CN101147466A - 一种微型姜苗组培快繁培养基及组培快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种微型姜苗组培快繁培养基，它是每升基本培养基MS中还含有下列重量的物质：80－110g蔗糖、0.0030－0.0042g多效唑、6.8－7.2g琼脂，pH为5.7－5.9。本发明还提供了一种微型姜苗组培快繁的方法，将继代姜苗去除上部叶鞘和大部分根部，留约1～2cm根茎部为外殖体接种于上述培养基中进行组培。通过使用本发明的培养基，可以使茎尖组织培养一次成苗和微型姜形成，简化了微型姜苗生产程序。通过微型姜苗组培快繁方法可提高种姜繁殖效率，缩短生产周期，降低生产成本。还可为姜种质资源安全保存及资源高效分发利用提供技术保障。

Description

一种微型姜苗组培快繁培养基及组培快繁方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说本发明是一种微型姜苗组培快繁培养基及组培快繁方法。

背景技术

姜(Zingiber offficinale Roc.)为姜科、姜属能形成地下肉质根状茎的栽培种，其肉质根状茎是人们日常生活中的重要调味蔬菜。中国是生姜的主要栽培国，2004年全世界姜收获面积33.9万公顷，我国栽培面积为2.32万公顷。姜在我国栽培面积逐年扩大，已经成为我国重要的出口创汇蔬菜。

传统的姜生产以地下肉质根状茎进行无性繁殖，这种方式的繁殖系数很低，每666.7m²需要种姜250-300公斤，而且长途运输困难，保存和运输还需要很多的人力和物力投入，成本很高。同时在田间生长及种姜保存的过程中，受多种病虫害危害，使姜的产量下降，品质降低，抗逆性下降。这些是姜生产和种质资源利用中面临的重要问题。

茎尖培养和快速繁殖技术是解决上述问题的重要途径。在蔬菜中，马铃薯试管薯的诱导技术已经非常成熟，大蒜、百合等蔬菜在组织培养器皿中可以直接由组培苗诱导形成鳞茎、球茎，例如：中国发明专利“一种大蒜脱毒种苗快速繁殖的方法”(申请号：99114259.4)，公开号：CN1238122，公开日：1999-12-15；中国发明专利  “兰州百合的快速繁殖方法”(申请号：03135142.5)，公开号：CN1460409、公开日：2003-12-10。

同样以根茎进行无性繁殖的姜，也可能基于组织培养及相关的诱导技术，建立微型姜诱导体系。这样以加快优质种姜繁殖，缩短生长周期，形成工厂化生产。同时，离体保存作为种质资源圃活体保存的替代技术，是保持无性繁殖种质资源多样性的重要保证，已成为资源研究领域的重要课题和研究热点。

现有姜组织培养和快繁技术研究主要是基于MS培养基中的6-BA、NAA、KT等植物激素的浓度及配比调整，如文献1：黄菊辉，生姜种质资源的离体繁殖和保存，中国农业科学，1995，28(2)：24-30；文献2：张玲，马林，李卫锋，生姜组织培养的快繁技术，山地农业生物学报，2003，22(2)：173-175；文献3：郑永强，刘艳梅，徐坤，生姜试管苗根状茎诱导研究，山东农业大学学报(自然科学版)，2004，35(1)：39-42；文献4：陈发兴，陈源，赖钟雄，生姜组织培养快繁的影响因子，第二届全国植物组织培养、脱毒快繁及工厂化生产学术研讨会论文集，2004，134-137；文献5：RishiK.Tyagi，Anuradha Agrawal，kkara Yusuf.Conservation of Zingiber germplasmthrough in vitro rhizome formation.Scientia Horticulturae.2006，108(2)：210～219；文献6：T.R.Sharma，B.M.Singh.High-frequency invitro multiplication of disease-free Zingiber officinale Rosc.Plant CellReports.1997，17(7)：68～72；文献7：S.M.Balachandran1，S.R.Bhat1 and K.P.S.Chandel1.In vitro clonal multiplication of turmeric(Curcuma spp.)and ginger(Zingiber officinale Rosc.).Plant CellReports.1990，8(9)：521～524。这些研究为姜的组织培养和微型姜的形成奠定了一定基础，但大都需要经过诱导愈伤组织，然后诱导芽的分化，最后生根成苗等复杂的过程。而且在相关报道中，研究结果不尽相同，姜的增殖率普遍较低，所形成的组织苗不健壮，而且，技术要求高，折算生产成本高，较难满足工厂化生产和设备简易的要求。

