)为了建立玉米高频再生及高效遗传转化体系，对影响玉米胚性愈伤组织诱导的11个因素及影响胚性愈伤分化的9个因素用正交实验方法进行研究。结果显示，基因型对胚性愈伤诱导有极显著影响。在整合后的玉米遗传转化体系中，玉米自交系黄早4以抗性愈伤率为指标的GUS基因稳定瞬时转化率达到48.6％，而没有获得玉米自交系金黄96B、GY237和海921的转化体。Ishida等(1996)用携带intron-uidA和bar(phosphinothricinacetyltrans-ferase，PPT，乙酰转移酶)或hpt(hygromycinphospho-transferase，潮霉素磷酸转移酶)基因的超双元载体的农杆菌LBA4404侵染玉米自交系A188幼胚，通过对载体菌株组合、菌液浓度、幼胚发育阶段等各种因素优化，获5％～30％转化率(独立转化体/幼胚数)，而其它5种供试自交系(W117，W59E，A554，W153R和H99)未获得转化体。
自交系X178为玉米骨干自交系之一，其为农大108的母本，不但有较好的配合力，而且其对锈病、粗缩病、茎腐病等病害具有较好的抗性。综31是我国重要的骨干自交系，是多个杂交种的亲本，该自交系已经获得国家科技进步二等奖。对于自交系X178和综31来说，目前尚无高效的遗传转化方法被公开。
发明内容
本发明所要解决的问题是如何对生产上能够大面积应用的玉米骨干自交系进行遗传转化。
为解决上述问题，本发明首先提供了一种玉米自交系遗传转化方法。
本发明所提供的玉米自交系遗传转化方法，可包括如下步骤：
(1)将含有目的基因的重组表达载体导入农杆菌，得到重组农杆菌；
(2)取步骤(1)得到的重组农杆菌，对玉米自交系的外植体进行侵染；
(3)完成步骤(2)后，取所述外植体，置于共培养培养基，进行共培养；
(4)完成步骤(3)后，取所述外植体，置于恢复培养基Ⅰ，进行初次恢复培养；
(5)完成步骤(4)后，取所述外植体，依次在筛选培养基Ⅰ和筛选培养基Ⅱ上进行培养，获得抗性愈伤组织；
(6)完成步骤(5)后，取所述抗性愈伤组织，置于恢复培养基Ⅱ，进行二次恢复培养；
(7)完成步骤(6)后，取所述抗性愈伤组织，置于分化培养基进行培养，获得幼苗；
(8)完成步骤(7)后，取所述幼苗置于生根培养基进行培养，获得玉米自交系转化苗。
所述步骤(3)中，每1L所述共培养培养基可包括：MS盐3.90～4.80g(例如3.90～4.33g或4.33～4.80g或3.90g或4.33g或4.80g)、烟酸1.2～1.4mg(例如1.2～1.3mg或1.3～1.4mg或1.2mg或1.3mg或1.4mg)、VB10.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、VB60.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、泛酸钙0.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、盐酸硫胺0.45～0.55mg(例如0.45～0.50mg或0.50～0.55mg或0.45mg或0.50mg或0.55mg)、蔗糖27.0～33.0g(例如27.0～30.0g或30.0～33.0g或27.0g或30.0g或33.0g)、L-脯氨酸1.24～1.52g(例如1.24～1.38g或1.38～1.52g或1.24g或1.38g或1.52g)、2,4-D0.45～0.55mg(例如0.45～0.50mg或0.50～0.55mg或0.45mg或0.50mg或0.55mg)、6-BA0.009～0.011mg(例如0.009～0.010mg或0.010～0.011mg或0.009mg或0.010mg或0.011mg)、植物凝胶3.15～3.85g(例如3.15～3.5g或3.5～3.85g或3.15g或3.5g或3.85g)和90～110μmol(例如90～100μmol或100～110μmol或90μmol或100μmol或110μmol)乙酰丁香酮。所述共培养培养基的溶剂可为水。所述共培养培养基的pH值可为5.4～6.0(例如5.4～5.7或5.7～6.0或5.4或5.7或6.0)。
所述步骤(3)中，每1L所述共培养培养基具体可由如下组分组成：MS盐4.33g、烟酸1.3mg、VB10.25mg、VB60.25mg、泛酸钙0.25mg、盐酸硫胺0.50mg、蔗糖30.0g、L-脯氨酸1.38g、2,4-D0.50mg、6-BA0.01mg、植物凝胶3.5g、乙酰丁香酮100μmol，其余为水。所述共培养培养基的pH值具体可为5.7。
所述步骤(4)中，每1L所述恢复培养基Ⅰ可包括：MS盐3.90～4.80g(例如3.90～4.33g或4.33～4.80g或3.90g或4.33g或4.80g)、烟酸1.2～1.4mg(例如1.2～1.3mg或1.3～1.4mg或1.2mg或1.3mg或1.4mg)、VB10.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、VB60.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、泛酸钙0.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、盐酸硫胺0.45～0.55mg(例如0.45～0.50mg或0.50～0.55mg或0.45mg或0.50mg或0.55mg)、蔗糖27.0～33.0g(例如27.0～30.0g或30.0～33.0g或27.0g或30.0g或33.0g)、L-脯氨酸1.24～1.52g(例如1.24～1.38g或1.38～1.52g或1.24g或1.38g或1.52g)、2,4-D0.45～0.55mg(例如0.45～0.50mg或0.50～0.55mg或0.45mg或0.50mg或0.55mg)、6-BA0.009～0.011mg(例如0.009～0.010mg或0.010～0.011mg或0.009mg或0.010mg或0.011mg)、植物凝胶3.15～3.85g(例如3.15～3.5g或3.5～3.85g或3.15g或3.5g或3.85g)、特美汀90～110mg(例如90～100mg或100～110mg或90mg或100mg或110mg)和AgNO33.1～3.7mg(例如3.1～3.4g或3.4～3.7g或3.1g或3.4g或3.7g)。所述恢复培养基Ⅰ的溶剂可为水。所述恢复培养基Ⅰ的pH值可为5.4～6.0(例如5.4～5.7或5.7～6.0或5.4或5.7或6.0)。
所述步骤(4)中，每1L所述恢复培养基Ⅰ具体可由如下组分组成：MS盐4.33g、烟酸1.3mg、VB10.25mg、VB60.25mg、泛酸钙0.25mg、盐酸硫胺0.50mg、蔗糖30.0g、L-脯氨酸1.38g、2,4-D0.50mg、6-BA0.010mg、植物凝胶3.5g、特美汀100mg和AgNO33.4g，其余为水。所述恢复培养基Ⅰ的pH值具体可为5.7。
