CN107475287A

CN107475287A - 一种茄子遗传转化方法

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Publication number: CN107475287A
Application number: CN201710744775.3A
Authority: CN
Inventors: 陈火英; 李想; 周露; 刘杨; 葛海燕
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2017-08-25
Filing date: 2017-08-25
Publication date: 2017-12-15
Anticipated expiration: 2037-08-25
Also published as: CN107475287B

Abstract

本发明提供了一种茄子遗传转化方法，包括如下步骤：S1、将茄子种子前处理后置于发芽培养基中进行发芽培养，得无菌茄子幼苗；S2、对幼苗进行处理获得外植体，取外植体接种于预培养基中进行预培养；S3、活化含目的基因的农杆菌，配置含所述农杆菌的侵染菌液；S4、将预培养所得外植体用所述侵染菌液侵染后，在共培养基中进行共培养；S5、将共培养所得外植体经清洗、浸泡后，置于第一恢复培养基中进行第一恢复培养，再置于筛选培养基中进行筛选培养；将筛选所得外植体置于第二恢复培养基进行第二恢复培养；S6、取第二恢复培养所得不定芽进行生根培养，将再生植株进行驯化移栽。本方法具有转化周期短、植株假阳性比率低和转化率高的优点。

Description

一种茄子遗传转化方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种茄子遗传转化方法。

背景技术

茄子(Solanum melongena L.)原产亚热带地区，亚洲栽培最多，是我国重要的经济作物。2016年我国茄子种植面积1209万亩，产量3173万吨，并呈逐年递增趋势。茄子营养丰富，含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素以及钙、磷、铁等多种营养成分，具有抗衰老、降血压、降胆固醇等营养和药用价值。

生产过程中，绵疫病、灰霉病、蚜虫、红蜘蛛、冷害等的发生会造成茄子田间产量大幅度下降。虽然通过田间轮作、种子和苗床消毒、嫁接育苗等方法能减少病虫害的发生，但是此类难题依然没有得到很好的解决。植物转基因技术是21世纪新兴的生物技术，通过将外源基因转入植物体内，可改善或增强植物的遗传特性。常用的转化方法有原生质体融合、花粉管通道法、基因枪法、农杆菌介导法等。农杆菌介导法可行性强，具有操作简单，成本低，重复性好等特点。

茄子转基因技术研究相比同科的番茄、马铃薯进展较为缓慢，缺少高效稳定的遗传转化体系。转基因技术为提高茄子的产品品质，培育抗病毒、抗虫、抗盐碱特性的作物新品种提供了可行性依据，因此建立一套茄子高效遗传转化体系具有重要意义。但目前，利用农杆菌介导法制备转基因茄子的方法中还存在试用茄子品种范围窄、转化周期过长、获得植株假阳性比率高(11.2％～63.6％)、转化率低(1.9％)的不足。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种茄子遗传转化方法；进一步地，本发明提供一种稳定高效的茄子遗传转化体系。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供一种茄子遗传转化方法，包括如下步骤：

S1、将茄子种子前处理后置于发芽培养基中进行发芽培养，得到无菌茄子幼苗；

S2、对幼苗进行处理获得外植体，取外植体接种于预培养基中进行预培养；

S3、活化含目的基因的农杆菌，配置含所述农杆菌的侵染菌液；

S4、将预培养所得外植体用所述侵染菌液侵染后，在共培养基中进行共培养；

S5、将共培养所得外植体经清洗、浸泡后，置于第一恢复培养基中进行第一恢复培养，再置于筛选培养基中进行筛选培养；将筛选所得外植体置于第二恢复培养基进行第二恢复培养；

S6、取第二恢复培养所得不定芽进行生根培养，将再生植株进行驯化移栽。上述步骤中，在培养基中的培养均在无菌条件下进行。

上述第一恢复培养可使共培养后的外植体恢复活力，诱导愈伤组织；通过筛选培养筛选后的外植体可确定其具有标记基因抗性，因此在后续的培养中可不使用筛选剂，即第二恢复培养，同时促进外植体不定芽的生长。