PP₃₃₃，又名多效唑，属于三唑类化合物，是英国帝国有限公司(ICI)于上世纪七十年代末期推出的一种新型高效低毒的植物生长延缓剂和广谱性杀菌剂。我国于80年代开始开发利用，在多种果树、蔬菜和粮食作物生产上广泛应用，具有控苗促壮、控梢增花保果、增叶增产等作用。实践中PP₃₃₃也被应用于某些果树和花卉的组织培养中。如文献8：吴坤用，叶面施用PP₃₃₃对抑制沙田柚春梢生长的效应，广东农业科学，1993，2，31-32；如文献9：马国华等，多效唑在唐菖蒲组织培养中的作用，园艺学报，1994，21(3)：288-292。PP₃₃₃的特殊作用机理，使其在试管苗扩繁过程中，在促进苗的矮化和健壮上有可喜的前景，例如：中国发明专利“一种半夏离体块茎的高效诱导方法”(专申请号：200510049742.4)，公开号：CN1701660，公开日：2005-11-30；中国发明专利“一种金苞花组培快繁培养基及组培快繁方法(专申请号：03132364.2)，公开号：CN1513300，公开日：2004-07-21；中国发明专利  “魔芋试管芋的繁育技术”(专申请号：03135572.2)，公开号：CN1493186，公开日：2004-05-05。PP₃₃₃在生姜组织培养快繁中的应用研究也有初步报道。结果表明PP₃₃₃同时促进试管苗增殖与壮苗。如文献10：陈传红，余志坚，李荣同，包永明，多效唑在生姜组织中的应用研究，长江蔬菜，2006(1)：43～44，虽然得到了一定试验性的结果，但研究侧重点仍在组培苗的分化上，实验中仍然采用了多种激素配合使用，加大了试验的复杂性和生产成本。

从总体结果上，现有研究仍然存在以下关健性问题：一是试管姜苗生产效率低，形成的试管姜苗不健壮；二是形成的微型姜体积较小；三是组织培养方法复杂；四是生产成本高，不利于工厂化生产。总之，现有姜组织培养和微型姜生产技术的研究是非常初步的，尚没有从根本上解决微型姜苗生产中的高效、快速、简易、低成本等问题。

本发明在前人研究的基础上，改进和完善了相关的离体快繁技术，对培养基中的植物激素成份进行了调整和简化。从现有报道的文献中选择了试验结果较好的培养基，与本发明筛选得到的培养基在相同培养条件下、相同时间内对芽的分化率、微型姜苗的生产率和健壮程度进行了对比试验。结果发现，在现有报道的方法中，微型姜的增殖率远小于本发明，微型姜苗健壮程度远低于本发明的微型姜苗(相关结果说明见实验例)。本发明筛选出的培养基及快繁方法，大大提高了微型姜扩繁的效率和健壮程度，而且生产成本远小于现有报道的方法。

本发明不仅可在生姜组织培养快繁和工厂化种苗生产中应用，还可用于姜种质资源离体保存，大大提高种质资源的分发和利用效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产效率高、成本低的微型姜苗组培快繁培养基，它是每升基本培养基MS(Marashige & Skoog培养基，简称MS)中还含有下列重量的物质：80-110g蔗糖、0.0030-0.0042g多效唑(PP₃₃₃)、6.8-7.2g琼脂，pH为5.7-5.9。