所述步骤(5)中，每1L所述筛选培养基Ⅰ可包括：MS盐3.90～4.80g(例如3.90～4.33g或4.33～4.80g或3.90g或4.33g或4.80g)、烟酸1.2～1.4mg(例如1.2～1.3mg或1.3～1.4mg或1.2mg或1.3mg或1.4mg)、VB10.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、VB60.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、泛酸钙0.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、盐酸硫胺0.45～0.55mg(例如0.45～0.50mg或0.50～0.55mg或0.45mg或0.50mg或0.55mg)、蔗糖27.0～33.0g(例如27.0～30.0g或30.0～33.0g或27.0g或30.0g或33.0g)、L-脯氨酸1.24～1.52g(例如1.24～1.38g或1.38～1.52g或1.24g或1.38g或1.52g)、2,4-D0.45～0.55mg(例如0.45～0.50mg或0.50～0.55mg或0.45mg或0.50mg或0.55mg)、6-BA0.009～0.011mg(例如0.009～0.010mg或0.010～0.011mg或0.009mg或0.010mg或0.011mg)、植物凝胶3.15～3.85g(例如3.15～3.5g或3.5～3.85g或3.15g或3.5g或3.85g)、特美汀90～110mg(例如90～100mg或100～110mg或90mg或100mg或110mg)、双丙氨膦1.35～1.65mg(例如1.35～1.5mg或1.5～1.65mg或1.35mg或1.5mg或1.65mg)和AgNO33.1～3.7mg(例如3.1～3.4g或3.4～3.7g或3.1g或3.4g或3.7g)。所述筛选培养基Ⅰ的溶剂可为水。所述筛选培养基Ⅰ的pH值可为5.4～6.0(例如5.4～5.7或5.7～6.0或5.4或5.7或6.0)。
所述步骤(5)中，每1L所述筛选培养基Ⅰ可由如下组分组成：MS盐4.33g、烟酸1.3mg、VB10.25mg、VB60.25mg、泛酸钙0.25mg、盐酸硫胺0.50mg、蔗糖30.0g、L-脯氨酸1.38g、2,4-D0.50mg、6-BA0.010mg、植物凝胶3.5g、特美汀100mg、双丙氨膦1.5mg和AgNO33.4g，其余为水。所述筛选培养基Ⅰ的pH值具体可为5.7。
所述步骤(5)中，每1L所述筛选培养基Ⅱ可包括：MS盐3.90～4.80g(例如3.90～4.33g或4.33～4.80g或3.90g或4.33g或4.80g)、烟酸1.2～1.4mg(例如1.2～1.3mg或1.3～1.4mg或1.2mg或1.3mg或1.4mg)、VB10.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、VB60.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、泛酸钙0.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、盐酸硫胺0.45～0.55mg(例如0.45～0.50mg或0.50～0.55mg或0.45mg或0.50mg或0.55mg)、蔗糖27.0～33.0g(例如27.0～30.0g或30.0～33.0g或27.0g或30.0g或33.0g)、L-脯氨酸1.24～1.52g(例如1.24～1.38g或1.38～1.52g或1.24g或1.38g或1.52g)、2,4-D0.45～0.55mg(例如0.45～0.50mg或0.50～0.55mg或0.45mg或0.50mg或0.55mg)、6-BA0.009～0.011mg(例如0.009～0.010mg或0.010～0.011mg或0.009mg或0.010mg或0.011mg)、植物凝胶3.15～3.85g(例如3.15～3.5g或3.5～3.85g或3.15g或3.5g或3.85g)、特美汀90～110mg(例如90～100mg或100～110mg或90mg或100mg或110mg)、双丙氨膦2.7～3.3mg(例如2.7～3.0mg或3.0～3.3mg或2.7mg或3.0mg或3.3mg)和AgNO33.1～3.7mg(例如3.1～3.4g或3.4～3.7g或3.1g或3.4g或3.7g)。所述筛选培养基Ⅱ的溶剂可为水。所述筛选培养基Ⅱ的pH值可为5.4～6.0(例如5.4～5.7或5.7～6.0或5.4或5.7或6.0)。
所述步骤(5)中，每1L所述筛选培养基Ⅱ可由如下组分组成：MS盐4.33g、烟酸1.3mg、VB10.25mg、VB60.25mg、泛酸钙0.25mg、盐酸硫胺0.50mg、蔗糖30.0g、L-脯氨酸1.38g、2,4-D0.50mg、6-BA0.010mg、植物凝胶3.5g、特美汀100mg、双丙氨膦3.0mg和AgNO33.4g，其余为水。所述筛选培养基Ⅱ的pH值具体可为5.7。
所述步骤(6)中，每1L所述恢复培养基Ⅱ可包括：MS盐3.90～4.80g(例如3.90～4.33g或4.33～4.80g或3.90g或4.33g或4.80g)、烟酸1.2～1.4mg(例如1.2～1.3mg或1.3～1.4mg或1.2mg或1.3mg或1.4mg)、VB10.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、VB60.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、泛酸钙0.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、盐酸硫胺0.45～0.55mg(例如0.45～0.50mg或0.50～0.55mg或0.45mg或0.50mg或0.55mg)、蔗糖27.0～33.0g(例如27.0～30.0g或30.0～33.0g或27.0g或30.0g或33.0g)、L-脯氨酸1.24～1.52g(例如1.24～1.38g或1.38～1.52g或1.24g或1.38g或1.52g)、6-BA3.15～3.85mg(例如3.15～3.5mg或3.5～3.85mg或3.15mg或3.5mg或3.85mg)、毒莠定0.9～1.1mg(例如0.9～1.0mg或1.0～1.1mg或0.9mg或1.0mg或1.1mg)、植物凝胶3.15～3.85g(例如3.15～3.5g或3.5～3.85g或3.15g或3.5g或3.85g)、特美汀90～110mg(例如90～100mg或100～110mg或90mg或100mg或110mg)、双丙氨膦1.35～1.65mg(例如1.35～1.5mg或1.5～1.65mg或1.35mg或1.5mg或1.65mg)。所述恢复培养基Ⅱ的溶剂可为水。所述恢复培养基Ⅱ的pH值可为5.4～6.0(例如5.4～5.7或5.7～6.0或5.4或5.7或6.0)。