优选地，步骤S1中，所述前处理的步骤包括：

S1.1取子粒饱满茄子种子用浓度为600mg·L^-1的赤霉素浸泡2h；

S1.2在无菌条件下，将上述茄子种子用无菌水清洗1遍，75％乙醇清洗1遍，无菌水清洗1遍，20％次氯酸钠浸泡30min，无菌水清洗4遍；

S1.3在无菌条件下，用无菌滤纸将种子表面水分吸干，备用。

优选地，步骤S1中，所述发芽培养基包括MS、30g·L^-1蔗糖和7g·L^-1琼脂粉，pH值为5.8；

所述发芽培养的条件为：光照强度为3000lux，温度为23～27℃，先暗培养6～8d，待种子露白后，光16h暗8h交替培养6～8d。

优选地，步骤S2中，所述获得外植体的步骤包括：在无菌条件下，将完全展开的茄子子叶剪成5mm×5mm小块.；再将所得外植体接种于预培养基中进行预培养。

优选地，步骤S2中，所述预培养基包括MS、30g·L^-1蔗糖、2.0mg·L^-1玉米素和7g·L^-1琼脂粉，pH值为5.8；

所述预培养的条件为：光照强度为3000lux，温度为23～27℃，光16h暗8h交替培养2d。

优选地，步骤S3中，所述活化的步骤包括：将含目的基因的农杆菌进行震荡培养，温度为28℃，转速为220r·min^-1，得到OD_600nm值为0.6～0.7的农杆菌菌液；

所述配置的步骤包括：分别取等体积的农杆菌菌液和培养液，将所述农杆菌菌液离心，弃上清液后，加入所述培养液重悬得侵染菌液；所述培养液包括MS、30g·L^-1蔗糖、2.0mg·L^-1玉米素、100mmol·L^-1乙酰丁香酮，pH值为5.8。所述离心的条件为10000r，离心3min。

优选地，所述目的基因的基因片段的长度为500bp～3000bp。所述目的基因包括基因GUS和基因GFP。

优选地，步骤S4中，所述侵染的步骤包括：在无菌条件下，将共培养所得外植体移至侵染菌液中侵染15min；在无菌条件下，用无菌滤纸将外植体表面水份吸干；将外植体接种于共培养基中进行共培养。

优选地，步骤S4中，所述共培养基包括MS、30g·L^-1蔗糖、2.0mg·L^-1玉米素、100mmol·L^-1乙酰丁香酮和7g·L^-1琼脂粉，pH值为5.8；

所述共培养的条件为：温度为23～27℃，暗培养4d。

优选地，步骤S5中，所述清洗、浸泡的步骤包括：在无菌条件下，用无菌水将共培养所得外植体进行清洗，用300mg·L^-1的羧苄青霉素溶液浸泡外植体30min；在无菌条件下，用无菌滤纸将外植体表面水份吸干，将外植体接种于第一恢复培养基中进行恢复培养。所述清洗的次数为4次。在共培养转第一恢复培养时，外植体用无菌水清洗4遍，羧苄青霉素浓度为300mg·L^-1的溶液浸泡30min，此步骤是抑制农杆菌生长的关键，并能够保证外植体的正常生长分化。

优选地，步骤S5中，所述第一恢复培养基包括MS、30g·L^-1蔗糖、2.0mg·L^-1玉米素、300mg·L^-1羧苄青霉素和7g·L^-1琼脂粉，pH值为5.8；

所述第一恢复培养的条件为：光照强度为3000lux，温度为23～27℃，光16h暗8h交替培养7d。

第一恢复培养可使共培养后的外植体恢复活力，诱导愈伤组织；若不增加第一恢复培养，将共培养后的外植体直接进行筛选培养会导致外植体不能长出愈伤，成活率低和得苗率低、甚至为零，从而很难得到转化植株。