更优的是，每升基本培养基MS中还含有下列重量的物质：100g蔗糖、0.0040g多效唑、7.0g琼脂，pH为5.8。

上述培养基可在微型姜苗组培快繁中应用。

本发明的目的还在于提供了一种微型姜苗组培快繁的方法，包括如下步骤：

a.在无菌条件下，将继代姜苗去除上部叶鞘和大部分根部，留1-2cm根茎部为外殖体；

b.在无菌条件下，将步骤a所述的外殖体接种于含有60ml上述培养基的封口玻璃瓶中，在温度23-26℃，相对湿度70-80％，控制光照时间为11-14h/d，光照强度1800-3000Lux的无菌培养室中培养60天-110天，获得微型姜苗(茎基部膨大的组培苗)。

步骤a所述外殖体在无菌环境内进行消毒，先倒入70％酒精至浸没材料，振荡30-60sec后，将酒精倒出，无菌水冲洗1-2遍，再倒入0.2％的升汞(HgCl₂)溶液振荡灭菌8-10min，用无菌水洗涤5-7遍。

上述方法还包括步骤c：将玻璃瓶移入温室中，温度20-30℃，遮阳网遮阳，20-26h后掀去玻璃瓶封口膜，炼苗6-8天，移入装有灭菌蛭石的营养钵中，及时喷水保湿，待返苗后，每两天浇1/4Hoagland营养液一次，以浇透为止，10-12天后转移到大田，正常田间管理。

所述的培养60-80天的微型姜苗，作为继代姜苗，应用上述微型姜苗组培快繁方法，循环继代增殖。

本发明快繁方法中所用的继代姜苗可以是在MS+6-BA(2mg/L)+NAA(0.7mg/L)+蔗糖(3％)+琼脂(6.8g/L)，pH5.8培养基中，初代培养90天后，再继代培养生产的继代姜苗或循环继代姜苗，或本发明快繁方法步骤b中培养60-80天的微型姜苗，也可以是市售的组培姜苗。

通过微型姜苗组培快繁方法加快优质种姜繁殖，缩短生产周期，降低生产成本。从而解决优异种源在田间繁殖系数低、工作烦琐的问题，为种源的工厂化生产提供科学方法；为姜种质资源安全保存及资源高效分发利用提供技术保障。本发明的快繁方法，大大增加微型姜繁殖系数和单株根茎重，同时提高微型姜苗的健壮程度。

本发明的植物组培快繁培养基及植物快速繁育方法与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

1、植物组培快繁培养基具有的优点：

本发明所述植物组培快繁培养基，只在基本培养基MS中加入一种植物激素PP₃₃₃，无需与其他激素配比。与其他植物激素相比，本发明使用的PP₃₃₃，从价格上远远低于其他激素，尤其是使用PP₃₃₃的可湿性粉剂，价格更低，从而大大降低了微型姜的生产成本。通过使用本发明的培养基，可以使茎尖组织培养一次成苗和形成微型姜，简化以往的通过诱导芽分化和诱导生根两步成苗的复杂过程，从而简化了微型姜苗生产程序，大大提高了生产效率，降低了生产成本。

2、植物组培快繁方法具有的有益效果：

(1)通过本发明方法，大大有效地提高了微型姜苗的快繁效率。

接种60天时，平均每个外殖体分化微型姜苗15.4±1.16个，按每周年继代5次计算，理论上可生产微型姜苗50万株。与其他植物激素相比明显提高了微型姜苗的增殖系数。与现有技术中的最优激素配方相比较，其繁殖系数得到了明显提高。

(2)与现有技术的方法相比较，本发明获得的微型姜苗健壮程度有了显著的提高。

培养60天后，直至110天前，微型姜苗生长健壮，地上和地下部生长协调，移入大田15天后的成活率为90-95％以上。

(3)本发明的方法大大缩减了微型姜苗生产的成本。

本发明快繁方法中所用的培养基只使用PP₃₃₃一种植物激素，且PP₃₃₃从价格上远远低于其他激素，尤其是使用可湿性粉剂价格更低，从而大大降低了微型姜苗的生产成本。

(4)本发明的方法简易，更易应用于生产。

本发明快繁方法中所用的培养基中所加入的植物激素PP₃₃₃，具有控促根的作用。简化以往的通过诱导芽分化和诱导生根两步成苗的复杂过程。

(5)可用于姜种质资源的保存和扩繁，在有效保存种质的同时，增加种质资源的繁殖量，可有效提高种质资源分发和利用效率。

培养110天时，单个继代苗分化的有效微型姜苗数为21.69±0.48个，微型姜苗株高平均为4.45±0.08cm、植株生长健壮，地上和地下部生长协调，有效地抑制微型姜苗过快生长，大大减少离体保存姜种质时每年的继代次数。

