CN102550404A - 一种梅花叶片愈伤组织高效诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种梅花叶片愈伤组织诱导方法,其为以真梅系梅花品种胚培养获得的实生苗的幼嫩叶片为外植体,近轴面朝上接入愈伤组织诱导培养基,暗培养2周以上,所述的愈伤组织诱导培养基为MS+蔗糖20~40g/L+2,4-D 0.25~2.00mg/L,pH=5.8~6.0的固体培养基。本发明中建立了梅花叶片愈伤组织高效诱导的培养体系,该体系的建立,能够高效的诱导愈伤组织,使叶片愈伤组织的诱导率可达90%以上,而且愈伤组织的增殖量大。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养领域,具体涉及一种梅花愈伤组织高效诱导的方法。
背景技术
梅花(Prunus mume Sieb.Et Zucc.)是中国的传统名花,品种繁多,种质资源丰富。它原产于我国西南地区及长江流域、珠江流域,以川、滇、藏为中心,在我国有7000年以上的应用史和3000年以上的栽培史。引种栽培过程中,培育出了众多优良的园艺新品种,极大地丰富了我国的园林景观。
梅花从受粉到果实成熟仅要两三个月左右的时间,果实发育时间短,其果实达到成熟时,胚尚未成熟。种子经过砂藏处理,在正常条件下播种萌发率也很低。胚培养技术可以挽救胚败育和发育不良,缩短休眠期,无需沙藏,极大地提高胚的萌发率及成苗率。潘晓等对‘淡丰后’杏梅品种的胚培养做了初步研究,显著提高了种子的成苗率,但观赏价值高的真梅品种在该研究中未有涉及。
愈伤组织一方面可研究植物生长发育及分化的机制、遗传变异规律,对植物遗传育种具有特殊意义;另一方面可用于大规模工厂化生产有用化合物,或用于细胞培养筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系,或用于原生质体培养中的原生质体来源等。实践证明,愈伤组织培养不仅是一种植物快繁的新手段,同时也是植物改良,种质保存和有用化合物生产的理想途径。而木本植物外植体污染率比较高,并且木本植物愈伤组织的诱导具有一定的困难。梅花组织培养研究中,通过叶片进行愈伤组织诱导少见报道,高效的愈伤组织诱导体系更是少人问津。
发明内容
本发明的目的在于提供一种梅花叶片愈伤组织高效诱导方法。
为实现本发明目的,本发明提供了一种梅花叶片愈伤组织诱导方法,其为以真梅系梅花品种胚培养获得的实生苗的幼嫩叶片为外植体,近轴面朝上接入愈伤组织诱导培养基,暗培养2周以上,所述的愈伤组织诱导培养基优选为MS+蔗糖20~40g/L+2,4-D0.25~2.00mg/L,pH=5.8~6.0的固体培养基,更优选为MS+蔗糖20~40g/L+2,4-D0.5~1.5mg/L,pH=5.8~6.0的固体培养基,更优选为MS+蔗糖20~40g/L+2,4-D1.0mg/L,pH=5.8~6.0的固体培养基。
其中,幼嫩叶片在接种前,去掉叶柄,用刀片沿主脉划2~3刀,保证叶缘处相连目的在于使叶片产生更多的伤口,促进愈伤组织的诱导。
其中,所述幼嫩叶片优选为实生苗长至6~8片叶片时,从上往下数第3~4片叶片。
在本发明一个优选的实施方案中,胚培养包括如下步骤:
1)取开花后50~70天未成熟的梅花果实,用0.5~1.5%的高锰酸钾溶液清洗外果皮并浸泡1~2h,之后流水冲洗1~2h;
2)砸碎果实,取出种子,并用流水清洗去掉种皮;
3)将步骤2)去掉种皮的种子用70%的乙醇浸泡20~40s,1%升汞浸泡8~15min,无菌水冲洗至少3次后备用;
4)将步骤3)表面灭菌后的种子保留部分子叶,接种于MS+0.5~1.5mg/L6-BA+0.1~0.3mg/L IBA+蔗糖20~40g/L,pH=5.8~6.0的固体实生苗诱导培养基中,暗培养1~3周后,进行光照培养,光照强度为2000~3000Lx,光照时间为14h/d。
其中,优选的梅花果实为开花后60天未成熟的果实。
其中,优选的固体实生苗诱导培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LIBA+蔗糖20~40g/L,pH=5.8~6.0的固体培养基。
本发明中建立了梅花叶片愈伤组织高效诱导的培养体系,该体系的建立,能够高效的诱导愈伤组织,使叶片愈伤组织的诱导率达90%以上。此外,本发明建立了梅花胚培养体系,实现无菌苗长期保存。用无菌实生苗的幼嫩叶片为外植体,解决了愈伤组织外植体来源的问题。
附图说明
图1所示为梅花胚培养无菌苗植株。
图2所示为梅花叶片愈伤组织诱导结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1梅花外植体的采集及消毒
