CN106718885A - 一种高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基，按重量份比，包括以下物质：MS培养基90‑120份、母液I18‑28份和纯净水15‑25份；所述母液I溶液包括以下质量‑体积浓度的物质：亚硫酸钾1‑5mg/L、氟苯丙氨酸1‑5mg/L、甲硫基异戊烯基腺苷2‑6mg/L、4‑碘苯氧乙酸3‑7mg/L和噻菌铜2‑6mg/L。本发明可快速诱导梅花愈伤组织形成，防止梅花离体组织培养过程中出现的褐变现象，提高愈伤组织诱导率及愈伤组织的质量，而且愈伤组织的诱导时间短，具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基。
背景技术
梅花，是中国的传统名花，在我国有7000年以上的应用史和3000年以上的栽培史，品种繁多，在引种栽培过程中，培育出了众多优良的园艺新品种，极大地丰富了我国的园林景观。梅花从受粉到果实成熟仅要两三个月左右的时间，果实发育时间短，其果实达到成熟时，胚尚未成熟。种子经过砂藏处理，在正常条件下播种萌发率也很低。愈伤组织培养不仅是一种植物快繁的新手段，同时也是植物改良，种质保存和有用化合物生产的理想途径，梅花为木本植物，其愈伤组织的诱导比较困难，组织培养过程中常出现褐变、菌丝感染及诱导时间长等的问题。
公开号为CN 102550404 A、申请号为201110422216.3的中国专利提供了一种梅花叶片愈伤组织高效诱导方法，该发明中详细介绍了梅花叶片愈伤组织的诱导培养基成分及诱导培养过程，但外植体培养过程往往会出现褐变、菌丝感染等的问题，从而影响愈伤组织的质量及诱导率，该发明出没有提供详细的解决方法。
发明内容
本发明的发明目的是，针对现有技术中没有提供详细方法以解决外植体培养过程出现褐变、菌丝感染等的问题，提供一种能解决褐变及菌丝感染等问题，从而提高梅花叶片愈伤组织的质量及诱导率的方法。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基，按重量份比，包括以下物质：MS培养基90-120份、母液I18-28份和纯净水15-25份；所述母液I溶液包括以下质量-体积浓度的物质：亚硫酸钾1-5mg/L、氟苯丙氨酸1-5mg/L、甲硫基异戊烯基腺苷2-6mg/L、4-碘苯氧乙酸3-7mg/L和噻菌铜2-6mg/L。
在本发明中，进一步的说明，按重量份比，包括以下物质：MS培养基100-110份、母液I20-26份和纯净水17-23份；所述母液I溶液包括以下质量-体积浓度的物质：亚硫酸钾2-4mg/L、氟苯丙氨酸2-4mg/L、甲硫基异戊烯基腺苷3-5mg/L、4-碘苯氧乙酸4-6mg/L和噻菌铜3-5mg/L。
在本发明中，进一步的说明，按重量份比，包括以下物质：MS培养基105份、母液I24份和纯净水19份；所述母液I溶液包括以下质量-体积浓度的物质：亚硫酸钾3mg/L、氟苯丙氨酸3mg/L、甲硫基异戊烯基腺苷3mg/L、4-碘苯氧乙酸5mg/L和噻菌铜4mg/L。
在本发明中，进一步的说明，所述母液I的配制方法如下：先按重量份比称取称取亚硫酸钾、氟苯丙氨酸、甲硫基异戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌铜；接着，将亚硫酸钾、氟苯丙氨酸、甲硫基异戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌铜分别加入部分纯净水中，充分搅拌至上述物质充分溶解，然后放冷至室温，定容至所需溶剂即得母液I。
在本发明中，进一步的说明，所述的高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)按重量份比，称取MS培养基和纯净水，先将纯净水加入锅中，加热使纯净水煮沸后停止加热，接着将MS培养基加入纯净水中，使MS培养基溶解，并充分搅拌、混合均匀，此为体系1；
(2)按重量份比称取母液I，将母液I加入体系1中，不断搅拌使体系1和母液I混合均匀，此为体系2，调节体系2的pH值，此为体系3；
(3)取体系3，用高压蒸汽灭菌18-28min，然后取出，静置冷却凝固后即得培养基。
在本发明中，进一步的发明，所述调节体系2的pH值为5.4-6.4之间。
在本发明中，进一步的说明，所述高压蒸汽灭菌，灭菌压力为170-190KPa。
本发明与现有技术相比较具有的有益效果：