(6)与现有技术相比，该微型姜苗快繁方法可解决生姜生产和种质保存中的其它关键问题。

微型姜苗快繁方法，可防止多代无性繁殖种性退化及病毒感染，保证种源的优良性和遗传稳定性，促进高产、稳产。解决传统姜种质资源保存方法所面临的问题(如通过窑贮藏种姜，易腐烂，所需空间大，种源易退化)，对于保存珍贵、稀有、濒临灭绝的资源有着重要的意义。并能为姜生产和种质资源的交换提供足够的种源。同时，形成的微型姜苗在贮存和运输过程中极大的节省了空间，节约运输成本。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1植物组培快繁培养基

每升基本培养基MS中，加入100g蔗糖、0.0040g多效唑、7.0g琼脂，调节pH为5.8，加蒸馏水配制培养基。

实施例2微型姜苗的组培快繁

晴天在草坪上翻晒种姜一天，以散去包装箱体内的温度和种姜表面的水分。放入有孔的纸箱子中，在20℃左右的温度下贮存备用。在约10cm高的塑料筐的底部依次铺上一层塑料薄膜、两层纱布，然后将种姜平放在纱布上，喷水适量，再在种姜上依次盖上两层纱布，一层塑料薄膜，保湿，置于20-25℃的室内发芽。

冲洗干净发芽姜块表面的泥土，将发出的芽带姜奶头一并切下，放入小篮，流水冲洗15-20min。将洗干净的姜芽取出放至广口瓶中，在超净工作台无菌环境内进行消毒。先倒入70％酒精至浸没材料，轻轻振荡30-60sec后，将酒精迅速倒出，无菌水冲洗1-2遍。再倒入0.2％的升汞(HgCl₂)溶液振荡灭菌8-10min，用无菌水洗涤5-7遍。切取茎尖约1mm大小的生长点作为外殖体。

将外殖体在无菌条件下接种于培养基MS+6-BA(2mg/L)+NAA(0.7mg/L)+蔗糖(3％)+琼脂(6.8g/L)中，pH5.8，每瓶二个外殖体。初代培养90天左右形成初代组织苗，经继代培养循环生产出继代姜苗。

在超净工作台上，将继代姜苗去除上部叶鞘和大部分根部，留平均1.5cm根茎部为外殖体。在超净工作台无菌环境内进行消毒。先倒入70％酒精至浸没材料，轻轻振荡40sec后，将酒精迅速倒出，无菌水冲洗2遍，再倒入0.2％的升汞(HgCl₂)溶液振荡灭菌10min，用无菌水洗涤6遍。将消毒后的外殖体接种于含有60ml实施例1配制所得培养基的三角瓶中，每个三角瓶均匀接种3块，用封口膜封口，将三角瓶放于温度25℃，平均相对湿度为75％，控制光照时间为12h/d，光照强度2000Lux的无菌培养室中培养。

培养60天时，每接种块可获得有效小微型姜苗15.4±1.16株左右，每瓶可获得45株左右。将玻璃瓶移入温室中，温度25℃，遮阳网遮阳，24h后掀去玻璃瓶封口膜，炼苗8天，移入装有灭菌蛭石的营养钵中，及时喷水保湿，待返苗后，每两天浇1/4Hoagland营养液一次，以浇透为止，10天后转移到大田，正常田间管理，成活率大于90％。组培60-80天获得的微型姜苗亦可以继代增殖。

培养到110天时，每接种块可获得有效微型姜苗21株左右，每个三角瓶中可达63个左右有效微型姜，生产出的微型姜苗非常健壮，将玻璃瓶移入温室中，温度25℃，遮阳网遮阳，24h后掀去玻璃瓶封口膜，炼苗8天，移入装有灭菌蛭石的营养钵中，及时喷水保湿，待返苗后，每两天浇1/4Hoagland营养液一次，以浇透为止，10天后转移到大田，正常田间管理，成活率大于95％。

