CN104620992A - 狐狸尾兰侧芽诱导培养基及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种狐狸尾兰侧芽诱导培养基及其培养方法，该狐狸尾兰侧芽诱导培养基，是以改良MS培养基为基础培养基，并添加有异戊烯腺嘌呤、吲哚丁酸、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂粉和白砂糖。本发明的狐狸尾兰侧芽诱导培养基能够促进狐狸尾兰侧芽的生长发育，缩短诱导时间，减少褐化现象，提高狐狸尾兰侧芽的诱导成活率。

Description

狐狸尾兰侧芽诱导培养基及培养方法

技术领域

本发明涉及兰花组织培养技术领域，特别是涉及一种狐狸尾兰侧芽诱导培养基及培养方法。

背景技术

狐狸尾兰(Rhynchostylis)是兰科钻喙兰属的多年生草本植物，分布于亚洲热带地区，是典型的热带附生兰，在我国分布有2种，是野生兰花优良种质资源之一。狐狸尾兰叶片肥厚翠绿，花姿或妩媚、或清隽，花朵多而密集，生长期适温约20～28℃，开花期为我国传统春节前后，是极好的新春贺岁花卉，颇受广大群众亲睐。

由于狐狸尾兰每年仅开花1次，且种子在自然条件下极难萌发，目前，狐狸尾兰的养殖以扦插分株繁殖或组织培养播种繁殖为主。扦插分株繁殖，只要将长有气生根的茎段连同顶芽一起剪下，即可另外种植成一株，而原株顶芽被剪下后，又会在叶腋处分化长出侧芽，但分株繁殖法亦存在繁殖周期长、繁殖率低、量化生产进程缓慢等缺陷。组织培养播种繁殖法是兰花种植行业的常用方法，然而，狐狸尾兰人工授粉结果后，因种子量极少，经常出现没有种子的空果荚，播种发芽率偏低，而且原球茎发育的芽体大小不齐、实生苗成品花的花色、苗株大小质量参差不齐，远不能满足市场需求。

发明内容

基于此，本发明的目的在于，提供一种狐狸尾兰侧芽诱导培养基，其能够促进狐狸尾兰侧芽的生长发育，并具有诱导时间短、褐化率低、诱导成活率高的优点。

本发明的另一个目的在于，提供一种狐狸尾兰侧芽诱导培养方法，其以狐狸尾兰侧芽作为外植体，采用本发明的狐狸尾兰侧芽诱导培养基进行培养，具有诱导时间短、褐化率低、诱导成活率高的优点，实现狐狸尾兰的快速繁殖。

一种狐狸尾兰侧芽诱导培养基，其以改良MS培养基为基础培养基，并添加有异戊烯腺嘌呤、吲哚丁酸、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂粉和白砂糖。

在其中一个实施例中，所述改良MS培养基中的有机成分为肌醇100mg/L、烟酸1mg/L、维生素B61mg/L、维生素B110mg/L。

在其中一个实施例中，异戊烯腺嘌呤的浓度为2～8mg/L，吲哚丁酸的浓度为0.1～0.5mg/L，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0.5～1.0g/L，琼脂粉的浓度为6～7g/L，白砂糖的浓度为25～30g/L。

在其中一个实施例中，异戊烯腺嘌呤的浓度为6mg/L，吲哚丁酸的浓度为0.3mg/L，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0.8g/L，琼脂粉的浓度为6g/L，白砂糖的浓度为30g/L。

在其中一个实施例中，所述狐狸尾兰侧芽诱导培养基的pH值为5.5～6.0。

一种狐狸尾兰侧芽诱导培养方法，包括以下步骤：取健壮的狐狸尾兰侧芽作为外植体，经灭菌处理后，接种到本发明所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养基中；在温度为25～28℃下，于暗培养条件下培养7～10天，然后于光暗周期为12h光照/12h黑暗、光照强度为1900～2200lux的条件下培养40～50天，得到狐狸尾兰丛生芽。

在其中一个实施例中，所述的灭菌处理包括以下步骤：取外植体，用质量浓度为70～75％的酒精浸泡25～30秒，用无菌水冲洗干净后，置于质量浓度为0.10～0.12％的氯化汞溶液中灭菌5～7分钟，再用无菌水冲洗干净。

在其中一个实施例中，所述的狐狸尾兰侧芽为经过扦插、去除顶芽后，在原株叶腋处萌发的侧芽。

本发明对现有的狐狸尾兰组织培养方法进行改进，以狐狸尾兰侧芽作为外植体，研发出能够促进狐狸尾兰侧芽生长发育的诱导培养基，解决了狐狸尾兰侧芽难以萌动、分化出丛生芽的问题，并具有诱导时间短、褐化率低、诱导成活率高等优点，能够实现狐狸尾兰的快速繁殖，并能保持狐狸尾兰特性的一致性，克服了现有狐狸尾兰组织培养方法的缺陷。

