CN104745622A - 一种玉米骨干自交系的高效转基因方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种玉米骨干自交系的高效转基因方法，该方法通过在共培养基和休息培养基中添加细胞激动素KT(6-糖基氨基嘌呤)0.01-1mg/L，同时在选择培养基中确定最佳的筛选剂浓度，即双丙氨膦添加浓度为0.5-50mg/L，实现了对玉米骨干自交系高效率的转化效果。本发明方法具有实验周期短、阳性率高、操作简单方便的特点，用于制备转基因玉米，适合大规模推广。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域和作物育种领域，具体地说，涉及一种玉米骨干自交系的高效转基因方法。
背景技术
转基因玉米是世界上最重要的转基因作物之一。2010年全球转基因玉米种植面积达4680万公顷，占全球玉米总面积的26％。在玉米转基因技术上，直到80年代后期才在转化方面取得突破。第一例成功的玉米自交系(A188)培养出再生植株报道于1975年。一直到1988年，Klein等人用基因枪法把cat基因转移到玉米的胚状体和非胚状体细胞中，并发现有短暂表达。与此同时，基因表达和标记系统也得到发展。到1996年，农杆菌共培养法才成功用于转化自交系A188。玉米转化方法除了基因枪法，还包括电击法、超声波法、微注射法、PEG法和农杆菌介导法。
转基因玉米的研究走过了对转化方法的探索阶段、直接遗传转化方法的研究与发展阶段，而今已经入商品化阶段。因此，发明适合商业化生产的玉米品种的高效稳定的转基因方法，对于抢占转基因玉米市场先机起着至关重要的作用。
相比综31、Hi-II、A188等这些常用来作为玉米转化的受体材料而言，‘祥249’作为市场推广品种‘长城799’的母本材料，属于国内市场推广品种，具有适应国内气候条件、农艺性状良好的优点。而且建立玉米优良自交系组织培养体系，进而把外源基因直接导入，可缩短育种周期，加速基因工程产业化的进程。然而在实际操作中，按照常规的转基因方法制备‘祥249’转基因品种存在诸多缺点，主要表现在转化效率低，阳性率低、转化周期长等方面。因此如何突破玉米骨干自交系‘祥249’基因型限制，探索出适合‘祥249’胚性愈伤组织形成及再生的培养基体系，建立一种适合自交系‘祥249’的玉米转基因方法，提高转化效率和阳性率是本领域技术人员迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于工业化规模的向玉米骨干自交系导入外源基因的的高效转基因方法。
本发明提供的玉米骨干自交系转基因方法包括以下步骤：
(1)将玉米骨干自交系的幼胚浸入携带外源基因和Bar标记基因的农杆菌菌液中侵染；
(2)将幼胚移至含有细胞激动素KT的共培养基上培养；
(3)将幼胚移至含有细胞激动素KT的休息培养基上培养；
(4)将幼胚移至选择培养基上培养，选择培养基中含筛选剂双丙氨膦，诱导胚性愈伤组织；再转移到分化培养基上，分化形成再生小苗；
(5)再生小苗在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因玉米。
本发明方法适用的导入外源基因不限于实施例所述的基因，包括本领域技术人员希望导入玉米中的任何外源基因。
本发明方法中，步骤(1)中玉米骨干自交系的幼胚是从授粉后6-15天，待玉米幼胚长至0.5-2.0mm时从玉米穗上剥取获得。
其中，步骤(1)的侵染时间不超过15min。所述的农杆菌为EHA105或LBA4404。
其中，步骤(2)中共培养基含KT浓度为0.01-1mg/L。
优选地，共培养基含KT浓度为0.05-0.1mg/L。更优选地，共培养基含KT浓度为0.1mg/L。
其中，上述步骤(2)培养条件为23℃黑暗培养48-96h。
其中，步骤(3)中休息培养基含KT浓度为0.01-1mg/L。
优选地，休息培养基含KT浓度为0.05-0.1mg/L。更优选地，休息培养基含KT浓度为0.1mg/L。
其中，上述步骤(3)培养条件为26-34℃黑暗培养1-2周。
本发明方法的步骤(4)中选择培养基中双丙氨膦的浓度为0.5-50mg/L。优选地，选择培养基中双丙氨膦的浓度为3-10mg/L。
更优选地，选择培养基中双丙氨膦的浓度为8mg/L。
优选地，本发明方法中所述的玉米骨干自交系为‘祥249’。
本发明还提供了细胞激动素KT(6-糖基氨基嘌呤)在制备转基因植物中的应用。