实施例3植物组培快繁培养基

每升基本培养基MS中，加入110g蔗糖、0.0030g多效唑、6.8g琼脂，调节pH为5.7，加蒸馏水配制培养基。

实施例4微型姜苗的组培快繁

在超净工作台上将实施例2中培养60天的继代姜苗，去除上部叶鞘和大部分根部，留平均2cm根茎部为外殖体。在超净工作台无菌环境内进行消毒。先倒入70％酒精至浸没材料，轻轻振荡60sec后，将酒精迅速倒出，无菌水冲洗1遍，再倒入0.2％的升汞(HgCl₂)溶液振荡灭菌8min，用无菌水洗涤5遍。将消毒后的外殖体接种于含有60ml实施例3配制所得培养基的三角瓶中，每个三角瓶均匀接种3块，用封口膜封口，将三角瓶放于温度23℃，平均相对湿度为80％，控制光照时间为14h/d，光照强度3000Lux的无菌培养室中培养。

培养60天时，每接种块可获得有效小微型姜苗12株左右，每瓶可获得36株左右。将玻璃瓶移入温室中，温度20℃，遮阳网遮阳，20h后掀去玻璃瓶封口膜，炼苗6天，移入装有灭菌蛭石的营养钵中，及时喷水保湿，待返苗后，每两天浇1/4Hoagland营养液一次，以浇透为止，12天后转移到大田，正常田间管理，成活率大于90％。组培60-80天获得的微型姜苗可以继代增殖。

培养到110天时，每接种块可获得有效微型姜苗16株左右，每个三角瓶中可达48个左右有效微型姜，生产出的微型姜苗非常健壮，将玻璃瓶移入温室中，温度20℃，遮阳网遮阳，20h后掀去玻璃瓶封口膜，炼苗6天，移入装有灭菌蛭石的营养钵中，及时喷水保湿，待返苗后，每两天浇1/4Hoagland营养液一次，以浇透为止，12天后转移到大田，正常田间管理，成活率大于96％。

实施例5植物组培快繁培养基

每升基本培养基MS中，加入80g蔗糖、0.0042g多效唑、7.2g琼脂，调节pH为5.9，加蒸馏水配制培养基。

实施例6微型姜苗的组培快繁

在超净工作台上将实施例4中培养80天的继代姜苗，去除上部叶鞘和大部分根部，留平均1cm根茎部为外殖体。在超净工作台无菌环境内进行消毒。先倒入70％酒精至浸没材料，轻轻振荡30sec后，将酒精迅速倒出，无菌水冲洗2遍，再倒入0.2％的升汞(HgCl₂)溶液振荡灭菌10min，用无菌水洗涤7遍。将消毒后的外殖体接种于含有60ml实施例5配制所得培养基的三角瓶中，每个三角瓶均匀接种3块，用封口膜封口，将三角瓶放于温度26℃，平均相对湿度70％，控制光照时间为11h/d，光照强度1800Lux的无菌培养室中培养。

培养60天时，每接种块可获得有效小微型姜苗11株左右，每瓶可获得33株左右。将玻璃瓶移入温室中，温度30℃，遮阳网遮阳，26h后掀去玻璃瓶封口膜，炼苗8天，移入装有灭菌蛭石的营养钵中，及时喷水保湿，待返苗后，每两天浇1/4Hoagland营养液一次，以浇透为止，10天后转移到大田，正常田间管理，成活率大于94％。组培60-80天获得的微型姜苗可以继代增殖。

培养110天时，每接种块可获得有效微型姜苗18株左右，每个三角瓶中可达54个左右有效微型姜，生产出的微型姜苗非常健壮，将玻璃瓶移入温室中，温度30℃，遮阳网遮阳，26h后掀去玻璃瓶封口膜，炼苗8天，移入装有灭菌蛭石的营养钵中，及时喷水保湿，待返苗后，每两天浇1/4Hoagland营养液一次，以浇透为止，约10天后转移到大田，正常田间管理，成活率大于95％。