本发明具有促使梅花愈伤组织快速形成，有减少褐变产生及菌丝感染的问题，从而提高梅花叶片愈伤组织的质量及诱导率，研究发现，经使用本发明的培养基进行诱导梅花叶片愈伤组织，诱导时间缩短至6天，诱导率高达98.5％,褐变率仅为1.2％，愈伤组织紧密，颜色浅绿而透明，呈现出很好的状态。
1.在诱导形成愈伤组织的过程中往往会出现褐变现象，褐变的产生会对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡，组织在培养过程中，引起褐变的酶主要有有多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶，通过抑制酶的活性减少酶促褐变途径，减少褐变的产生，亚硫酸钾和氟苯丙氨酸的复配添加可通过分别抑制多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性，可大大减少组培过程中出现的褐变现象，提高愈伤组织的质量，甲硫基异戊烯基腺苷有细胞分裂素的生理功能，可有效促进细胞分裂和扩大作用，并调控其分化，4-碘苯氧乙酸与甲硫基异戊烯基腺苷混合使用可快速高效诱导愈伤组织的形成及分化；而噻菌铜有效解决了菌丝感染导致外植体愈伤组织诱导不成功的问题。
2.MS培养基提供了外植体在诱导愈伤组织的过程中维持生长所需基本的生长因子，而母液I的添加对愈伤组织的形成有高效促进作用和提高愈伤组织的作用。
具体实施方式
本发明提供了一种高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明提供的高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基及其配制方法如下：
一种高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基，按重量份比，包括以下物质：MS培养基90份、母液I18份和纯净水15份；所述母液I溶液包括以下质量-体积浓度的物质：亚硫酸钾1mg/L、氟苯丙氨酸1mg/L、甲硫基异戊烯基腺苷2mg/L、4-碘苯氧乙酸3mg/L和噻菌铜2mg/L。
母液I的配制方法如下：
1.称取亚硫酸钾1mg、氟苯丙氨酸1mg、甲硫基异戊烯基腺苷2mg、4-碘苯氧乙酸3mg和噻菌铜2mg；接着，将亚硫酸钾、氟苯丙氨酸、甲硫基异戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌铜分别加入纯净水中，充分搅拌使亚硫酸氢钙、异戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙环唑完全溶解，然后放冷至室温，定容至所需溶剂即得母液I。
培养基的配制方法如下：
(1)按重量份比，称取MS培养基和纯净水，先将纯净水加入锅中，加热使纯净水煮沸后停止加热，接着将MS培养基加入纯净水中，使MS培养基溶解，并充分搅拌、混合均匀，此为体系1；
(2)按重量份比称取母液I，将母液I加入体系1中，不断搅拌使体系1和母液I混合均匀，此为体系2，调节体系2的pH值为5.4，此为体系3；
(3)取体系3，将体系3以170KPa的灭菌压力进行高压蒸汽灭菌18min，然后取出，静置冷却凝固后即得培养基。
实施例2
本发明提供的高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基及其配制方法如下：
一种高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基，其特征在于，按重量份比，包括以下物质：MS培养基105份、母液I24份和纯净水19份；所述母液I溶液包括以下质量-体积浓度的物质：亚硫酸钾3mg/L、氟苯丙氨酸3mg/L、甲硫基异戊烯基腺苷3mg/L、4-碘苯氧乙酸5mg/L和噻菌铜4mg/L。
母液I的配制方法如下：
2.称取亚硫酸钾3mg、氟苯丙氨酸3mg、甲硫基异戊烯基腺苷3mg、4-碘苯氧乙酸5mg和噻菌铜4mg；接着，将亚硫酸钾、氟苯丙氨酸、甲硫基异戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌铜分别加入纯净水中，充分搅拌使亚硫酸氢钙、异戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙环唑完全溶解，然后放冷至室温，定容至所需溶剂即得母液I。
培养基的配制方法如下：
(1)按重量份比，称取MS培养基和纯净水，先将纯净水加入锅中，加热使纯净水煮沸后停止加热，接着将MS培养基加入纯净水中，使MS培养基溶解，并充分搅拌、混合均匀，此为体系1；