所述步骤(6)中，每1L所述恢复培养基Ⅱ可由如下组分组成：MS盐4.33g、烟酸1.3mg、VB10.25mg、VB60.25mg、泛酸钙0.25mg、盐酸硫胺0.50mg、蔗糖30.0g、L-脯氨酸1.38g、6-BA3.5mg、毒莠定1.0mg、植物凝胶3.5g、特美汀100mg、双丙氨膦1.5mg，其余为水。所述恢复培养基Ⅱ的pH值具体可为5.7。
所述步骤(7)中，每1L所述分化培养基可包括a1)或a2)：
a1)MS盐3.90～4.80g(例如3.90～4.33g或4.33～4.80g或3.90g或4.33g或4.80g)、烟酸1.2～1.4mg(例如1.2～1.3mg或1.3～1.4mg或1.2mg或1.3mg或1.4mg)、VB10.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、VB60.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、泛酸钙0.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、盐酸硫胺0.45～0.55mg(例如0.45～0.5mg或0.5～0.55mg或0.45mg或0.5mg或0.55mg)、蔗糖10～15g(例如10.0～13.0g或13.0～15.0g或10.0g或13.0g或15.0g)、葡萄糖15～20g(例如15～18g、18～20g或15g或18g或20g)、L-脯氨酸0.63～0.77g(例如0.63～0.7g或0.7～0.77g或0.63g或0.7g或0.77g)、植物凝胶3.15～3.85g(例如3.15～3.5g或3.5～3.85g或3.15g或3.5g或3.85g)、酪蛋白水解物0.18～0.22g(例如0.18～0.2mg或0.2～0.22mg或0.18mg或0.2mg或0.22mg)、甘氨酸0.036～0.044g(例如0.036～0.04g或0.04～0.044g或0.036g或0.04g或0.044g)、肌醇0.09～0.11g(例如0.09～0.10mg或0.10～0.11mg或0.09mg或0.10mg或0.11mg)和双丙氨膦2.7～3.3mg(例如2.7～3.0mg或3.0～3.3mg或2.7mg或3.0mg或3.3mg)；
a2)蔗糖27.0～33.0g(例如27.0～30.0g或30.0～33.0g或27.0g或30.0g或33.0g)、L-脯氨酸0.63～0.77g(例如0.63～0.7g或0.7～0.77g或0.63g或0.7g或0.77g)、植物凝胶3.15～3.85g(例如3.15～3.5g或3.5～3.85g或3.15g或3.5g或3.85g)、KNO32547～3113mg(例如2547～2830mg或2830～3113mg或2547mg或2830mg或3113mg)、(NH4)2SO4417～509mg(例如417～463mg或463～509mg或417mg或463mg或509mg)、KH2PO4360～440mg(例如360～400mg或400～440mg或360mg或400mg或440mg)、MgSO4·7H2O167～204mg(例如167～185mg或185～204mg或167mg或185mg或204mg)、CaCl2·2H2O149～183mg(例如149～166mg或166～183mg或149mg或166mg或183mg)、MnSO4·H2O6.8～8.4mg(例如6.8～7.6mg或7.6～8.4mg或6.8mg或7.6mg或8.4mg)、ZnSO4·7H2O1.8～2.2mg(例如1.8～2mg或2～2.2mg或1.8mg或2mg或2.2mg)、H3BO32.7～3.3mg(例如2.7～3.0mg或3.0～3.3mg或2.7mg或3.0mg或3.3mg)、KI0.68～0.83mg(例如0.68～0.75mg或0.75～0.83mg或0.68mg或0.75mg或0.83mg)、Na2MoO4·2H2O0.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、CuSO4·5H2O0.023～0.028mg(例如0.023～0.025mg或0.025～0.028mg或0.023mg或0.025mg或0.028mg)、CoCl2·6H2O0.023～0.028mg(例如0.023～0.025mg或0.025～0.028mg或0.023mg或0.025mg或0.028mg)、乙二胺四乙酸钠铁盐32.9～40.1mg(例如32.9～36.6mg或36.6～40.1mg或32.9mg或36.6mg或40.1mg)、氯化胆碱0.088～0.108mg(例如0.088～0.098mg或0.098～0.108mg或0.088mg或0.098mg或0.108mg)、VB20.044～0.054mg(例如0.044～0.049mg或0.049～0.054mg或0.044mg或0.049mg或0.054mg)、D-生物素0.09～0.11mg(例如0.09～0.10mg或0.10～0.11mg或0.09mg或0.10mg或0.11mg)、烟酸0.18～0.22mg(例如0.18～0.2mg或0.2～0.22mg或0.18mg或0.2mg或0.22mg)、叶酸0.0437～0.0534mg(例如0.0437～0.0485mg或0.0485～0.0534mg或0.0437mg或0.0485mg或0.0534mg)、VB10.425～0.519mg(例如0.425～0.472mg或0.472～0.519mg或0.425mg或0.472mg或0.519mg)、D-泛酸钙0.09～0.11mg(例如0.09～0.10mg或0.10～0.11mg或0.09mg或0.10mg或0.11mg)、VB60.18～0.22mg(例如0.18～0.2mg或0.2～0.22mg或0.18mg或0.2mg或0.22mg)、VB120.0014～0.0017mg(例如0.0014～0.0015mg或0.0015～0.0017mg或0.0014mg或0.0015mg或0.0017mg)、对氨基苯甲酸0.044～0.054mg(例如0.044～0.049mg或0.049～0.054mg或0.044mg或0.049mg或0.054mg)、酪蛋白水解物0.18～0.22g(例如0.18～0.2mg或0.2～0.22mg或0.18mg或0.2mg或0.22mg)、甘氨酸0.036～0.044g(例如0.036～0.04g或0.04～0.044g或0.036g或0.04g或0.044g)、肌醇0.09～0.11g(例如0.09～0.10mg或0.10～0.11mg或0.09mg或0.10mg或0.11mg)和双丙氨膦2.7～3.3mg(例如2.7～3.0mg或3.0～3.3mg或2.7mg或3.0mg或3.3mg)。
所述分化培养基的溶剂可为水。所述分化培养基的pH值可为5.5～6.1(例如5.5～5.8或5.8～6.1或5.5或5.8或6.1或5.7)。
所述步骤(7)中，每1L所述分化培养基具体可由如下A1)或A2)中各个组分组成：