实验例1

1材料

以生姜继代苗为试验材料。

2试验设计和方法

2.16-BA和NAA配比对组培苗生长及微型姜苗形成的影响试验

以MS为基本培养基，设下面7个水平的浓度处理：

T1：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+30g/L蔗糖

T2：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L+30g/L蔗糖

T3：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L+30g/L蔗糖

T4：MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.1mg/L+30g/L蔗糖

T5：MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L+30g/L蔗糖

T6：MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.6mg/L+30g/L蔗糖

T7：MS+6-BA3.5mg/L+NAA0.1mg/L+30g/L蔗糖

将生姜组培继代苗去根和叶后，切取小于1cm长的茎尖，无菌操作转接到上述相应的培养基中，进行培养。每种培养基接种的茎尖数见表1。在温度25℃±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000Lux的培养室内培养，60天左右，最大苗高度达到三角瓶高度的1/2左右时，统计分化出的苗数，并观察记录小苗的生长情况，只统计高度或长度在1cm以上的小苗。

为避免丛生苗对调查结果的影响，转接的生姜组培苗均为去根和叶的新梢，每瓶中接种3株。

2.2 6-BA对组培苗生长及微型姜苗形成的影响试验

以MS为基本培养基，设下面5个水平的浓度处理：

B0：MS+6-BA0.0mg/L+100g/L蔗糖

B1：MS+6-BA0.5mg/L+100g/L蔗糖

B2：MS+6-BA1.0mg/L+100g/L蔗糖

B3：MS+6-BA2.5mg/L+100g/L蔗糖

B4：MS+6-BA5.0mg/L+100g/L蔗糖

培养基琼脂为0.7％，pH值为5.8，每个处理分装5个100ml三角瓶，每瓶中接种继代苗茎尖3块，培养室培养，光照时间12h/d，光照强度2000Lux，温度25±2℃。B0处理为对照。60天后，调查记录单个新梢的出芽数(小于0.5cm高的芽不计)和组培苗的生长情况，并测量高于1cm组培苗的株高。每3株为一个重复，每个处理重复5次。

2.3 NAA对组培苗生长及微型姜苗形成的影响试验

以MS为基本培养基，设6个水平的浓度处理：

N0：MS+NAA0mg/L+100g/L蔗糖

N1：MS+NAA0.1mg/L+100g/L蔗糖

N2：MS+NAA0.5mg/L+100g/L蔗糖

N3：MS+NAA1.0mg/L+100g/L蔗糖

N4：MS+NAA5.0mg/L+100g/L蔗糖

N5：MS+NAA10.0mg/L+100g/L蔗糖

培养基PH值为5.8，琼脂浓度为0.7％，每个处理分装5个100ml三角瓶，每瓶中接种继代苗茎尖3块，长度小于1cm，培养室培养，光照时间为12h/d，光照强度2000Lux，温度25±2℃。N0处理为对照。60天后，调查记录单个新梢的出芽数(小于0.5cm高的芽不计)和组培苗的生长情况。并测量高于1cm组培苗的株高。每3株为一个重复，每个处理重复5次。

2.4不浓度PP₃₃₃对组培苗生长及微型姜苗形成的影响试验

以MS为基本培养基，设5个水平的浓度处理：

P0：MS+PP₃₃₃0mg/L+100g/L蔗糖

P1：MS+PP₃₃₃1.0mg/L+100g/L蔗糖

P2：MS+PP₃₃₃2.0mg/L+100g/L蔗糖

P3：MS+PP₃₃₃3.0mg/L+100g/L蔗糖

P4：MS+PP₃₃₃4.0mg/L+100g/L蔗糖

P5：MS+PP₃₃₃5.0mg/L+100g/L蔗糖

培养基PH值为5.8，琼脂浓度为0.7％，每个处理分装5个100ml三角瓶，每瓶中接种继代苗茎尖3块，培养室培养，每天12小时光照，光照强度2000Lux，温度25±2℃。处理P0为对照。60天后，调查记录单个新梢的出芽数(小于0.5cm高的芽不计)和组培苗的生长情况，并测量高于1cm组培苗的株高。每3株为一个重复，试验重复5次。继续培养至110天，调查微型姜株高、有效微型姜苗数、根状茎高、根状茎宽、单个根状茎重量。