细胞激动素KT在作物育种中的应用也属于本发明的保护范围。
进一步，上述细胞激动素KT在制备转基因植物中的应用表现在，在植物胚性愈伤组织形成及再生的培养基体系中添加KT。
具体地，在共培养基上和休息培养基上，KT的浓度为0.05-0.1mg/L。
本发明方法具有操作简单方便、实验周期短的特点，利用本发明的转基因方法在55-70天就能得到转化植株，而常规玉米转化周期一般为3个月，本发明方法大大缩短了转基因玉米的培养周期，提高了转化效率。另外本发明方法获得的转化植株阳性率高，适合转基因玉米的大规模推广使用。
附图说明
图1为外源基因(GFP)在组织中的表达图。图1A为外源基因(GFP)在转化玉米幼胚的表达图；图1B为外源基因(GFP)在转化愈伤组织的表达图；图1C为外源基因(GFP)在转化植株叶片的表达图。a：阳性植物材料在白光下的影像；b：阳性植物材料在荧光下的影像；c：阴性植物材料在白光下的影像；d：阴性植物材料在荧光下的影像。
图2为转基因植株中外源基因(Bar)PCR扩增结果图。M：为2KB Marker分子量标准；1-13：本发明制备的转基因玉米编号；N：阴性对照；P：阳性对照。
图3为转基因植株中外源基因Southern Blot检测图。WT为阴性对照，1、2、3、4、5、6、7号为转基因玉米检测样品。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
实施例1 含目的基因的根癌农杆菌的制备
本具体实施方式使用的农杆菌菌株是EHA105和LBA4404。通过本领域常用的农杆菌转化方法将抗除草剂基因Bar(基因序列如SEQ ID NO：1)、绿色荧光蛋白编码基因GFP(基因序列如SEQ IDNO：2)转入农杆菌。需要理解的是，本具体实施方式是以绿色荧光蛋白编码基因作为外源基因的示例，但本发明不限于特定的外源基因。本实施方式所用到的农杆菌导入基因、载体构建方法及所用质粒等只是为本领域技术人员所熟知。
侵染前一周，从-80℃冰箱取20μL甘油菌，在添加相应抗生素的YEP培养基板上划线(EHA105对应抗生素为Kana50mg/L、Rif20mg/L；LBA4404对应抗生素Kan50mg/L、Str25mg/L)；将划好的菌板放于28℃黑暗培养24小时左右待单克隆菌落长出，取出放于4℃冰箱备用。储存时间不宜超过一周；用一次性接种环从单克隆板上取4-5个菌落在添加相应抗生素的YEP培养基板上划条带或按顺序在板上涂抹均匀将划好的菌板放于28℃黑暗培养24小时左右待菌落条带长出，取出放于4℃冰箱备用。
实施例2 转基因玉米的制备
本实施例中所用玉米自交系为‘祥249’，由中国种子集团有限公司提供。
1、果穗的选择和幼胚的分离
(1)分别挑授粉6-15天，幼胚长至0.5-2.0mm的玉米穗子，样本数不少于500个；
(2)将浓度为6.15％的次氯酸钠按体积15％的浓度与灭菌水混匀，加入1滴(20ul)Tween-20制成灭菌剂；
(3)将玉米穗子放入灭菌剂浸泡15分钟，然后用无菌水冲洗3-5次；
(4)剥取幼胚，并将幼胚放入悬浮液中。
2、侵染与共培养
(1)将剥取的玉米未成熟幼胚放入含有1.8mL悬浮液的2ml EP管中，30min内大约处理未成熟幼胚150个，然后加入1.0ml OD值为0.1-0.5的农杆菌悬浮液，静置5min。
(2)侵染后，将EP管中的幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗培养48-96小时。
3、诱导与筛选
(1)共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于26-34℃黑暗培养1-2周。
(2)将幼胚转入选择培养基上，于28℃黑暗培养。定期观察愈伤的生长状况及是否产生污染，若发生污染及时更换新的培养基。4、植株再生与移栽
(1)筛选培养后，将抗性愈伤组织转移至分化培养基1中，25℃，5000lx，光照培养1周。再将愈伤转移至分化培养基2中，光照培养2周；
(2)将分化生出的小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；
(3)将转基因小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，3-4个月后即可收获后代种子。
转化过程中所用到的培养基配方如下：
