CN108441512A - 一种玉米遗传转化方法 - Google Patents

一种玉米遗传转化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108441512A
CN108441512A CN201810361149.0A CN201810361149A CN108441512A CN 108441512 A CN108441512 A CN 108441512A CN 201810361149 A CN201810361149 A CN 201810361149A CN 108441512 A CN108441512 A CN 108441512A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rataria
culture medium
screening
corn
genetic transformation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810361149.0A
Other languages
English (en)
Inventor
刘寒冬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201810361149.0A priority Critical patent/CN108441512A/zh
Publication of CN108441512A publication Critical patent/CN108441512A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明属于植物遗传转化技术领域，特别提供了一种玉米遗传转化方法，包括如下步骤：制备转化受体、制备侵染液、侵染、共培养、恢复培养、筛选、分化培养，得到玉米的带有潮霉素抗性基因或Bar抗性基因的玉米遗传转化植株。本方法过程简单、操作方便、参数及培养基优化，能够在较短时间内获得高遗传转化率的玉米转基因植株。

Description

一种玉米遗传转化方法
技术领域
本发明属于植物遗传转化技术领域，特别提供了一种玉米遗传转化方法。
背景技术
玉米是重要的粮食、经济、油料作物，同时也是重要的工业作物。随着社会经济的不断发展，人们对玉米的需求也日益增多。遗传转化技术的飞速发展为玉米品种的增多起到了重要的作用，但是目前玉米的遗传转化仍然存在着转化时间长、转化率低的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种玉米遗传转化方法，通过调整过程中的培养基及培养参数，大大缩短了玉米遗传转化的时间，并且提高了遗传转化率。
本发明是这样实现的，一种玉米遗传转化方法，包括如下步骤：
1)制备转化受体
灭菌：授粉7-13d的玉米棒子用70％的乙醇灭菌10min；
去胚乳：使用无菌水清洗幼胚2-5次，洗掉胚乳，获得幼胚的长度在2-4mm；
2)制备侵染液
取50ml Zm-inf，依次加入Cys 130μl、HCl 130μl、AS 100μl、Vc 25μl，将农杆菌挑至混合液中，制成侵染液；
3)侵染
将调好的侵染液加至放有玉米幼胚的瓶中，放置摇床100rpm侵染20min，之后取出置于无菌滤纸上吹20min；
4)共培养
将步骤3)吹至表面无液体的幼胚，接至放置有一张灭菌滤纸Zm-cocu共培养基上，幼胚盾片朝上，暗处培养3天，除去幼胚上长出的芽，保留淡黄色的幼胚；
5)恢复培养
将共培养后的幼胚取出放置于灭菌皿中，观察幼胚是否膨胀大，边缘是否有愈伤，之后将幼胚放入zm-reco培养基中恢复7d；
6)筛选
第一次筛选：选择出无污染、淡黄色的幼胚接入到第一次筛选培养基中筛选7d；
第二次筛选：第一次筛选后，将幼胚转入到第二次筛选培养基中筛选14d，筛选3-5次，直到筛选到胚性愈伤；
7)分化培养
将获得的胚性愈伤接入分化培养基Zm3中光培养，每12～15d循环继代一次，直到玉米新芽长出到3-4cm；
各步骤中用到的培养基具体配方见下表：
上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：
进一步地，所述步骤2)中制备的侵染液OD600＝0.8。
进一步地，选用的农杆菌为EHA105。
进一步地，所述农杆菌携带的抗性基因为潮霉素抗性基因，所述第一次筛选培养基为zm Hn15，第二次筛选培养基为zm Hn30；
上述培养基配方为：
上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：
进一步地，所述农杆菌携带的抗性基因为Bar抗性基因，所述第一次筛选培养基为zm basta5，第二次筛选培养基为zm basta10；
上述培养基配方为：
上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：
与现有技术相比，本发明的优点在于：过程简单、操作方便、参数及培养基优化，能够在较短时间内获得高遗传转化率的玉米转基因植株。
附图说明
图1为利用本发明的方法得到的淡黄色幼胚；
图2为利用本发明的方法得到的恢复培养阶段的转化愈伤；
图3为利用本发明的方法得到的筛选阶段的抗性愈伤；
图4为利用本发明的方法得到的分化初级阶段的抗性愈伤；
图5为利用本发明的方法得到的抗性玉米芽；
图6为利用本发明的方法得到的伸长抗性玉米苗；
图7为利用本发明的方法得到的生根抗性玉米苗。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1、
本发明是这样实现的，一种玉米遗传转化方法，包括如下步骤：
1)制备转化受体
灭菌：授粉7-13d的玉米棒子(齐319)用70％的乙醇灭菌10min；
去胚乳：使用无菌水清洗幼胚2-5次，洗掉胚乳，获得幼胚的长度在2-4mm，参考图1；
2)制备侵染液
取50ml Zm-inf，依次加入Cys 130μl、HCl 130μl、AS 100μl、Vc 25μl，将农杆菌(EHA105，携带的抗性基因为潮霉素抗性基因)挑至混合液中，制成侵染液，OD600＝0.8；
3)侵染
将调好的侵染液加至放有玉米幼胚的瓶中，放置摇床100rpm侵染20min，之后取出置于无菌滤纸上吹20min；
4)共培养
将步骤3)吹至表面无液体的幼胚，接至放置有一张灭菌滤纸Zm-cocu共培养基上，幼胚盾片朝上，暗处培养3天，除去幼胚上长出的芽，保留淡黄色的幼胚；
5)恢复培养
将共培养后的幼胚取出放置于灭菌皿中，观察幼胚是否膨胀大，边缘是否有愈伤，之后将幼胚放入zm-reco培养基中恢复7d，参考图2；
6)筛选
第一次筛选：选择出无污染、淡黄色的幼胚接入到第一次筛选培养基zm Hn15中筛选7d；
第二次筛选：第一次筛选后，将幼胚转入到第二次筛选培养基zm Hn30中筛选14d，筛选3-5次，直到筛选到胚性愈伤，参考图3；
7)分化培养
将获得的胚性愈伤接入分化培养基Zm3中光培养，每12～15d循环继代一次，直到玉米新芽长出到3-4cm，参考图4、图5、图6和图7；
各步骤中用到的培养基具体配方见下表：
上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：
实施例2、
与实施例1不同的地方在于：
农杆菌携带的抗性基因为Bar抗性基因，第一次筛选培养基为zm basta5，第二次筛选培养基为zm basta10；
上述培养基配方为：
上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：