优选地，步骤S5中，所述筛选培养的步骤包括：在无菌条件下，将经第一恢复培养所得外植体接种到筛选培养基上，14d继代培养1次(计1次筛选)，共4次继代培养，共56d。每次继代培养时除去褐化死亡的外植体，留新生愈伤组织继续培养。上述筛选培养中，若筛选培养时间短，会使再生植株假阳性比例高，工作效率低，增加后期的检验鉴定工作；若筛选时间过长，一方面浪费筛选剂，另一方面由于筛选剂对外植体的生长有轻微的抑制作用，外植体生长速度慢，因此选择在4次筛选培养后选择不使用筛选剂，既可以节约成本，又可以促进外植体的生长。

优选地，步骤S5中，所述筛选培养培养基包括MS、30g·L^-1蔗糖、2.0mg·L^-1玉米素、300mg·L^-1羧苄青霉素、10～100mg·L^-1筛选剂和7g·L^-1琼脂粉，pH值为5.8；

所述筛选培养的条件为：光照强度为3000lux，温度为23～27℃，光16h暗8h交替培养56d。

优选地，所述筛选剂为潮霉素、卡那霉素、青霉素等的某一种。由于含目的基因的载体上含有不同的抗性标记基因，因而对应不同的筛选剂。当所选含目的基因载体含有潮霉素标记基因时，筛选剂选用潮霉素。

优选地，步骤S5中，所述第二恢复培养的步骤包括：在无菌条件下，将筛选所得外植体接种第二恢复培养基上，14d继代培养1次，共1～3次继代培养。

优选地，步骤S5中，所述第二恢复培养基包括MS、30g·L^-1蔗糖、2.0mg·L^-1 6-苄氨基腺嘌呤、1mg·L^-1玉米素、300mg·L^-1羧苄青霉素和7g·L^-1琼脂粉，pH值为5.8；

所述第二恢复培养的条件为：光照强度为3000lux，温度为23～27℃，光16h暗8h交替培养14～42d。

优选地，步骤S6中，所述生根培养的步骤包括：在无菌条件下，当外植体的不定芽生长良好，并具有2-4片真叶(约4cm)时，取外植体的不定芽置于生根培养基进行生根培养，获得再生植株；

所述生根培养基包括MS、30g·L^-1蔗糖、0.1mg·L^-1吲哚乙酸、200mg L^-1羧苄青霉素和7g·L^-1琼脂粉，pH值为5.8；

所述生根培养的条件为：光照强度为3000lux，温度为23～27℃，光16h暗8h培养14～28d。

优选地，步骤S6中，所述驯化移栽的步骤包括：待再生植株主根生长至3～5cm，敞口培养2d，将再生植株移栽至营养钵中(草炭：蛭石＝2:1)继续在培养箱中培养5～7d后，移栽到温室中培养；

所述驯化移栽的培养条件为：光照强度为3000lux，温度为23～27℃，光16h暗8h培养5～7d。

本发明中培养基中各组分的浓度值均为适应性最广、效果最好的选择。本转化体系使用表面活化剂乙酰丁香酮，在浸染菌液与共培养培养基中均有添加，提高了外植体的转化率。

本发明以高效的茄子再生体系为基础，农杆菌侵染茄子子叶，经预培养、共培养、第一恢复培养、筛选培养、第二恢复培养、生根培养等过程获得转化植株。为了探索高效的茄子遗传转化体系，本发明在大量的试验基础上，对预培养、共培养、农杆菌侵染条件等影响因素进行摸索试验，最终获得本遗传转化体系。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、筛选培养旨在筛选具有抗性的外植体，能够减少再生植株假阳性率，提高阳性植株得苗率。通过大量的实验摸索发现，通过4次筛选培养即56d，能够彻底区分外植体是否具有标记基因抗性，且具有抗性的外植体存活。

2、第一恢复培养可使共培养后的外植体恢复活力，诱导愈伤组织。通过筛选培养可基本确定外植体具有标记基因抗性，因此在后续的培养中即第二恢复培养，可不使用筛选剂，同时促进不定芽的生长。