A1)MS盐4.33g、烟酸1.3mg、VB10.25mg、VB60.25mg、泛酸钙0.25mg、盐酸硫胺0.5mg、蔗糖10.0g、葡萄糖20g、L-脯氨酸0.7g、植物凝胶3.5g、酪蛋白水解物0.2mg、甘氨酸0.04g、肌醇0.10mg和双丙氨膦3.0mg，其余为水；
A2)蔗糖30.0g、L-脯氨酸0.7g、植物凝胶3.5g、KNO32830mg、(NH4)2SO4463mg、KH2PO4400mg、MgSO4·7H2O185mg、CaCl2·2H2O166mg、MnSO4·H2O7.6mg、ZnSO4·7H2O2mg、H3BO33.0mg、KI0.75mg、Na2MoO4·2H2O0.25mg、CuSO4·5H2O0.025mg、CoCl2·6H2O0.025mg、乙二胺四乙酸钠铁盐36.6mg、氯化胆碱0.098mg、VB20.049mg、D-生物素0.10mg、烟酸0.2mg、叶酸0.0485mg、VB10.472mg、D-泛酸钙0.10mg、VB60.2mg、VB120.0015mg、对氨基苯甲酸0.049mg、酪蛋白水解物0.2mg、甘氨酸0.04g、肌醇0.10mg和双丙氨膦3.0mg，其余为水。
所述分化培养基的pH值具体可为5.7。
所述步骤(8)中，每1L所述生根培养基可包括：MS盐1.949～2.382g(例如1.949～2.165g或2.165～2.382g或1.949g或2.165g或2.382g)、蔗糖27.0～33.0g(例如27.0～30.0g或30.0～33.0g或27.0g或30.0g或33.0g)、植物凝胶3.15～3.85g(例如3.15～3.5g或3.5～3.85g或3.15g或3.5g或3.85g)和双丙氨膦2.7～3.3mg(例如2.7～3.0mg或3.0～3.3mg或2.7mg或3.0mg或3.3mg)。所述生根培养基的溶剂可为水。所述生根培养基的pH值可为5.4～6.0(例如5.4～5.7或5.7～6.0或5.4或5.7或6.0)。
所述步骤(8)中，每1L所述生根培养基具体可由如下组分组成：MS盐2.165g、蔗糖30.0g、植物凝胶3.5g和双丙氨膦3.0mg，其余为水。所述生根培养基的pH值具体可为5.7。
所述步骤(1)中，所述“含有目的基因的重组表达载体”可为质粒pCAMBIA3301或质粒pCAMBIA3300。所述质粒pCAMBIA3300中含有的目的基因可为EPSPS基因。
所述步骤(1)中，所述“含有目的基因的重组表达载体”具体可为质粒pCAMBIA3301。所述质粒pCAMBIA3301中含有的目的基因具体可为bar基因。
所述步骤(1)中，所述农杆菌具体可为根癌农杆菌。所述根癌农杆菌可为根癌农杆菌EHA105、根癌农杆菌EHA101或根癌农杆菌LBA4404。
所述步骤(1)中，所述“重组农杆菌”具体可为将所述质粒pCAMBIA3301转化所述根癌农杆菌EHA105获得的重组农杆菌。
所述步骤(2)中，所述玉米自交系的外植体可为玉米自交系的幼胚。
所述步骤(2)中，所述玉米自交系的幼胚的长度可为1.5mm±0.5mm。
所述步骤(2)中，所述“侵染”的方法可如下：将所述玉米自交系的幼胚置于农杆菌侵染液中10～20min(例如10min或12min或15min或20min)。所述农杆菌侵染液是将所述重组农杆菌悬浮于侵染培养基得到的。
每1L所述侵染培养基可包括：蔗糖61.6～75.2g(例如61.6～68.4g或68.4～75.2g或61.6g或68.4g或75.2g)、(NH4)2SO4417～509mg(例如417～463mg或463～509mg或417mg或463mg或509mg)、KNO32547～3113mg(例如2547～2830mg或2830～3113mg或2547mg或2830mg或3113mg)、KH2PO4360～440mg(例如360～400mg或400～440mg或360mg或400mg或440mg)、MgSO4·7H2O167～204mg(例如167～185mg或185～204mg或167mg或185mg或204mg)、CaCl2·2H2O149～183mg(例如149～166mg或166～183mg或149mg或166mg或183mg)、MnSO4·H2O6.8～8.4mg(例如6.8～7.6mg或7.6～8.4mg或6.8mg或7.6mg或8.4mg)、ZnSO4·7H2O1.8～2.2mg(例如1.8～2mg或2～2.2mg或1.8mg或2mg或2.2mg)、H3BO32.7～3.3mg(例如2.7～3.0mg或3.0～3.3mg或2.7mg或3.0mg或3.3mg)、KI0.68～0.83mg(例如0.68～0.75mg或0.75～0.83mg或0.68mg或0.75mg或0.83mg)、Na2MoO4·2H2O0.23～0.28mg(例如0.23～0.25mg或0.25～0.28mg或0.23mg或0.25mg或0.28mg)、CuSO4·5H2O0.023～0.028mg(例如0.023～0.025mg或0.025～0.028mg或0.023mg或0.025mg或0.028mg)、CoCl2·6H2O0.023～0.028mg(例如0.023～0.025mg或0.025～0.028mg或0.023mg或0.025mg或0.028mg)、乙二胺四乙酸钠铁盐32.9～40.1mg(例如32.9～36.6mg或36.6～40.1mg或32.9mg或36.6mg或40.1mg)、氯化胆碱0.088～0.108mg(例如0.088～0.098mg或0.098～0.108mg或0.088mg或0.098mg或0.108mg)、VB20.044～0.054mg(例如0.044～0.049mg或0.049～0.054mg或0.044mg或0.049mg或0.054mg)、D-生物素0.09～0.11mg(例如0.09～0.10mg或0.10～0.11mg或0.09mg或0.10mg或0.11mg)、烟酸0.18～0.22mg(例如0.18～0.2mg或0.2～0.22mg或0.18mg或0.2mg或0.22mg)、叶酸0.0437～0.0534mg(例如0.0437～0.0485mg或0.0485～0.0534mg或0.0437mg或0.0485mg或0.0534mg)、VB10.425～0.519mg(例如0.425～0.472mg或0.472～0.519mg或0.425mg或0.472mg或0.519mg)、D-泛酸钙0.09～0.11mg(例如0.09～0.10mg或0.10～0.11mg或0.09mg或0.10mg或0.11mg)、VB60.18～0.22mg(例如0.18～0.2mg或0.2～0.22mg或0.18mg或0.2mg或0.22mg)、VB120.0014～0.0017mg(例如0.0014～0.0015mg或0.0015～0.0017mg或0.0014mg或0.0015mg或0.0017mg)、对氨基苯甲酸0.044～0.054mg(例如0.044～0.049mg或0.049～0.054mg或0.044mg或0.049mg或0.054mg)和90～110μmol(例如90～100μmol或100～110μmol或90μmol或100μmol或110μmol)乙酰丁香酮。所述侵染培养基的溶剂可为水。所述侵染培养基的pH值可为4.9～5.5(例如4.9～5.2或5.2～5.5或4.9或5.2或5.5)。