悬浮：1/2MS+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+L-脯氨酸0.115g/L
侵染：1/2MS+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+L-脯氨酸0.115g/L+乙酰丁香酮200mM
共培养基：1/2MS+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+脯氨酸0.115g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO3 20mM+L-半胱氨酸200mg/L+2,4-D0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+KT(0.01-1)mg/L+乙酰丁香酮200mM
休息培养基：MS+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO3 20mM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+KT(0.01-1)mg/L+特美汀200mg/L
选择培养基：MS+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO3 20mM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+特美汀200mg/L+双丙氨膦0.5-50mg/L
分化培养基1：MS+蔗糖20g/L+硫酸铜10mM+MES0.5g/L+6-BA3.5mg/L+特美汀200mg/L+双丙氨膦3mg/L
分化培养基2：MS+蔗糖20g/L+硫酸铜10mM+MES0.5g/L+特美汀200mg/L+双丙氨膦3mg/L
生根培养基：MS+蔗糖20g/L+MES0.5g/L+IBA0.2mg/L
5、数据统计与分析
(1)共培养基和休息培养基中添加KT
在共培养和休息培养阶段，培养基中除了添加植物生长调节剂2,4-D和毒莠定之外，添加细胞激动素KT可大幅度提高转化效率。其添加与否的对比效果如表1所示，实验1-1、1-2、1-3、1-4每个处理的样本数均在100或以上。在共培养基和休息培养基添加细胞激动素KT至0.05mg/L或0.1mg/L后，转化率得到了大幅提高，由平均0.96％分别提高到了16.77％或12.87％。
表1 共培养和休息培养KT添加与否的转化率(％)对比
(2)共培养基和休息培养基中KT的添加浓度的确定
在共培养和休息培养阶段，培养基中添加不同浓度的激动素KT，其添加效果如表2所示，KT浓度范围设置为0.01mg/L-1.0mg/L时，均可以得到转基因阳性植株。
表2 共培养基和休息培养基中添加不同浓度KT的转化结果
(3)筛选培养阶段筛选剂浓度的确定
转化幼胚经过休息培养后，需要筛选培养2个周期，每个周期为1-2周，每个周期筛选剂浓度可不同。如表3所示，在外植体实验条件一致的前提下，当第一周期和第二周期双丙氨膦浓度分别为5mg/L、8mg/L时，转化率为13％；当第一周期和第二周期双丙氨膦浓度分别为8mg/L、8mg/L时，转化率为9％；当第一周期和第二周期双丙氨膦浓度分别为8mg/L、10mg/L时，转化率为6.25％；且在选择培养基中双丙氨膦的添加浓度范围在0.5-50mg/L时，均能得到转基因阳性植株。因此，本发明所述的选择培养基中双丙氨膦的添加量为终浓度范围在0.5-50mg/L之间，优选5-10mg/L，更优选8mg/L。另外，由于实验只经过两个筛选周期，缩短了整个转化周期，一般只需55-70天就能得到转化植株。
表3 不同双丙胺膦浓度的筛选效果
注：筛选浓度是指转化过程中经过两轮筛选培养的筛选剂浓度。
(4)休息培养温度优化实验
在休息培养阶段，培养温度对转化效率也有影响。如表4所示，休息培养温度设置范围为26℃-34℃时，都能得到转基因植株。因此，本发明所述的休息培养温度范围在26℃-34℃之间。
表4 休息培养不同温度处理转化率(％)对比
实施例3 转基因玉米的检测
1、转基因玉米中外源基因GFP在组织中的表达观察
取实施例2的‘祥249’转化幼胚、愈伤组织和叶片进行外源基因(GFP)在组织中的表达观察，在荧光下成绿色，说明外源基因成功表达，否则为阴性材料。阴性材料与阳性材料相比，在荧光下较暗淡，幼胚和愈伤组织为黄色、叶为红色。结果见图1A、图1B、图1C。2、PCR检测