(2)按重量份比称取母液I，将母液I加入体系1中，不断搅拌使体系1和母液I混合均匀，此为体系2，调节体系2的pH值为5.9，此为体系3；
(3)取体系3，将体系3以180KPa的灭菌压力进行高压蒸汽灭菌24min，然后取出，静置冷却凝固后即得培养基。
实施例3
本发明提供的高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基及其配制方法如下：
一种高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基，按重量份比，包括以下物质：MS培养基120份、母液I28份和纯净水25份；所述母液I溶液包括以下质量-体积浓度的物质：亚硫酸钾5mg/L、氟苯丙氨酸5mg/L、甲硫基异戊烯基腺苷6mg/L、4-碘苯氧乙酸7mg/L和噻菌铜6mg/L。
母液I的配制方法如下：
3.称取亚硫酸钾5mg、氟苯丙氨酸5mg、甲硫基异戊烯基腺苷6mg、4-碘苯氧乙酸7mg和噻菌铜6mg；接着，将亚硫酸钾、氟苯丙氨酸、甲硫基异戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌铜分别加入纯净水中，充分搅拌使亚硫酸氢钙、异戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙环唑完全溶解，然后放冷至室温，定容至所需溶剂即得母液I。
培养基的配制方法如下：
(1)按重量份比，称取MS培养基和纯净水，先将纯净水加入锅中，加热使纯净水煮沸后停止加热，接着将MS培养基加入纯净水中，使MS培养基溶解，并充分搅拌、混合均匀，此为体系1；
(2)按重量份比称取母液I，将母液I加入体系1中，不断搅拌使体系1和母液I混合均匀，此为体系2，调节体系2的pH值为6.4，此为体系3；
(3)取体系3，将体系3以190KPa的灭菌压力进行高压蒸汽灭菌28min，然后取出，静置冷却凝固后即得培养基。
实施例4
本发明提供的高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基及其配制方法如下：
一种高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基，按重量份比，包括以下物质：MS培养基100份、母液I20份和纯净水17份；所述母液I溶液包括以下质量-体积浓度的物质：亚硫酸钾2mg/L、氟苯丙氨酸2mg/L、甲硫基异戊烯基腺苷3mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L和噻菌铜3mg/L。
母液I的配制方法如下：
4.称取亚硫酸钾2mg、氟苯丙氨酸2mg、甲硫基异戊烯基腺苷3mg、4-碘苯氧乙酸4mg和噻菌铜3mg；接着，将亚硫酸钾、氟苯丙氨酸、甲硫基异戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌铜分别加入纯净水中，充分搅拌使亚硫酸氢钙、异戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙环唑完全溶解，然后放冷至室温，定容至所需溶剂即得母液I。
培养基的配制方法如下：
(1)按重量份比，称取MS培养基和纯净水，先将纯净水加入锅中，加热使纯净水煮沸后停止加热，接着将MS培养基加入纯净水中，使MS培养基溶解，并充分搅拌、混合均匀，此为体系1；
(2)按重量份比称取母液I，将母液I加入体系1中，不断搅拌使体系1和母液I混合均匀，此为体系2，调节体系2的pH值为5.6，此为体系3；
(3)取体系3，将体系3以175KPa的灭菌压力进行高压蒸汽灭菌20min，然后取出，静置冷却凝固后即得培养基。
实施例5
本发明提供的高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基及其配制方法如下：
一种高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基，按重量份比，包括以下物质：MS培养基110份、母液I26份和纯净水23份；所述母液I溶液包括以下质量-体积浓度的物质：亚硫酸钾4mg/L、氟苯丙氨酸4mg/L、甲硫基异戊烯基腺苷5mg/L、4-碘苯氧乙酸6mg/L和噻菌铜5mg/L。
母液I的配制方法如下：