每1L所述侵染培养基可由如下组分组成：蔗糖68.4g、(NH4)2SO4463mg、KNO32830mg、KH2PO4400mg、MgSO4·7H2O185mg、CaCl2·2H2O166mg、MnSO4·H2O7.6mg、ZnSO4·7H2O2mg、H3BO33.0mg、KI0.75mg、Na2MoO4·2H2O0.25mg、CuSO4·5H2O0.025mg、CoCl2·6H2O0.025mg、乙二胺四乙酸钠铁盐36.6mg、氯化胆碱0.098mg、VB20.049mg、D-生物素0.10mg、烟酸0.2mg、叶酸0.0485mg、VB10.472mg、D-泛酸钙0.10mg、VB60.2mg、VB120.0015mg、对氨基苯甲酸0.049mg和100μmol乙酰丁香酮，其余为水。所述侵染培养基的pH值具体可为5.2。
所述农杆菌侵染液的OD550nm值为0.3～0.4(例如0.3～0.35或0.35～0.4或0.3或0.35或0.4)。
所述步骤(3)中，所述共培养的条件可为18～22℃(例如18～20℃或20～22℃或18℃或20℃或22℃)、暗培养24～48h(例如24～36h或36～48h或24h或36h或48h)。
所述步骤(3)中，所述共培养的条件具体可为20℃、暗培养36h。
所述步骤(4)中，所述初次恢复培养的条件可为28℃～31℃(例如28～29℃或29～31℃或28℃或29℃或31℃)，暗培养7～14天(例如7～10天或10～14天或7天或10天或14天)。
所述步骤(4)中，所述初次恢复培养的条件具体可为29℃、暗培养10天。
所述步骤(5)中，所述培养的条件可为28～31℃(例如28～29℃或29～31℃或28℃或29℃或31℃)、暗培养10～18天(例如10～14天或14～18天或10天或14天或18天)。
所述步骤(5)中，所述培养的条件具体可为29℃、暗培养14天。
所述步骤(6)中，所述二次恢复培养的条件可为28～31℃(例如28～29℃或29～31℃或28℃或29℃或31℃)、暗培养7～14天(例如7～10天或10～14天或7天或10天或14天)。
所述步骤(6)中，所述二次恢复培养的条件具体可为29℃、暗培养10天。
所述步骤(7)中，所述培养的条件可为25～29℃(例如25～27℃或27～29℃或25℃或27℃或29℃)、光照培养7～14天(例如7～10天或10～14天或7天或10天或14天)。
所述步骤(7)中，所述培养的条件具体可为27℃、光照培养10天。
所述步骤(8)中，所述培养的条件可为25～29℃(例如25～27℃或27～29℃或25℃或27℃或29℃)。
所述步骤(8)中，所述培养的条件具体可为27℃。
所述光照培养具体可为光暗交替培养。
所述光暗交替培养的周期具体可为18小时光照培养/6小时黑暗培养。
所述光暗交替培养时的光照强度可为80～100μE/m2/s(例如80～90μE/m2/s或90～100μE/m2/s或80μE/m2/s或90μE/m2/s或100μE/m2/s)。
上述方法中，所述玉米自交系具体可为X178或综31。
所述MS盐可为Sigma公司产品，产品目录号为M5524。
为解决上述问题，本发明还提供了一种用于玉米自交系遗传转化的试剂盒。
本发明所提供的用于玉米自交系遗传转化的试剂盒含有所述共培养培养基和/或所述恢复培养基Ⅰ和/或所述筛选培养基Ⅰ和/或所述筛选培养基Ⅱ和/或所述恢复培养基Ⅱ和/或所述分化培养基和/或所述生根培养基。
上述试剂盒，所述玉米自交系具体可为X178或综31。
利用本发明提供的一种玉米自交系遗传转化方法进行两组试验，每组试验中设置三个重复处理，每个重复处理中对100个玉米幼胚进行遗传转化，结果表明，转化效率在0.1-5％之间。可见，将本发明提供的玉米自交系遗传转化的方法应用在玉米自交系遗传转化中，可获得较高的转化率，对玉米育种工作具有重要意义。
附图说明
图1为质粒pCAMBIA3301载体示意图。
图2为转bar基因植株的生长状态。
图3为转bar基因植株PCR检测结果。
图4为bar蛋白快速检测。
图5为拟转bar基因植株蛋白快速检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
自交系X178记载于如下文献中：许启凤.优质、高产玉米新品种农大108的选育与推广.中国农业大学学报，2003,8(1)：25-26.，公众可以从中国农业大学国家玉米改良中心获得。自交系X178在下文中简称X178。
综31记载于如下文献中：优良玉米自交系综3和综31的选育与利用，戴景瑞，谢友菊等，国家科技进步二等奖，2004.，公众可以从中国农业大学国家玉米改良中心获得。
质粒pCAMBIA3301购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心，网址为：http://www.biovector.net/。质粒pCAMBIA3301上携带有bar基因，如图1所示。
YEP固体平板：在YEP液体培养基中加入琼脂粉并使其浓度为1.5g/100mL，趁热倒入培养皿中，得到YEP固体平板；其中YEP液体培养基的配方为：将牛肉浸膏5g、酵母膏1g、蛋白胨5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O0.04g溶于1L去离子水，用10MNaOH水溶液调节pH至7.2，高温高压灭菌20min。
MS盐为Sigma公司产品，产品目录号为M5524。
下述实施例中所用的培养基如下：
AB基本培养基：将K2HPO43g、NaH2PO41g、NH4Cl1g、MgSO4·7H2O0.3g、KCl0.15g、CaCl20.01g、FeSO4·7H2O2.5mg、glucose5g和Gelrite3g溶于1L去离子水，pH自然。
侵染培养基：将蔗糖68.4g，N6大量(20×)50mL，B5微量(100×)10mL，N6铁盐(100×)10mL，RTV有机(200×)5mL和100μmol的乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)溶于1L蒸馏水，调节pH至5.2。
共培养培养基：将MS盐4.33g，MSVitamins(500×)2mL，盐酸硫胺0.5mg，蔗糖30.0g，L-脯氨酸1.38g，2,4-D0.5mg，6-BA0.01mg，植物凝胶3.5g和100μmol的AS溶于1L蒸馏水，调节pH至5.7。
恢复培养基I：将MS盐4.33g，MSVitamins(500×)2mL，盐酸硫胺0.5mg，蔗糖30.0g，L-脯氨酸1.38g，2,4-D0.5mg，6-BA0.01mg，植物凝胶3.5g，特美汀(Timentin，Tim)100mg和AgNO33.4mg溶于1L蒸馏水，调节pH至5.7。