3、本发明具有操作简单，重复性强，适应性好，成本低廉等优点，较基因枪法、聚乙二醇法具有明显优势，对茄子基因工程的理论研究及优化种质资源具有重要意义。

4、本发明在5个来源不同的试验材料上取得成功，由此可知该体系适应范围广，且转化率最高可达10％，具有推广价值。

5、本发明转化方法具有转化周期短、植株假阳性比率低和转化率高的优点。其中，本发明中高效的再生体系是转化周期短直接有力的保证；同时，第二恢复培养中由于不加入筛选剂，进一步有利于缩短转化周期；另外，4次筛选培养是植株假阳性比率低和转化率高的根本保证。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为实施例1中预培养外植体的实物照片；

图2为实施例1中共培养外植体的实物照片；

图3为实施例1中第一恢复培养外植体的实物照片；

图4为实施例1中4次筛选培养外植体的实物照片；

图5为实施例1中已分化不定芽的实物照片；

图6为实施例1中不定芽诱导生根的实物照片；

图7为实施例1中转化植株的实物照片；

图8为实施例1转化植株GFP基因PCR检测结果；

图9为实施例2转化植株GUS基因PCR检测结果；

图10为实施例2转化植株与未转化植株GUS组织活性染色结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

一、实验材料

1.植物材料

实验室保存白撮茄种子为供试植物材料。

2.菌株和质粒

农杆菌GV3101感受态购置于上海唯地生物技术有限公司。

实验室保存含有标记基因绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein简称:GFP，下同)的pHB表达载体：GFP质粒。

3.培养基成分

本试验的茄子遗传转化体系包括发芽培养、预培养、共培养、第一恢复培养、筛选培养、第二恢复培养、生根培养和驯化移栽过程，并使用相对应的培养基。

发芽培养基含有MS+蔗糖30mg·L^-1+琼脂粉7g·L^-1，pH值为5.8；

预培养基含有MS+蔗糖30mg·L^-1+玉米素2.0mg·L^-1+琼脂粉7g·L^-1，pH值为5.8；

共培养基含有MS+蔗糖30mg·L^-1+玉米素2.0mg·L^-1+乙酰丁香酮100mmol·L^-1+琼脂粉7g·L^-1，pH值为5.8；

第一恢复培养基含有MS+蔗糖30mg·L^-1+玉米素2.0mg·L^-1+羧苄青霉素300mg·L^-1+琼脂粉7g·L^-1，pH值为5.8；

筛选培养基含有MS+蔗糖30mg·L^-1+玉米素2.0mg·L^-1+羧苄青霉300mg·L^-1+潮霉素50mg·L^-1+琼脂粉7g·L^-1，pH值为5.8；

第二恢复培养基含有MS+蔗糖30mg·L^-1+6-苄氨基腺嘌呤2.0mg·L^-1+玉米素1mg·L^-1+羧苄青霉素300mg·L^-1+琼脂粉7g·L^-1，pH值为5.8；

生根培养基含有MS+蔗糖30mg·L^-1+吲哚乙酸0.1mg·L^-1+羧苄青霉素200mg·L^-1+琼脂粉7g·L^-1，pH值为5.8。

二、实验方法

1.发芽培养

(1)取子粒饱满的茄子种子用浓度为600mg·L^-1的赤霉素浸泡2h；

(2)在无菌条件下，将种子用无菌水清洗1遍，75％乙醇清洗1遍，无菌水清洗1遍，20％次氯酸钠浸泡30min，无菌水清洗4遍；

(3)在无菌条件下，用无菌滤纸将种子表面水分吸干，将种子移至培养瓶进行发芽培养。

发芽培养的光照强度为3000lux，温度为23～27℃，先暗培养6～8d，待种子露白后，光16h暗8h交替培养6～8d，待茄子幼苗的子叶完全展开即可。

2.预培养

在无菌条件下，将完全展开的茄子子叶剪成5mm×5mm，接种于培养基上进行预培养。

预培养的光照强度为3000lux，温度为23～27℃，光16h暗8h交替培养2d。

3.配置侵染菌液

(1)农杆菌活化

采用热激法将质粒pHB：GFP导入GV3101菌株中。将含基因GFP的农杆菌进行震荡培养，温度为28℃，转速为220r·min^-1，测菌液OD_600nm值在0.6～0.7之间即可。