Claims (5)

1.一种玉米遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备转化受体
灭菌：授粉7-13d的玉米棒子用70％的乙醇灭菌10min；
去胚乳：使用无菌水清洗幼胚2-5次，洗掉胚乳，获得幼胚的长度在2-4mm；
2)制备侵染液
取50ml Zm-inf，依次加入Cys 130μl、HCl 130μl、AS 100μl、Vc 25μl，将农杆菌挑至混合液中，制成侵染液；
3)侵染
将调好的侵染液加至放有玉米幼胚的瓶中，放置摇床100rpm侵染20min，之后取出置于无菌滤纸上吹20min；
4)共培养
将步骤3)吹至表面无液体的幼胚，接至放置有一张灭菌滤纸Zm-cocu共培养基上，幼胚盾片朝上，暗处培养3天，除去幼胚上长出的芽，保留淡黄色的幼胚；
5)恢复培养
将共培养后的幼胚取出放置于灭菌皿中，观察幼胚是否膨胀大，边缘是否有愈伤，之后将幼胚放入zm-reco培养基中恢复7d；
6)筛选
第一次筛选：选择出无污染、淡黄色的幼胚接入到第一次筛选培养基中筛选7d；
第二次筛选：第一次筛选后，将幼胚转入到第二次筛选培养基中筛选14d，筛选3-5次，直到筛选到胚性愈伤；
7)分化培养
将获得的胚性愈伤接入分化培养基Zm3中光培养，每12～15d循环继代一次，直到玉米新芽长出到3-4cm；
各步骤中用到的培养基具体配方见下表：
上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：
2.如权利要求1所述的玉米遗传转化方法，其特征在于，所述步骤2)中制备的侵染液OD600＝0.8。
3.如权利要求1所述的玉米遗传转化方法，其特征在于，选用的农杆菌为EHA105。
4.如权利要求1所述的玉米遗传转化方法，其特征在于，所述农杆菌携带的抗性基因为潮霉素抗性基因，所述第一次筛选培养基为zm Hn15，第二次筛选培养基为zm Hn30；
上述培养基配方为：
上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：
5.如权利要求1所述的玉米遗传转化方法，其特征在于，所述农杆菌携带的抗性基因为Bar抗性基因，所述第一次筛选培养基为zm basta5，第二次筛选培养基为zm basta10；
上述培养基配方为：
上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：
CN201810361149.0A 2018-04-20 2018-04-20 一种玉米遗传转化方法 Pending CN108441512A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810361149.0A CN108441512A (zh) 2018-04-20 2018-04-20 一种玉米遗传转化方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810361149.0A CN108441512A (zh) 2018-04-20 2018-04-20 一种玉米遗传转化方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108441512A true CN108441512A (zh) 2018-08-24