筛选培养基I：将MS盐4.33g，MSVitamins(500×)2mL，盐酸硫胺0.5mg，蔗糖30.0g，L-脯氨酸1.38g，2,4-D0.5mg，6-BA0.01mg，植物凝胶3.5g，Tim100mg，双丙氨膦1.5mg和AgNO33.4mg溶于1L蒸馏水，调节pH至5.7。
筛选培养基II：将MS盐4.33g，MSVitamins(500×)2mL，盐酸硫胺0.5mg，蔗糖30.0g，L-脯氨酸1.38g，2,4-D0.5mg，6-BA0.01mg，植物凝胶3.5g，Tim100mg，双丙氨膦3.0mg和AgNO33.4mg溶于1L蒸馏水，调节pH至5.7。
恢复培养基II：将MS盐4.33g，MSVitamins(500×)2mL，盐酸硫胺0.5mg，蔗糖30.0g，L-脯氨酸1.38g，6-BA3.5mg，毒莠定1mg，植物凝胶3.5g，Tim100mg和双丙氨膦1.5mg溶于1L蒸馏水，调节pH至5.7。
分化培养基：将MS盐4.33g，MSVitamins(500×)2mL，盐酸硫胺0.5mg，蔗糖10.0g，葡萄糖20g，L-脯氨酸0.7g，植物凝胶3.5g，酪蛋白水解物0.2g，甘氨酸0.04g，肌醇0.1g和双丙氨膦3.0mg溶于1L蒸馏水，调节pH至5.7。
生根培养基：将MS盐2.165g，蔗糖30.0g，植物凝胶3.5g和双丙氨膦3.0mg溶于1L蒸馏水，调节pH至5.7。
N6大量(20×)：将(NH4)2SO49.26g，KNO356.6g，KH2PO48g，MgSO4·7H2O3.7g和CaCl2·2H2O3.32g溶于1L蒸馏水。
B5微量(100×)：将MnSO4·H2O0.76g、ZnSO4·7H2O0.2g、H3BO30.3g、KI0.075g、Na2MoO4·2H2O0.025g、CuSO4·5H2O0.0025g和CoCl2·6H2O0.0025g溶于1L蒸馏水。
RTV有机(200×)：将氯化胆碱0.0196g、VB20.0098g、D-生物素0.02g、烟酸0.04g、叶酸0.0097g、VB10.0944g、D-泛酸钙0.02g、VB60.04g、VB120.0003g和对氨基苯甲酸0.0098g溶于1L蒸馏水。
N6铁盐(100×)：将乙二胺四乙酸钠铁盐3.66g溶于1L蒸馏水。
MSVitamins(500×)：将烟酸0.65g、VB10.125g、VB60.125g和泛酸钙0.125g溶于1L蒸馏水。
实施例1、X178田间种植及幼胚获得
一、X178的田间种植
种子：X178
播种时间(两次)：2014年5月10日和2015年5月10日。
试验地点：中国农业大学上庄实验站。
播种面积(每次)：0.5亩；其中行长5米，行距0.6米，株距0.3米。
播种前施加200斤复合肥/亩，有机质4000斤/亩；播种后不再进行追肥。根据田间的水分状况进行灌溉，2014年的整个生长期间共计浇水4次，2015年的整个生长期间共计浇水2次。
每穴播种2粒，生长到5片叶开始间苗，每穴留一株幼苗。
种植期间采取正常的杂草和虫害管理。
二、人工授粉
采取人工授粉，以确保授粉后的幼胚大小保持均匀一致。播种2个月以后，开始进行人工授粉。具体步骤如下：
(1)每天上午9点钟前检查植株的雌穗，对已经长出的雌穗在吐丝前套上雌穗袋子(20cm×10cm)。
(2)完成步骤(1)2～3天后的下午，对已经吐丝或约80％花丝吐出的雌穗的花丝用剪刀剪掉突出苞叶部分；对已经开始散粉的雄穗套上雄穗袋子(40cm×20cm)。
(3)完成步骤(2)的第二天上午10点钟左右，用力抖雄穗袋子以收集足量的新鲜花粉，然后打开雌穗袋子，将收集的新鲜花粉倒在新鲜花丝上，迅速用雌穗袋子继续套住授粉后的幼穗，最后用大头针把雌穗袋子别在雌穗上，避免雌穗袋脱落。每次授粉15穗左右。
三、采摘幼穗
授粉后第9天，开始密切关注幼胚的生长情况。每天上午对授粉的幼穗进行观察，拨开苞叶，用手术刀从幼穗的中部把幼胚剥离出来，用尺子衡量幼胚的大小，幼胚的平均长度为1.5mm±0.5mm时采摘幼穗，4℃保存。
四、剥离幼胚
(1)取幼穗，切除顶端1厘米，在上部顶端轴心插入镊子尖端，然后在超净台上把穿有镊子的幼穗放入无菌的广口瓶内，然后向所述广口瓶中加入杀菌溶液(由700mL5.25％(质量百分比)次氯酸钠水溶液和1～3滴吐温20组成)淹没幼穗，杀菌15-20分钟。杀菌期间偶尔轻动幼穗，驱除空气泡沫，使幼穗表面彻底除菌。
(2)完成步骤(1)后，握住镊子末端，使消毒溶液流出，再用大量无菌水清洗幼穗三次。
(3)完成步骤(2)后，将幼穗晾干，放在培养皿中，在无菌条件下用解剖刀切除幼穗籽粒顶部的2/3，每次切除4行。
(4)完成步骤(3)后，利用解剖刀插入胚乳和果皮间，由上而下剥离籽粒幼胚。
实施例2、X178遗传转化方法的建立
一、农杆菌侵染液的制备
(1)将质粒pCAMBIA3301(载体示意图见图1)转化根癌农杆菌EHA105，挑取重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为EHA105/pCAMBIA3301。
(2)将步骤(1)获得的EHA105/pCAMBIA3301接种到含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的AB基本培养基上，28℃培养3天。
(3)完成步骤(2)后，用接种针挑取单菌落，接种在含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的YEP固体平板，20℃培养3天。
(4)完成步骤(3)后，用细菌接种环(约5毫米)刮取菌落，接种到5～10mL侵染培养基，23℃、100～120rpm振荡培养4小时，得到农杆菌侵染液。以侵染培养基的OD550nm为参照，调整农杆菌侵染液的OD550nm值在0.3～0.4之间。
二、农杆菌侵染玉米幼胚
以实施例1制备的玉米自交系X178的幼胚作为外植体。
取外植体，放入盛有侵染培养基的离心管中，颠倒数次，然后用侵染培养基洗涤3～4次。倒掉侵染培养基，向离心管中加入1～1.5mL步骤一制备的农杆菌侵染液(OD550nm值为0.35)，轻轻颠倒离心管20次，然后室温静置20min(静置过程中幼胚不要摇动或涡旋)。
侵染后的幼胚先在无菌滤纸上吸去多余菌液，再置于共培养培养基上(幼胚的胚轴面与共培养培养基表面接触)共培养36h(实际应用中24h～48h均可)。
共培养条件：20℃(实际应用中18℃～22℃均可)，暗培养。
三、初次恢复培养
完成步骤二后，取幼胚，全部转移至恢复培养基Ⅰ上，29℃(实际应用中28℃～31℃均可)，暗培养10天(实际应用中7～14天均可)。进行该步骤时，对于恢复较快的愈伤组织，需及时进行下一步筛选培养；对于恢复较慢的愈伤组织，可以增加恢复的时间，但最长为14天。
四、筛选培养
完成步骤三后，取幼胚，全部转移至筛选培养基Ⅰ上，进行第一次筛选，29℃(实际应用中28℃～31℃均可)，暗培养14天(实际应用中10天～18天均可)。
完成第一次筛选后，取幼胚，全部转移至筛选培养基Ⅱ上，进行第二次筛选，29℃(实际应用中28℃～31℃均可)，暗培养14天(实际应用中10天～18天均可)，即可筛选出抗性愈伤组织。
五、二次恢复培养
完成步骤四后，取抗性愈伤组织，全部转移至恢复培养基Ⅱ上，29℃(实际应用中28℃～31℃均可)，暗培养10天(实际应用中7～14天均可)。