5.称取亚硫酸钾4mg、氟苯丙氨酸4mg、甲硫基异戊烯基腺苷5mg、4-碘苯氧乙酸6mg和噻菌铜5mg；接着，将亚硫酸钾、氟苯丙氨酸、甲硫基异戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌铜分别加入纯净水中，充分搅拌使亚硫酸氢钙、异戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙环唑完全溶解，然后放冷至室温，定容至所需溶剂即得母液I。
培养基的配制方法如下：
(1)按重量份比，称取MS培养基和纯净水，先将纯净水加入锅中，加热使纯净水煮沸后停止加热，接着将MS培养基加入纯净水中，使MS培养基溶解，并充分搅拌、混合均匀，此为体系1；
(2)按重量份比称取母液I，将母液I加入体系1中，不断搅拌使体系1和母液I混合均匀，此为体系2，调节体系2的pH值为6.2，此为体系3；
(3)取体系3，将体系3以185KPa的灭菌压力进行高压蒸汽灭菌26min，然后取出，静置冷却凝固后即得培养基。
实施例6
本发明提供的高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基及其配制方法如下：
其中，所述母液I由以下质量-体积浓度的物质组成：亚硫酸钾3mg/L、甲硫基异戊烯基腺苷4mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L和噻菌铜2.5mg/L，其余与实施例2相同。
实施例7
本发明提供的高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基及其配制方法如下：
其中，所述母液I由以下质量-体积浓度的物质组成：氟苯丙氨酸3mg/L、甲硫基异戊烯基腺苷4mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L和噻菌铜2.5mg/L，其余与实施例2相同。
实施例8
本发明提供的高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基及其配制方法如下：
其中，所述母液I由以下质量-体积浓度的物质组成：亚硫酸钾3mg/L、氟苯丙氨酸3mg/L、甲硫基异戊烯基腺苷4mg/L和4-碘苯氧乙酸4mg/L，其余与实施例2相同。
实施例9
本发明提供的高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基及其配制方法如下：
其中，所述母液I由以下质量-体积浓度的物质组成：亚硫酸钾3mg/L、氟苯丙氨酸3mg/L、甲硫基异戊烯基腺苷4mg/L和噻菌铜2.5mg/L，其余与实施例2相同。
实施例10
本发明提供的高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基及其配制方法如下：
其中，所述母液I由以下质量-体积浓度的物质组成：亚硫酸钾3mg/L、氟苯丙氨酸3mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L和噻菌铜2.5mg/L，其余与实施例2相同。
试验例:
取幼嫩的梅花叶片，去掉叶柄，用手术刀切割成小片，用刀片沿主脉划3刀，保证叶缘处相连，目的在于使叶片产生更多的伤口，再用镊子将其接种到对应的培养基上，每个瓶接种3片，每组接种30瓶，共接种11组，以上操作在超净台上完成，封好口后置于相同的环境中经行培养，培养至产生愈伤组织，培养条件为：(25±1)℃，暗培养。记录愈伤组织形成时间、愈伤组织的颜色、颗粒散碎度，统计其诱导率和褐变率，结果如下表：
| 试验组 | 形成时间(天) | 诱导率 | 褐变率 | 颗粒散碎度 | 颜色 |
| 实施例1 | 7 | 96.6％ | 1.4％ | 紧密 | 浅绿而透明 |
| 实施例2 | 6 | 98.5％ | 1.2％ | 紧密 | 浅绿而透明 |
| 实施例3 | 7 | 97.2％ | 1.3％ | 紧密 | 浅绿而透明 |
| 实施例4 | 6 | 97.1％ | 1.6％ | 紧密 | 浅绿而透明 |
| 实施例5 | 8 | 95.6％ | 1.7％ | 紧密 | 浅绿而透明 |
| 实施例6 | 7 | 84.3％ | 14％ | 紧密 | 浅绿而透明 |
| 实施例7 | 6 | 82.3％ | 16％ | 紧密 | 浅绿而透明 |
| 实施例8 | 7 | 63.4％ | 1.4％ | 紧密 | 浅绿而透明 |
| 实施例9 | 12 | 88.4％ | 1.3％ | 疏松 | 白色透明 |
| 实施例10 | 13 | 87.3％ | 1.2％ | 疏松 | 白色透明 |