(2)配置侵染菌液

取V体积菌液10000r，离心3min，弃上清液，用等体积(即V)溶液(溶液含有MS+蔗糖30mg·L^-1+玉米素2.0mg·L^-1+乙酰丁香酮100mmol·L^-1，PH值为5.8)重悬得侵染菌液。

4.共培养

(1)在无菌条件下，将外植体移至含侵染菌液的50ml离心管中，农杆菌侵染外植体15min；

(2)在无菌条件下，将农杆菌侵染后的外植体放置无菌滤纸上吸干表面水份后，接种于培养基上进行共培养。

共培养的温度为23～27℃，暗培养4d。

5.第一恢复培养

(1)在无菌条件下，用无菌水将外植体清洗4遍，用羧苄青霉素浓度为300mg·L^-1的溶液浸泡外植体30min；

(2)在无菌条件下，将清洗、浸泡过的外植体放置无菌滤纸上吸干表面水份后，接种于培养基进行第一恢复培养。

第一恢复培养的光照强度为3000lux，温度为23～27℃，光16h暗8h交替培养7d。6.筛选培养

在无菌条件下，将外植体接种到筛选培养基上，14d继代培养1次(计1次筛选)，共4次筛选培养，共56d。每次继代培养时除去褐化死亡的外植体，留新生愈伤组织继续培养。筛选剂为潮霉素，筛选浓度为50mg·L^-1。

筛选培养的光照强度为3000lux，温度为23～27℃，光16h暗8h交替培养56d。7.第二恢复培养

在无菌条件下，将外植体接种培养基上，14d继代培养1次。

第二恢复培养条件光照强度为3000lux，温度为23～27℃，光16h暗8h培养14～42d。

8.生根培养

在无菌条件下，当不定芽生长良好，并有2-4片真叶(约4cm)时，将其不定芽切下进行生根培养。

生根培养条件光照强度为3000lux，温度为23～27℃，光16h暗8h培养14～28d。9.驯化移栽

待再生植株主根生长至3～5cm左右，将培养瓶口敞开培养2d，再将之移栽至营养钵中(草炭：蛭石＝2:1)，继续在培养箱中培养5～7d后，移栽到温室中培养。

驯化移栽培养条件光照强度为3000lux，温度为23～27℃，光16h暗8h培养5～7d。

10.再生植株的PCR检测

使用生工Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒，按照用户操作手册，提取再生植株叶片DNA，以未转化茄子植株为阴性对照，质粒为阳性对照，进行PCR检测。再生植株PCR检测GFP基因(F：5'-GTGATATCTCCACTGACGTAAGGGA-3'；R：

5'-ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA-3')。PCR反应体系(20ul)：DNA 1ul、上游引物1ul、下游引物1ul、ExTaq酶0.4ul、DNTP溶液2ul、Buffer缓冲液2ul、ddH₂O 12.6ul。PCR反应程序：98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，33次循环；16℃终止反应。PCR产物用浓度为1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。

三、结果

本试验共获得再生植株3株。经PCR检测可知(见附图8)，3株再生植株与阳性对照均有目标条带且大小相同，阴性对照并未检测到目标条带。因此证实，基因GFP已成功转入白撮茄。

本实施测试结果如下表所示：其中转化率＝转化植株数/外植体数×100％，假阳性率＝(再生植株－转化植株)/外植体数×100％。

实施例2

一、实验材料

1.植物材料

根据葛海燕(葛海燕《基于SSR标记的茄子遗传多样性及主要农艺性状的关联分析》上海交通大学博士论文2013)对实验室保存的茄子材料进行的亲缘关系分析图谱(152个茄子材料的UPGMA聚类图)，均匀选取实验室保存的编号为60、110、116、140种子为供试植物材料。