六、分化培养
完成步骤五后，取愈伤组织，全部转移至分化培养基中，光照交替培养培养10天(实际应用中7天～14天均可)，获得幼苗(实验结果见图2)。
光暗交替培养(即光培养和暗培养交替)条件为：27℃(实际应用中25℃～29℃均可)；18小时光照培养/6小时黑暗培养；光照培养时的光照强度为90μE/m2/s(实际应用中80～100μE/m2/s均可)。
七、生根培养
取步骤六获得的幼苗，全部转移至生根培养基，光照交替培养，获得拟转bar基因植株。
光暗交替培养(即光培养和暗培养交替)条件为：27℃(实际应用中25℃～29℃均可)；18小时光照培养/6小时黑暗培养；光照培养时的光照强度为90μE/m2/s(实际应用中80～100μE/m2/s均可)。
随机选择20株拟转bar基因植株，依次命名为L1-L20。
八、转bar基因植株的检测
1、分子检测
(1)分别提取步骤七获得的20株拟转bar基因植株叶片和X178的叶片的基因组DNA，并分别作为模板，以Bar1955F：5'-GCAAAGTCTGCCGCCTTACAAC-3'和Bar1955R：5'-TGTTATCCGCTCACAATTCCACAC-3'为引物进行PCR扩增(其中X178作为阴性对照)；用等体积超纯水代替拟转bar基因植株的叶片的基因组DNA，作为空白对照；用等体积质粒pCAMBIA3301的DNA代替拟转bar基因植株的叶片的基因组DNA，作为阳性对照。
PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，32个循环；72℃延伸10min，4℃保持。
PCR反应完成后，取10μLPCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。实验结果见图3(M为DNAMarker，泳道1-20依次为以L1植株-L20植株的叶片的基因组DNA为模板的实验结果，泳道21为阴性对照，泳道22为空白对照，泳道23为阳性对照)。结果表明，如果以拟转bar基因植株的叶片的基因组DNA为模板，能够扩增出约1955bp的条带，则该拟转bar基因植株即为转bar基因阳性植株；空白对照和阴性对照均不能获得1955bp的条带；阳性对照可以获得1955bp的条带。
2、bar蛋白快速检测
(1)取步骤七获得的L1植株的叶片0.1g，放入2mL离心管中，研磨。
(2)完成步骤(1)后，加入Pat/bar检测试纸条(美国Envirologix公司产品)附赠的SEB2缓冲液1mL，混匀。
(3)完成步骤(2)后，将Pat/bar检测试纸条垂直插入2mL离心管中，样品端淹没入样品液的深度约为0.5cm，1min后取出放平阅读检测结果。检测标准为：在Pat/bar检测试纸条上出现两条紫红色条带，一条为紫红色检测线，一条为紫红色质控线，即为阳性结果(图4中A)；在Pat/bar检测试纸条上仅出现一条紫红色质控线即阴性结果(图4中B)。
按照上述方法，将L1植株依次替换为L2植株-L20植株，分别获得L2-L20植株的bar蛋白检测结果。
按照上述方法，将L1植株替换为X178、作为阴性对照，将L1植株替换为等质量超纯水、作为空白对照，将L1植株替换为等质量的步骤1鉴定为转bar基因阳性植株的叶片、作为阳性对照。
实验结果见图5(泳道1-20依次为L1植株-L20植株，泳道21为阴性对照，泳道22为空白对照，泳道23为阳性对照))，结果表明，L1植株、L2植株、L4植株、L8植株、L9植株、L12植株、L14植株、L16植株、L17植株和L20植株均能得到两条紫红色条带，即为阳性转bar基因植株。阳性对照能得到两条紫红色条带，阴性对照和空白对照均得到一条紫红色条带。
用Pat/bar检测试纸条和步骤1的分子检测方法分别对步骤八获得的20株拟转pCAMBIA3301植株检测，检测的阳性植株结果完全一致。
九、转化效率
遗传转化进行两组试验(第一组对2014玉米的幼胚进行遗传转化，第二组对2015玉米的幼胚进行遗传转化)，每组试验中设置三个重复处理，每个重复处理中对100个玉米幼胚进行遗传转化。
按照步骤一至八的方法对2014年和2015年两年的X178的遗传转化实验结果进行统计：转化效率在0.1-5％之间。转化效率(％)＝PCR阳性植株株数/侵染的幼胚总数×100％。
按照实施例1和实施例2的方法，将X178替换为综31，其它步骤均不变，2014年和2015年两年的综31的遗传转化实验结果表明：转化效率在0.1-5％之间。
可见，将本发明提供的玉米自交系遗传转化的方法应用在X178和综31的遗传转化中，可获得较高的转化率。

Claims (10)

1.一种玉米自交系遗传转化方法，包括如下步骤：
(1)将含有目的基因的重组表达载体导入农杆菌，得到重组农杆菌；
(2)取步骤(1)得到的重组农杆菌，对玉米自交系的外植体进行侵染；
(3)完成步骤(2)后，取所述外植体，置于共培养培养基，进行共培养；
(4)完成步骤(3)后，取所述外植体，置于恢复培养基Ⅰ，进行初次恢复培养；
(5)完成步骤(4)后，取所述外植体，依次在筛选培养基Ⅰ和筛选培养基Ⅱ上进行培养，获得抗性愈伤组织；
(6)完成步骤(5)后，取所述抗性愈伤组织，置于恢复培养基Ⅱ，进行二次恢复培养；
(7)完成步骤(6)后，取所述抗性愈伤组织，置于分化培养基进行培养，获得幼苗；
(8)完成步骤(7)后，取所述幼苗置于生根培养基进行培养，获得玉米自交系转化苗。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
每1L所述共培养培养基包括：MS盐3.90～4.80g、烟酸1.2～1.4mg、VB10.23～0.28mg、VB60.23～0.28mg、泛酸钙0.23～0.28mg、盐酸硫胺0.45～0.55mg、蔗糖27.0～33.0g、L-脯氨酸1.24～1.52g、2,4-D0.45～0.55mg、6-BA0.009～0.011mg、植物凝胶3.15～3.85g和90～110μmol乙酰丁香酮，所述共培养培养基的溶剂为水，所述共培养培养基的pH值为5.4～6.0；
每1L所述恢复培养基Ⅰ包括：MS盐3.90～4.80g、烟酸1.2～1.4mg、VB10.23～0.28mg、VB60.23～0.28mg、泛酸钙0.23～0.28mg、盐酸硫胺0.45～0.55mg、蔗糖27.0～33.0g、L-脯氨酸1.24～1.52g、2,4-D0.45～0.55mg、6-BA0.009～0.011mg、植物凝胶3.15～3.85g、特美汀90～110mg和AgNO33.1～3.7mg，所述恢复培养基Ⅰ的溶剂为水，所述恢复培养基Ⅰ的pH值为5.4～6.0；
每1L所述筛选培养基Ⅰ包括：MS盐3.90～4.80g、烟酸1.2～1.4mg、VB10.23～0.28mg、VB60.23～0.28mg、泛酸钙0.23～0.28mg、盐酸硫胺0.45～0.55mg、蔗糖27.0～33.0g、L-脯氨酸1.24～1.52g、2,4-D0.45～0.55mg、6-BA0.009～0.011mg、植物凝胶3.15～3.85g、特美汀90～110mg、双丙氨膦1.35～1.65mg和AgNO33.1～3.7mg，所述筛选培养基Ⅰ的溶剂为水，所述筛选培养基Ⅰ的pH值为5.4～6.0；