(1)DNA提取：用购自天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取试剂盒抽提实施例2获得的T0代转基因玉米基因组DNA。
(2)PCR检测
将下列试剂从-20℃冰箱中取出解冻：10×PCR反应缓冲液(Takara)、dNTPs(10mM,Sigma)、正反向引物溶液(Bar正向引物，5’-CAGGAACCGCAGGAGTGGAC-3’；反向引物，5’-CTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGC-3’)以及玉米叶片DNA为模板；所有试剂解冻完毕后，简短离心数秒，置于冰上待用；配制PCR反应体系的混合液，混匀，简短离心数秒；将混合液分装至200μL规格的PCR管中，再加入1μL模板DNA，对于不同样品分别做好标记以便区分；将PCR反应管放入Thermo9700型PCR扩增仪；选择预设PCR扩增程序，开始运行反应。
PCR反应体系(20μL)：10×PCR反应缓冲液(Takara)2μL，dNTPs(10mM,Sigma)0.5μL，引物Bar正反向混合液(5μM)0.8μL，r-Taq(5U,Takara)0.2μL，玉米叶片DNA模板1μL。
PCR反应程序为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环，最后72℃延伸5分钟。
(3)琼脂糖凝胶电泳检测：
PCR结束后，取5μL PCR产物上样检测。配制1.5％琼脂糖凝胶，150V，电泳25分钟后溴化已啶(EB)中染色10分钟，在紫外凝胶成像系统中拍照。因为Bar基因为转化载体所特有，这样能扩增出Bar基因特异带的转基因植株即为阳性植株，否则即为阴性材料。检测结果如图2。结果说明，本发明从获得的转基因玉米中随机抽取13个编号的植株进行PCR检测，结果均为阳性，显示转化载体中的Bar基因已转入转基因玉米中，说明本发明成功获得了转基因玉米骨干自交系。
3、Southern Blot检测
本发明中选取若干样品，进行Southern杂交。Southern杂交探针标记及杂交与显影采用Roche公司的DIG High Primer DNA Labelingand Detection Starter Kit I。具体实验方法如下：
(1)CTAB法抽提转化植株总基因组DNA
分单株取叶片0.5-1g，放入预冷的研钵中，加入液氮快速将叶片研磨成粉末，倒入2mL离心管中。加入700μL预热至65℃的1.5％CTAB提取液并摇匀，65℃水浴保温30-60min，期间摇动几次；
室温冷却后，加入700μL氯仿，摇匀后，颠倒轻摇10min，室温下8000rpm离心10min；
移上清至另一离心管，加入等体积的沉淀液(异丙醇)，-20℃下沉淀30分钟，室温下8000rpm离心10min；
用700μL75％乙醇漂洗2-3次，风干后溶于50μL TE中-20℃保存备用。
(2)基因组DNA的酶切
选用合适的限制性内切酶酶切转化植株总基因组DNA，酶切反应体系如下：
混匀后37℃酶切10-18h左右，酶切后先取少量进行预电泳检测酶切效果，然后用酶切好的总DNA在1％琼脂糖凝胶中进行低电压(30-40V)电泳过夜，使DNA充分分开。
(3)转膜
将凝胶修整后切去右下角作为标记，浸泡在0.25mol/L HCl至溴酚蓝变黄，蒸馏水洗两次；碱变性液[1.5M NaCl,0.5M NaOH]中变性45min，去离子水漂洗；中和液[1M Tris-HCl(PH7.4),1.5M NaCl]中漂洗30min，更换中和液漂洗15min；置于搭好的转膜台上，用10×SSC作为转膜液，Hybond-N+尼龙膜漂洗于去离子水液面，直至完全湿润，浸入转移缓冲液中；用10×SSC溶液进行毛细管法转移16-20h，将胶上的DNA转移到尼龙膜上。转移结束后，将尼龙膜用2×SSC溶液简单漂洗后，紫外交联仪上交联1min后，室温晾干，用保鲜膜将膜包好，4℃下保存备用。
(4)探针合成及杂交与显影
探针标记：
取1μg或(10ng-3μg)回收的DNA，加灭菌ddH2O至16μl；
PCR仪95℃，10分钟，迅速置于冰上；
加入4μl DIG-High Prime，短暂离心；
37℃PCR仪或水浴1h或过夜(O/N)；