春季采集真梅系梅花品种‘淡寒红’果实,清水洗净。配制1%的高锰酸钾溶液置于2L的大烧杯中,浸泡清洗外果皮1h,流水冲洗1h直至水澄清为止。用石制研钵轻砸,去掉果肉,轻砸内果皮,取完整饱满的种子,用清水浸泡去掉种皮,胚培养备用。接种时消毒,用70%酒精浸泡种子30s,1%升汞浸泡10min,无菌水冲洗3次,接种备用。
实施例2梅花种子的胚培养
将实施例1灭菌过的种子放在无菌滤纸上,吸干种子表面的水;用镊子将子叶分离,用刀片切割带胚的子叶的下半部分,去掉其中的一片子叶以及另一片子叶的1/2,然后将外植体接种于含有40ml培养基的100ml锥形瓶中,每瓶接种3个外植体,培养基配方为MS+0.5-1.5mg/L 6-BA+0.1-0.3mg/L IBA(见表1),其中添加了浓度30g/L的蔗糖,7g/L的琼脂;将培养瓶置于黑暗条件下,25±3℃培养两周时间,再转入光培养,培养两周。光培养条件为光照强度2000~3000Lx,光照时间14h/d。接种一个月左右即可得到无菌苗。个激素浓度与萌发率结果见表1。
表1不同激素组合对胚培养的影响
注:小写字母表示0.05水平上差异显著;大写字母表示0.01水平上,下同。基本培养基中添加30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂,PH 5.85。
实施例3愈伤组织的诱导
当实施例2中的无菌苗长至6-8片叶时,取从上往下数的第3-4片叶片,沿中脉1/3处横切2-3刀,保持叶缘连接,接种到MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+2,4-D 0~3.0mg/L,pH=5.85(见表2);置于温度25±3℃,暗培养条件下,培养两周时间。
表2植物激素诱导愈伤组织
从表3中可以看出,2,4-D 0.25~3.0mg/L的浓度均能诱导出愈伤组织,但当2,4-D浓度超过1.00mg/L时,愈伤组织较易发生褐化、坏死等现象,当2,4-D浓度超过2.50mg/L时,愈伤组织诱导率降低。综合考虑,2,4-D浓度为0.5~1.50mg/L时,诱导效果较好,最佳的浓度为1.0mg/L。
用上述建立的愈伤组织诱导方法试验另外的真梅系梅花品种,如‘粉瓣’、‘双碧垂枝’等,愈伤组织组织诱导率也均在85%以上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种梅花叶片愈伤组织诱导方法,其为以真梅系梅花品种胚培养获得的实生苗的幼嫩叶片为外植体,近轴面朝上接入愈伤组织诱导培养基,暗培养2周以上,所述的愈伤组织诱导培养基为MS+蔗糖20~40g/L+2,4-D 0.25~2.00mg/L,pH=5.8~6.0的固体培养基。
2.根据权利要求1所述的诱导方法,其特征在于,其中幼嫩叶片在接种前,去掉叶柄,用刀片沿主脉横切2~3刀,保证叶缘处相连。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述幼嫩叶片为实生苗长至6~8片叶片时,从上往下数第3~4片叶片。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,胚培养包括如下步骤:
1)取开花后50~70天未成熟的梅花果实,用0.5~1.5%的高锰酸钾溶液清洗外果皮并浸泡1~2h,之后流水冲洗1~2h;
2)砸碎果实,取出种子,并用流水清洗去掉种皮;
3)将步骤2)去掉种皮的种子用70%的乙醇浸泡20~40s,1%升汞浸泡8~15min,无菌水冲洗至少3次后备用;
4)将步骤3)表面灭菌后的种子保留部分子叶,接种于MS+0.5~1.5mg/L6-BA+0.1~0.3mg/L IBA+蔗糖20~40g/L,pH=5.8~6.0的固体实生苗诱导培养基中,暗培养1~3周后,进行光照培养,光照强度为2000~3000Lx,光照时间为14h/d。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的固体实生苗诱导培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LIBA+蔗糖20~40g/L。
6.根据权利要求1~5任一项所述的方法,其特征在于,所述愈伤组织诱导培养基为MS+蔗糖20~40g/L+2,4-D0.5~1.5mg/L,pH=5.8~6.0的固体培养基。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述愈伤组织诱导培养基为MS+蔗糖20~40g/L+2,4-D1.0mg/L,pH=5.8~6.0的固体培养基。
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