2.菌株和质粒

农杆菌GV3101感受态购置于上海唯地生物技术有限公司。

含有标记基因β-葡萄糖苷酸酶(简称:GUS基因，下同)的pHB表达载体：GUS质粒由上海交通大学园艺植物分子育种实验室惠赠。

3.培养基成分

发芽培养基含有MS+蔗糖30mg·L^-1+琼脂粉7g·L^-1，PH值为5.8；

预培养培养基含有MS+蔗糖30mg·L^-1+玉米素2.0mg·L^-1+琼脂粉7g·L^-1，PH值为5.8；

共培养培养基含有MS+蔗糖30mg·L^-1+玉米素2.0mg·L^-1+乙酰丁香酮100mmol·L^-1+琼脂粉7g·L^-1，PH值为5.8；

第一恢复培养培养基含有MS+蔗糖30mg·L^-1+玉米素2.0mg·L-¹+羧苄青霉素300mg·L^-1+琼脂粉7g·L^-1，PH值为5.8；

筛选培养培养基含有MS+蔗糖30mg·L^-1+玉米素2.0mg·L^-1+羧苄青霉300mg·L^-1+潮霉素50mg·L^-1+琼脂粉7g·L^-1，PH值为5.8；

第二恢复培养培养基含有MS+蔗糖30mg·L^-1+6-苄氨基腺嘌呤2.0mg·L^-1+玉米素1mg·L^-1+羧苄青霉素300mg·L^-1+琼脂粉7g·L^-1，PH值为5.8；

生根培养培养基含有MS+蔗糖30mg·L^-1+吲哚乙酸0.1mg·L^-1+羧苄青霉素200mg·L^-1+琼脂粉7g·L^-1，PH值为5.8。

二、实验方法

1.发芽培养

(1)取子粒饱满的茄子种子用浓度为600mg·L^-1的赤霉素浸泡2h；

2.预培养

3.配置侵染菌液

(1)农杆菌活化

采用热激法将质粒pHB：GUS导入GV3101菌株中。将含基因GUS的农杆菌进行震荡培养，温度为28℃，转速为220r·min^-1，测菌液OD_600nm值在0.6～0.7之间即可。

(2)配置侵染菌液

取V体积菌液10，000r，离心3min，弃上清液，用等体积(即V)溶液(溶液含有MS+蔗糖30mg·L^-1+玉米素2.0mg·L^-1+乙酰丁香酮100mmol·L^-1，PH值为5.8)重悬得侵染菌液。

4.共培养

共培养的温度为23～27℃，暗培养4d。

5.第一恢复培养

在无菌条件下，将外植体接种培养基上，14d继代培养1次。

8.生根培养

10.再生植株的PCR检测

使用生工Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒，按照用户操作手册,提取再生植株叶片DNA，以未转化茄子植株为阴性对照，质粒为阳性对照，进行PCR检测。再生植株PCR检测GUS基因(F：5'-CACCGACATGTGGAGTGAAGAGTA-3'；R：

5'-GCATTGAACTTGACGAACGTTGTCGA-3')。PCR反应体系(20ul)：DNA 1ul、上游引物1ul、下游引物1ul、ExTaq酶0.4ul、DNTP溶液2ul、Buffer缓冲液2ul、ddH2O12.6ul。PCR反应程序：98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，33次循环；16℃终止反应。PCR产物用浓度为1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。

11.GUS组织活性检测

取再生植株幼嫩叶片进行GUS组织活性检测，以未转化植株叶片作为对照。检测方法为：将待测材料放入配制好的GUS染色液中，37℃恒温处理12h。用75％乙醇脱色，至阳性对照呈白色。将试验材料进行比较观察，记录试验结果。