2.5统计分析方法

对上述每组试验的数据分别进行整理，计算每个处理各重复的芽分化总数、平均出芽数。平均单株出芽数＝出芽总数÷接种芽数。另外，计算每个处理各重复的平均株高。

计算每个处理的单株平均出芽数的标准差，用DPS数据分析系统对各组试验结果进行方差分析和差异显著性比较。

3.结果与分析

3.1不同浓度6-BA和NAA对微型姜苗的影响

培养中各处理形成的新芽茎尖在芽分化的同时，小苗也长出了根。统计结果显示，除T4培养基外，其余各培养基的平均单株出芽数都达到2.0个以上。(表1)。

表1  不同浓度6-BA和NAA对微型姜苗的影响

处理	接种芽数	出芽数(个)	平均单株出芽数
				T1T2T3T4T5T6T7	46608034294364	123142221608592128	2.72.42.81.52.92.12.0

培养基T5与T6中6-BA的浓度相同，T6的NAA的浓度较高。实验显示，6-BA浓度相同，NAA浓度较高时，出芽数有所降低。

当培养基中含0.1mg/L NAA时，2.0mg/L以下或3.0mg/L的6-BA较适宜继代过程中的芽诱导，附加6-BA 3.0mg/L+NAA0.1mg/L(T5)的MS培养基对组培苗多芽分化和成苗的综合效果相对较好(表1)。这可能与细胞内的各激素的累积水平和相互作用有关。

3.3不同浓度的6-BA对微型姜苗的影响

从表2可以看出，单独使用6-BA进行继代培养时，与对照比较，当6-BA为0.5mg/L(B1)时，平均单株出芽数最多，为4.3个，根、叶生长状况与对照相当。但随着培养基中6-BA浓度的提高，芽平均单株出芽数呈现降低的趋势。经方差分析，在5％的显着水平下，仅浓度为0.5mg/L的6-BA处理的平均单株芽数与对照差异显著，其他处理与对照之间的差异不显著。观察还发现，从6-BA浓度为1.0mg/L开始，组培苗基部出现黄化现象，根叶均呈现衰老的迹象。当6-BA的浓度到达5mg/L时，组培苗黄化现象尤其显著。当6-BA浓度较低时，组培苗株高与对照相当，但随着6-BA浓度的升高，植株逐渐矮化。

表2  不同浓度的6-BA对微型姜苗的影响

^*邓肯氏新复极差法显著性测验，不同字母表示两个处理之间存在显著差异。下同。

可见，较低浓度的6-BA对继代组培苗的芽分化有一定的促进作用，但是对组培苗生长无促进作用。

3.4不同浓度的NAA对微型姜苗的影响

在MS培养基上单独添加NAA，当浓度在0.1-1.0mg/L的范围时，平均单株出芽数率较高，而随着NAA浓度逐渐升高，出芽数量总体呈下降的趋势。方差分析表明0.1mg/L到1.0mg/L的NAA处理后的平均单株芽数与对照均差异显著，0.1mg/L NAA处理的单株芽数可达到6.5个。在低浓度NAA培养基上的植株生长健壮，茎叶和根系均发达，平均单株芽数较多。当NAA浓度达到5.0mg/L以上时，植株长势下降，分蘖数减少，并且随着浓度的增加，基部出现黄褐色。当NAA的浓度到达10.0mg/L时，苗出现了明显的黄化现象。在低浓度范围内，随着浓度的增加，组培苗的株高逐渐增高，但是随着浓度的进一步提高，株高有所下降。

此外，可以发现添加适宜浓度的NAA进行继代培养，单株出芽数要高于添加6-BA的各处理。经NAA处理的组培苗的长势，无论是根还是茎叶，大多要好于添加6-BA的试验组。而且芽的黄化现象要明显轻于添加6-BA的处理。