每1L所述筛选培养基Ⅱ包括：MS盐3.90～4.80g、烟酸1.2～1.4mg、VB10.23～0.28mg、VB60.23～0.28mg、泛酸钙0.23～0.28mg、盐酸硫胺0.45～0.55mg、蔗糖27.0～33.0g、L-脯氨酸1.24～1.52g、2,4-D0.45～0.55mg、6-BA0.009～0.011mg、植物凝胶3.15～3.85g、特美汀90～110mg、双丙氨膦2.7～3.3mg和AgNO33.1～3.7mg，所述筛选培养基Ⅱ的溶剂为水，所述筛选培养基Ⅱ的pH值为5.4～6.0；
每1L所述恢复培养基Ⅱ包括：MS盐3.90～4.80g、烟酸1.2～1.4mg、VB10.23～0.28mg、VB60.23～0.28mg、泛酸钙0.23～0.28mg、盐酸硫胺0.45～0.55mg、蔗糖27.0～33.0g、L-脯氨酸1.24～1.52g、6-BA3.15～3.85mg、毒莠定0.9～1.1mg、植物凝胶3.15～3.85g、特美汀90～110mg和双丙氨膦1.35～1.65mg，所述恢复培养基Ⅱ的溶剂为水，所述恢复培养基Ⅱ的pH值为5.4～6.0；
每1L所述分化培养基包括a1)或a2)：
a1)MS盐3.90～4.80g、烟酸1.2～1.4mg、VB10.23～0.28mg、VB60.23～0.28mg、泛酸钙0.23～0.28mg、盐酸硫胺0.45～0.55mg、蔗糖10～15g、葡萄糖15～20g、L-脯氨酸0.63～0.77g、植物凝胶3.15～3.85g、酪蛋白水解物0.18～0.22g、甘氨酸0.036～0.044g、肌醇0.09～0.11g和双丙氨膦2.7～3.3mg，
a2)蔗糖27.0～33.0g、L-脯氨酸0.63～0.77g、植物凝胶3.15～3.85g、KNO32547～3113mg、(NH4)2SO4417～509mg、KH2PO4360～440mg、MgSO4·7H2O167～204mg、CaCl2·2H2O149～183mg、MnSO4·H2O6.8～8.4mg、ZnSO4·7H2O1.8～2.2mg、H3BO32.7～3.3mg、KI0.68～0.83mg、Na2MoO4·2H2O0.23～0.28mg、CuSO4·5H2O0.023～0.028mg、CoCl2·6H2O0.023～0.028mg、乙二胺四乙酸钠铁盐32.9～40.1mg、氯化胆碱0.088～0.108mg、VB20.044～0.054mg、D-生物素0.09～0.11mg、烟酸0.18～0.22mg、叶酸0.0437～0.0534mg、VB10.425～0.519mg、D-泛酸钙0.09～0.11mg、VB60.18～0.22mg、VB120.0014～0.0017mg、对氨基苯甲酸0.044～0.054mg、酪蛋白水解物0.18～0.22g、甘氨酸0.036～0.044g、肌醇0.09～0.11g和双丙氨膦2.7～3.3mg，
所述分化培养基的溶剂为水，所述分化培养基的pH值为5.5～6.1；
每1L所述生根培养基包括：MS盐1.949～2.382g、蔗糖27.0～33.0g、植物凝胶3.15～3.85g和双丙氨膦2.7～3.3mg，所述生根培养基的溶剂为水，所述生根培养基的pH值为5.4～6.0。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述玉米自交系的外植体为玉米自交系的幼胚。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述玉米自交系的幼胚的直径为1.5mm±0.5mm。
5.如权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于：所述“侵染”的方法如下：将所述玉米自交系的幼胚置于农杆菌侵染液中10～20min；
所述农杆菌侵染液为将所述重组农杆菌悬浮于侵染培养基得到的；
每1L所述侵染培养基包括：蔗糖61.6～75.2g，(NH4)2SO4417～509mg,KNO32547～3113mg、KH2PO4360～440mg、MgSO4·7H2O167～204mg、CaCl2·2H2O149～183mg、MnSO4·H2O6.8～8.4mg、ZnSO4·7H2O1.8～2.2mg、H3BO32.7～3.3mg、KI0.68～0.83mg、Na2MoO4·2H2O0.23～0.28mg、CuSO4·5H2O0.023～0.028mg、CoCl2·6H2O0.023～0.028mg、乙二胺四乙酸钠铁盐32.9～40.1mg、氯化胆碱0.088～0.108mg、VB20.044～0.054mg、D-生物素0.09～0.11mg、烟酸0.18～0.22mg、叶酸0.0437～0.0534mg、VB10.425～0.519mg、D-泛酸钙0.09～0.11mg、VB60.18～0.22mg、VB120.0014～0.0017mg、对氨基苯甲酸0.044～0.054mg和90～110mol乙酰丁香酮，所述侵染培养基的溶剂为水，所述侵染培养基的pH值为4.9～5.5。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述农杆菌侵染液的OD550nm值为0.3～0.4。
7.如权利要求1至6任一所述的方法，其特征在于：
所述步骤(3)中所述共培养的条件为18～22℃、暗培养24～48h；
所述步骤(4)中所述初次恢复培养的条件为28～31℃、暗培养7～14天；
所述步骤(5)中所述培养的条件为28～31℃、暗培养10～18天；
所述步骤(6)中所述二次恢复培养的条件为28～31℃、暗培养7～14天；
所述步骤(7)中所述培养的条件为25～29℃、光照培养7～14天；
所述步骤(8)中所述培养的条件为25～29℃。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述步骤(3)中所述共培养的条件为20℃、暗培养36h；
所述步骤(4)中所述初次恢复培养的条件为29℃，暗培养10天；
所述步骤(5)中所述培养的条件为29℃，暗培养14天；
所述步骤(6)中所述二次恢复培养的条件为29℃，暗培养10天；
所述步骤(7)中所述培养的条件为27℃，光照培养10天；
所述步骤(8)中所述培养的条件为27℃。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述光照培养具体为光暗交替培养，光暗交替培养的周期具体为18小时光照培养/6小时黑暗培养，所述光暗交替培养时的光照强度为80～100μE/m2/s。
10.用于玉米自交系遗传转化的试剂盒：
所述试剂盒含有权利要求1中所述共培养培养基和/或所述恢复培养基Ⅰ和/或所述筛选培养基Ⅰ和/或所述筛选培养基Ⅱ和/或所述恢复培养基Ⅱ和/或所述分化培养基和/或所述生根培养基。
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