Family

ID=63201136

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810361149.0A Pending CN108441512A (zh) 2018-04-20 2018-04-20 一种玉米遗传转化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108441512A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008105508A1 (ja) * 2007-02-28 2008-09-04 Japan Tobacco Inc. ３，６－ジクロロ－ｏ－アニシン酸を含む共存培地で植物組織を培養する共存工程を含む、植物の形質転換効率を上昇させる方法
CN103409460A (zh) * 2013-08-21 2013-11-27 北京大北农科技集团股份有限公司 转化玉米的方法
CN104745622A (zh) * 2013-12-27 2015-07-01 中国种子集团有限公司 一种玉米骨干自交系的高效转基因方法
CN105941163A (zh) * 2016-06-24 2016-09-21 浙江新安化工集团股份有限公司 一种适合作为转化受体的玉米自交系的选育方法
CN106922525A (zh) * 2017-02-20 2017-07-07 中国农业科学院作物科学研究所 一种通过弱光培养体系快速获得转基因植物的方法
CN107022561A (zh) * 2016-01-29 2017-08-08 中国种子集团有限公司 用于培育转基因玉米的培养基及培养方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008105508A1 (ja) * 2007-02-28 2008-09-04 Japan Tobacco Inc. ３，６－ジクロロ－ｏ－アニシン酸を含む共存培地で植物組織を培養する共存工程を含む、植物の形質転換効率を上昇させる方法
CN103409460A (zh) * 2013-08-21 2013-11-27 北京大北农科技集团股份有限公司 转化玉米的方法
CN104745622A (zh) * 2013-12-27 2015-07-01 中国种子集团有限公司 一种玉米骨干自交系的高效转基因方法
CN107022561A (zh) * 2016-01-29 2017-08-08 中国种子集团有限公司 用于培育转基因玉米的培养基及培养方法
CN105941163A (zh) * 2016-06-24 2016-09-21 浙江新安化工集团股份有限公司 一种适合作为转化受体的玉米自交系的选育方法
CN106922525A (zh) * 2017-02-20 2017-07-07 中国农业科学院作物科学研究所 一种通过弱光培养体系快速获得转基因植物的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘纪麟: "《玉米育种学》", 31 January 2002, 中国农业出版社 *
孙传波等: "农杆菌介导玉米遗传转化体系的研究", 《中国农学通报》 *
秦静远: "《植物组织培养技术》", 31 August 2014, 重庆大学出版社 *
袁鹰等: "农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究", 《分子植物育种》 *
魏开发: "农杆菌介导的高效玉米遗传转化体系的建立", 《遗传》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104429952B (zh) 一种培养结球甘蓝游离小孢子高效获得再生植株的方法
CN108849528A (zh) 一种获得假俭草突变体的方法
CN108338073A (zh) 一种辣椒的组织培养方法
CN107750946A (zh) 一种适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法
CN103155854B (zh) 一种胚挽救和离体诱导相结合构建异源多倍体水稻的方法
CN107142277B (zh) 一种高效籼稻遗传转化方法
CN102229950B (zh) 一种快速高效的籼稻转基因方法
CN102239806B (zh) 春石斛兰多倍体复合体的人工培育及种苗工厂化生产方法
CN101906434B (zh) 农杆菌介导法生产大型丛生竹类的方法
CN108546710A (zh) 一种蓖麻遗传转化方法
CN103053423A (zh) 以花椰菜小孢子胚为外植体建立高效再生体系的方法
CN102715085B (zh) 一种诱导红豆杉种子种胚获得愈伤组织和悬浮细胞的方法
CN102067818B (zh) 试管藕诱导方法
CN103988778B (zh) 一种木薯微茎尖培养基及培养方法
CN108441512A (zh) 一种玉米遗传转化方法
CN108486150A (zh) 一种棉花遗传转化方法
CN102668982A (zh) 一粒小麦成熟胚的组织培养方法
CN106801065A (zh) 一种提高棉花再生及转化效率的方法及应用
CN102550404A (zh) 一种梅花叶片愈伤组织高效诱导方法
CN101002540A (zh) 一种高效的黄瓜组培再生及其再生苗移栽成活方法
CN107318656A (zh) 一种马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法
CN112042532B (zh) 一种诱导彩色马蹄莲产生愈伤组织的培养基及其在建立彩色马蹄莲再生体系中的应用
CN108486151A (zh) 一种番茄遗传转化方法
CN108546711A (zh) 一种大豆遗传转化方法
CN102657090A (zh) 一种地黄组培快繁方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180824