本发明所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养基，采用改良的MS培养基，其有机成分中不含甘氨酸，并提高了烟酸、维生素B6和维生素B1的含量，其中维生素B1的含量由0.1mg/L大大提高至10mg/L。MS培养基中不添加甘氨酸，能够避免了有机胺对狐狸尾兰侧芽诱导的不良影响；通过提高烟酸、维生素B6和维生素B1的浓度，能够为狐狸尾兰侧芽的细胞和组织生长提供必须的维生素，还能其加快新陈代谢，促进侧芽萌动，促进芽体生长发育，使侧芽诱导出的新芽长势更健壮。同时，烟酸、维生素B6和维生素B1的浓度需控制在合适的用量限度内，若其浓度过高，会造成诱导出的丛生芽数量少，且新芽容易徒长，降低诱导成功率。

本发明所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养基中，异戊烯腺嘌呤(2-IP)对蛋白质合成、酶活性及细胞代谢平衡具有调节作用，能够促进细胞分裂、分化，促进生长活跃部位的生长发育，缩短诱导时间，还能提高抗氧化酶的活性，减少褐化现象，提高侧芽诱导成活率；吲哚丁酸(IBA)是内源性植物生长素，能够促进细胞生长，加快繁殖速度；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂，能够有效吸附侧芽产生的酚类氧化底物，从而抑制褐化，提高侧芽诱导成活率；琼脂为固体培养平台，为植物提供养分、水分与透气的作用；而白砂糖为碳源，在诱导时间、诱导率和小芽健壮度不受影响的前提下，可降低培养基的制备成本。

本发明所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养基中，异戊烯腺嘌呤与吲哚丁酸具有协同作用，两者联合使用，在细胞分裂、分化、生长等方面同时促进植物组织生长，能够明显地缩短诱导出芽时间，提高侧芽诱导成功率；此外，异戊烯腺嘌呤能够提高侧芽中抗氧化酶的活性，抑制酚类物质的氧化，其与聚乙烯吡咯烷酮联合使用，能够减少氧化底物同时提高植物抗氧化能力，从而有效抑制褐化，降低褐化率，提高侧芽诱导成功率。

本发明所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养基中，异戊烯腺嘌呤的浓度优选为2～8mg/L，若其浓度过低，侧芽诱导率低甚至难以诱导出芽，若其浓度过高，则诱导出的芽容易出现变异；吲哚丁酸的浓度优选为0.1～0.5mg/L，若其浓度过低，侧芽萌发时间长、萌发率低，若其浓度过高，则会抑制芽的诱导及生长；聚乙烯吡咯烷酮的浓度优选为0.5～1.0g/L，若其浓度过低，不能充分吸附酚类物质，褐化抑制效果差；当其浓度高于1.0g/L时，褐化抑制效果无明显提升。

本发明所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养方法，以狐狸尾兰侧芽作为外植体，采用本发明所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养基进行培养，能够缩短诱导时间，提高诱导成活率，实现狐狸尾兰的快速繁殖。

本发明所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养方法中，采用经过扦插、去除顶芽后，在原株叶腋处萌发的侧芽作为外植体，可减少对母株的损伤，不会破坏母株的观赏价值，且通过侧芽直接诱导成丛生芽，还能使母株的优良性状得到稳定遗传。

具体实施方式

实施例一：制备本发明所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养基

根据表1、表2所示的配方，分别称取改良MS培养基以及本发明所述狐狸尾兰侧芽诱导培养基的各成分，置于三角瓶中，加入适量蒸馏水，搅拌溶解，定容至1L，调pH值至6.0，然后分装至组织培养瓶中，封口后置于高压灭菌锅中，在121℃下灭菌20分钟，冷却凝固后，得到本发明所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养基。

表1本发明的改良MS培养基的成分及其用量

表2本发明的狐狸尾兰侧芽诱导培养基的成分及其用量

成分	终浓度
		改良MS培养基	-
异戊烯腺嘌呤(2-IP)	6mg/L
		吲哚丁酸(IBA)	0.3mg/L
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)	0.8g/L
		琼脂粉	6g/L
白砂糖	30g/L

实施例二：狐狸尾兰侧芽诱导培养方法

取狐狸尾兰植株经过扦插、去除顶芽后，在原株叶腋处萌发的健壮侧芽作为外植体，用质量浓度为70～75％的酒精浸泡25～30秒，用无菌水冲洗干净后，置于质量浓度为0.10～0.12％的氯化汞溶液中灭菌5～7分钟，再用无菌水冲洗干净。

在超净工作台中，将经过灭菌处理后的狐狸尾兰侧芽接种到实施例一制备的狐狸尾兰侧芽诱导培养基中，在温度为25～28℃下，于暗培养条件下培养7天，然后于光暗周期为12h光照/12h黑暗、光照强度为1900～2200lux的条件下培养45天，得到狐狸尾兰丛生芽。