由上表可知，由于实施例1-5使用本发明的培养基进行培养，其诱导时间明显比其他试验组短，诱导率比其他试验组高，褐变率低，颗粒散碎度及颜色都明显优于其他试验组。
实施例6-10为对比例，其中：
实施例6中母液I的成分为：亚硫酸钾、甲硫基异戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌铜；
实施例7中母液I的成分为：氟苯丙氨酸、甲硫基异戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌铜；
实施例8中母液I的成分为：亚硫酸钾、氟苯丙氨酸、甲硫基异戊烯基腺苷和4-碘苯氧乙酸；
实施例9中母液I的成分为：亚硫酸钾、氟苯丙氨酸、甲硫基异戊烯基腺苷和噻菌铜；
实施例10中母液I的成分为：亚硫酸钾、氟苯丙氨酸、4-碘苯氧乙酸和噻菌铜。
分别对比实施例6、实施例7和实施例2的数据，可证实氟苯丙氨酸和亚硫酸钾有缓解组织培养过程中褐变的问题；通过对比实施例8和实施例2的数据，可证实噻菌铜有效解决了菌丝感染从而提高外植体愈伤组织诱导率；通过对比实施9、实施例10和实施例2的数据，可证实甲硫基异戊烯基腺苷和4-碘苯氧乙酸混合使用可加快愈伤组织形成。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (7)
1.一种高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基，其特征在于，按重量份比，包括以下物质：MS培养基90-120份、母液I 18-28份和纯净水15-25份；所述母液I溶液包括以下质量-体积浓度的物质：亚硫酸钾1-5mg/L、氟苯丙氨酸1-5mg/L、甲硫基异戊烯基腺苷2-6mg/L、4-碘苯氧乙酸3-7mg/L和噻菌铜2-6mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基，其特征在于，按重量份比，包括以下物质：MS培养基100-110份、母液I20-26份和纯净水17-23份；所述母液I溶液包括以下质量-体积浓度的物质：亚硫酸钾2-4mg/L、氟苯丙氨酸2-4mg/L、甲硫基异戊烯基腺苷3-5mg/L、4-碘苯氧乙酸4-6mg/L和噻菌铜3-5mg/L。
3.根据权利要求1所述的一种高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基，其特征在于，按重量份比，包括以下物质：MS培养基105份、母液I24份和纯净水19份；所述母液I溶液包括以下质量-体积浓度的物质：亚硫酸钾3mg/L、氟苯丙氨酸3mg/L、甲硫基异戊烯基腺苷3mg/L、4-碘苯氧乙酸5mg/L和噻菌铜4mg/L。
4.根据权利要求1-3所述的一种高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基，其特征在于，所述母液I的配制方法如下：先按重量份比称取称取亚硫酸钾、氟苯丙氨酸、甲硫基异戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌铜；接着，将亚硫酸钾、氟苯丙氨酸、甲硫基异戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌铜分别加入部分纯净水中，充分搅拌至上述物质充分溶解，然后放冷至室温，定容至所需溶剂即得母液I。
5.一种制备权利要求1-3所述高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按重量份比，称取MS培养基和纯净水，先将纯净水加入锅中，加热使纯净水煮沸后停止加热，接着将MS培养基加入纯净水中，使MS培养基溶解，并充分搅拌、混合均匀，此为体系1；
(2)按重量份比称取母液I，将母液I加入体系1中，不断搅拌使体系1和母液I混合均匀，此为体系2，调节体系2的pH值，此为体系3；
(3)取体系3，用高压蒸汽灭菌18-28min，然后取出，静置冷却凝固后即得培养基。
6.根据权利要求5所述的一种高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基的方法，其特征在于：所述调节体系2的pH值为5.4-6.4之间。
7.根据权利要求5所述的一种高效快速诱导梅花愈伤组织形成的培养基的方法，其特征在于：所述高压蒸汽灭菌，灭菌压力为170-190KPa。
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