三、结果

本试验共获得再生植株7株，编号为60的材料2株、编号为110的材料1株、编号为116的材料1株、编号为140的材料3株。经PCR检测(见附图9)，7株再生植株均有目标条带且大小与阳性对照相同，阴性对照并未检测到目标条带。同时，通过GUS组织活性检测，7株植株叶片均染成蓝色(见附图10)，对照呈白色。因此，GUS基因已成功转入到茄子体内。

茄子高效再生体系是遗传转化的基础和保证，本发明已在5个来源不同的试验材料上取得成功，可证明该体系品种适用性强。从实施例结果可知，5个试验材料均获得转化植株，获得假阳性植株数为0，转化率最高的可达10％，高于现有报道茄子的转化率。本发明可广泛应用于茄子遗传转化过程中，适于推广与应用。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims

1.一种茄子遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

S6、取第二恢复培养所得不定芽进行生根培养，将再生植株进行驯化移栽。

2.根据权利要求1所述的茄子遗传转化方法，其特征在于，步骤S1中，所述发芽培养基包括MS、30g·L^-1蔗糖和7g·L^-1琼脂粉，pH值为5.8；

3.根据权利要求1所述的茄子遗传转化方法，其特征在于，步骤S2中，所述预培养基包括MS、30g·L^-1蔗糖、2.0mg·L^-1玉米素和7g·L^-1琼脂粉，pH值为5.8；

4.根据权利要求1所述的茄子遗传转化方法，其特征在于，步骤S3中，所述活化的步骤包括：将含目的基因的农杆菌进行震荡培养，温度为28℃，转速为220r·min^-1，得到OD_600nm值为0.6～0.7的农杆菌菌液；

所述配置的步骤包括：分别取等体积的农杆菌菌液和培养液，将所述农杆菌菌液离心，弃上清液后，加入所述培养液重悬得侵染菌液；所述培养液包括MS、30g·L^-1蔗糖、2.0mg·L^-1玉米素、100mmol·L^-1乙酰丁香酮，pH值为5.8。

5.根据权利要求1所述的茄子遗传转化方法，其特征在于，步骤S4中，所述共培养基包括MS、30g·L^-1蔗糖、2.0mg·L^-1玉米素、100mmol·L^-1乙酰丁香酮和7g·L^-1琼脂粉，pH值为5.8；

所述共培养的条件为：温度为23～27℃，暗培养4d。

6.根据权利要求1所述的茄子遗传转化方法，其特征在于，步骤S5中，所述第一恢复培养基包括MS、30g·L^-1蔗糖、2.0mg·L^-1玉米素、300mg·L^-1羧苄青霉素和0.7g·L^-1琼脂粉，pH值为5.8；

7.根据权利要求1所述的茄子遗传转化方法，其特征在于，步骤S5中，所述筛选培养基包括MS、30g·L^-1蔗糖、2.0mg·L^-1玉米素、300mg·L^-1羧苄青霉素、10～100mg·L^-1筛选剂和7g·L^-1琼脂粉，pH值为5.8；

8.根据权利要求1所述的茄子遗传转化方法，其特征在于，步骤S5中，所述第二恢复培养基包括MS、30g·L^-1蔗糖、2.0mg·L^-1 6-苄氨基腺嘌呤、1mg·L^-1玉米素、300mg·L^-1羧苄青霉素和7g·L^-1琼脂粉，pH值为5.8；

9.根据权利要求1所述的茄子遗传转化方法，其特征在于，步骤S6中，所述生根培养基包括MS、30g·L^-1蔗糖、0.1mg·L^-1吲哚乙酸、200mg L^-1羧苄青霉素和7g·L^-1琼脂粉，pH值为5.8；

10.根据权利要求1所述的茄子遗传转化方法，其特征在于，步骤S6中，所述驯化移栽的步骤包括：待再生植株主根生长至3～5cm，敞口培养2d，将再生植株移栽至营养钵中继续在培养箱中培养5～7d后，移栽到温室中培养；