65℃，10分钟或加入2μl0.2mol/L EDTA(pH8.0)以终止反应。
(5)探针效率检测：
将已完成标记的探针，稀释成8个浓度梯度；
每个稀释度各取1μl点于尼龙膜上，120℃下烘30分钟；
将膜放入杂交管，在杂交管中加入20ml马来酸，杂交炉里室温转动2分钟；
倒掉马来酸，加入10ml1×封闭液，室温转动30分钟；
倒掉1×封闭液，加入10ml抗体溶液，室温转动30分钟；
倒掉抗体溶液，加入20ml洗涤液，室温转动15分钟；
倒掉洗涤液，加入10ml检测缓冲液，室温转动2-5分钟；
随后将膜用镊子轻轻取出，放入封口袋，在袋中加入2ml显影液，5-10分钟暗处显影，忌摇动。
显色适时，将膜放于TE或ddH2O中浸泡冲洗。
(6)杂交：
加热杂交液DIG Easy Hyb(10ml/100cm2)，在杂交炉中42℃下预杂交30分钟；
95℃下变性探针(25ng/ml)，5分钟后置于冰上；
将变性探针加入到预先加热的DIG Easy Hyb中(3.5ml/100cm2)，混匀；
倒掉预杂交液，加入变性好的探针；
杂交炉中42℃下杂交4小时至过夜。
(7)洗膜：
倒掉杂交液，然后用2×SSC，0.1％SDS室温下洗涤两次，每次5分钟；最后用0.5×SSC，0.1％SDS，65℃洗涤两次，每次15分钟。
(8)显色：
同探针检测操作。
本实施例选择目的基因GFP上不存在识别位点，并且在插入片段中只具有单一位点的高活性内切酶HindIII处理植物基因组。得到的包含目的基因的植物基因组片段较小，有利于进行后续的转膜等处理。
结果如图3所示，检测样品1、2为同一转基因事件；检测样品3、4为同一转基因事件；其余检测样品5、6、7均为单个转基因事件。检测的5个玉米转基因事件中，有4个为单拷贝植株，1个3拷贝植株。说明目的基因GFP已经成功插入玉米基因组中。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种玉米骨干自交系的转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将玉米骨干自交系的幼胚浸入携带外源基因和Bar标记基因的农杆菌菌液中侵染；
(2)将幼胚移至含有细胞激动素KT的共培养基上培养；
(3)将幼胚移至含有细胞激动素KT的休息培养基上培养；
(4)将幼胚移至选择培养基上培养，选择培养基中含筛选剂双丙氨膦，诱导胚性愈伤组织；再转移到分化培养基上，分化形成再生小苗；
(5)再生小苗在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因玉米。
2.如权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，步骤(1)中玉米骨干自交系的幼胚是从授粉后6-15天，待玉米幼胚长至0.5-2.0mm时从玉米穗上剥取获得。
3.如权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，步骤(1)的侵染时间不超过15min。
4.如权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，步骤(2)中共培养基含KT浓度为0.01-1mg/L。
5.如权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，步骤(2)培养条件为23℃黑暗培养48-96h。
6.如权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，步骤(3)中休息培养基含KT浓度为0.01-1mg/L。
7.如权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，步骤(3)培养条件为26-34℃黑暗培养1-2周。
8.如权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，步骤(4)中选择培养基中双丙氨膦的浓度为0.5-50mg/L。
9.如权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，玉米骨干自交系为‘祥249’。
10.细胞激动素KT在制备转基因植物中的应用。
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