实施例三：狐狸尾兰侧芽诱导培养基的效果试验

参照实施例二所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养方法，分别将狐狸尾兰外植体接种于表3所示的培养基中，诱导培养45天后，分别记录狐狸尾兰外植体的褐化率、诱导率、诱导时间及小芽健壮度，结果如表4所示。

表3狐狸尾兰侧芽诱导培养基

表4狐狸尾兰侧芽诱导培养基的试验结果

备注：(1)综合评分y＝a*0.8-b*0.3-c*0.2。

(2)小芽健壮度的指标：“-”代表没有小芽；“+”代表小芽数量少，芽细弱，生长缓慢；“++”代表小芽数量较少，芽体较小，生长较慢；“+++”代表小芽数量较多，芽体健壮，叶色青绿。

由对照组1与试验组8的结果对比可见，采用本发明的改良MS培养基，更有利于狐狸尾兰侧芽诱导出新芽，能够缩短诱导时间，提高诱导率。

由对照组2～4与试验组8的结果对比可见，异戊烯腺嘌呤、吲哚丁酸和聚乙烯吡咯烷酮均对狐狸尾兰侧芽的诱导具有显著的促进作用；其中，异戊烯腺嘌呤的作用不可或缺，对照组2中由于缺少异戊烯腺嘌呤，侧芽完全不能诱导出新芽，且褐化率最高；聚乙烯吡咯烷酮对抑制褐化亦有不可或缺的作用，对照组4中由于缺少聚乙烯吡咯烷酮，大量酚类物质积累，所有试验样品褐化严重，仅有少量样品萌发，但均因为褐化严重而死亡。

上述试验结果表明，异戊烯腺嘌呤、吲哚丁酸和聚乙烯吡咯烷酮之间存在相互协同促进作用。当培养基只含吲哚丁酸而不含异戊烯腺嘌呤时，诱导率为0；当培养基只含异戊烯腺嘌呤而不含吲哚丁酸时，诱导率仅为59％；当培养基同时含有异戊烯腺嘌呤和吲哚丁酸时，诱导率显著提升至86％，且诱导时间亦显著缩短了。当培养基只含异戊烯腺嘌呤而不含聚乙烯吡咯烷酮时，褐化率为100％；当培养基只含聚乙烯吡咯烷酮而不含异戊烯腺嘌呤时，褐化率也高达29％；当培养基同时含有异戊烯腺嘌呤和聚乙烯吡咯烷酮时，褐化率能显著降低至8％。

由试验组1～12的结果可见，在一定浓度范围内，随着异戊烯腺嘌呤、吲哚丁酸和聚乙烯吡咯烷酮的用量增大，狐狸尾兰侧芽的诱导时间缩短、诱导率提高、褐化率降低，而当异戊烯腺嘌呤的浓度为6mg/L、吲哚丁酸的浓度为0.3mg/L、聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0.8g/L时，具有最佳的诱导效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种狐狸尾兰侧芽诱导培养基，其特征在于：以改良MS培养基为基础培养基，并添加有异戊烯腺嘌呤、吲哚丁酸、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂粉和白砂糖。

2.根据权利要求1所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养基，其特征在于：所述改良MS培养基中的有机成分为肌醇100mg/L、烟酸1mg/L、维生素B61mg/L、维生素B110mg/L。

3.根据权利要求1或2所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养基，其特征在于：异戊烯腺嘌呤的浓度为2～8mg/L，吲哚丁酸的浓度为0.1～0.5mg/L，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0.5～1.0g/L，琼脂粉的浓度为6～7g/L，白砂糖的浓度为25～30g/L。

4.根据权利要求3所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养基，其特征在于：异戊烯腺嘌呤的浓度为6mg/L，吲哚丁酸的浓度为0.3mg/L，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0.8g/L，琼脂粉的浓度为6g/L，白砂糖的浓度为30g/L。

5.根据权利要求1所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养基，其特征在于：所述狐狸尾兰侧芽诱导培养基的pH值为5.5～6.0。

6.一种狐狸尾兰侧芽诱导培养方法，包括以下步骤：取健壮的狐狸尾兰侧芽作为外植体，经灭菌处理后，接种到权利要求1所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养基中；在温度为25～28℃下，于暗培养条件下培养7～10天，然后于光暗周期为12h光照/12h黑暗、光照强度为1900～2200lux的条件下培养40～50天，得到狐狸尾兰丛生芽。

7.根据权利要求6所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养方法，其特征在于，所述的灭菌处理包括以下步骤：取外植体，用质量浓度为70～75％的酒精浸泡25～30秒，用无菌水冲洗干净后，置于质量浓度为0.10～0.12％的氯化汞溶液中灭菌5～7分钟，再用无菌水冲洗干净。

8.根据权利要求6所述的狐狸尾兰侧芽诱导培养方法，其特征在于：所述的狐狸尾兰侧芽为经过扦插、去除顶芽后，在原株叶腋处萌发的侧芽。