表3  不同浓度的NAA对微型姜苗的影响

3.5不同浓度的PP₃₃₃对组培苗生长及微型姜苗形成的影响

试验结果显示，培养至60天，添加PP₃₃₃的各处理的芽分化数大大提高，所有添加PP₃₃₃的处理的单株平均芽数均显著高于对照(表4)。

在含有60ml的培养基上，60天时P4处理每个外殖体平均分化小微型姜苗15.4±1.16；继续培养到110天(表5)，分化微型姜数达21.69±0.48个，微型姜苗株高平均为4.45±0.08cm、分化的根状茎高0.70±0.03cm，根状茎宽0.63±0.05cm、平均单个根状茎重量0.24±0.02g。110天时P3处理的根状茎比P4处理略大，但微型姜苗分化数较少。

表4  不同浓度PP₃₃₃对微型姜苗形成的影响(60天)

处理	分化株数/每个外殖体
		P1P2P3P4P5P0	8.7±0.298.9±0.8610.4±1.1615.4±1.168.9±1.123.3±0.29

表5  不同浓度PP₃₃₃对微型姜苗形成的影响(110天)

培养基评价项目	CK	P5	P4	P3	P2	P1
							微型姜株高(cm)有效微型姜苗数(株)根状茎高(cm)根状茎宽(cm)单个根状茎重量(g)	3.36±0.4211.50±1.350.57±0.060.50±0.070.17±0.03	2.95±0.1114.37±1.770.54±0.070.47±0.060.15±0.03	4.45±0.0821.69±0.480.70±0.030.63±0.050.24±0.02	3.52±0.2915.36±1.460.81±0.090.72±0.080.28±0.03	3.28±0.4012.19±1.000.51±0.090.49±0.020.16±0.01	3.48±0.4611.01±0.990.62±0.020.54±0.020.16±0.01

观察还发现，用PP₃₃₃处理，组培苗生长健壮，芽分蘖多，根系发达，茎叶和根生长均衡，叶色深绿，苗基部没有出现黄化现象。不同浓度PP₃₃₃处理的组培苗的生长状况均优于对照。而且，其综合表现要明显好于单独使用6-BA和NAA的各处理(表6)。

表6  不同组织培养基配方对组培苗生长及微型姜苗形成的影响

处理	评价项目及培养时间
							60天			110天
	平均单株出苗数	微型姜苗健壮度	微型姜发育	平均单株出苗数	微型姜苗健壮度	微型姜发育
							T5B1N1P3P4	2.934.36.510.415.4	细弱细弱细弱健壮健壮	无无无始有始有	---15.421.3	干枯干枯干枯健壮健壮	---最大大

*“-”因组培苗生长过快，植株黄化衰老，培养基耗尽。

4.结论

单独添加0.5mg/L6-BA的单株出芽数可达4.3个，但是组培苗生长不佳；单独使用NAA时，以0.1-1.0mg/L的浓度较合适芽分化、生根和幼苗生长，最高单株出芽数可达6.5个；单独使用PP₃₃₃时，1.0mg/L的浓度就对芽分化和根、茎叶生长表现出明显的促进作用。4.0mg/L的浓度可以显著增加组培苗的芽分化数和促进茎叶、根系的生长，随着浓度的增加，生长抑制过强。P4处理，培养至60天平均单株出苗数达15.4±1.16个，110天平均单株生产微型姜苗数高达21.69±0.48个。相比之下，在适宜的浓度范围内，单独使用PP₃₃₃要明显优于单独使用NAA和6-BA的效果，其组培苗生长健壮，芽分蘖多，茎叶和根生长均衡，叶色深绿，苗基部没有黄化现象，同时可有效的抑制姜苗生长过快，培养消耗过快，大大减少了离体保存姜种质时每年进行继代的次数。PP₃₃₃作为一种人工合成的植物生长调节剂在生姜组织培养快繁和工厂化种苗生产中将有着很好的应用前景。

Claims (7)

1.一种微型姜苗组培快繁培养基，其特征在于，每升基本培养基MS中还含有下列重量的物质：80-110g蔗糖、0.0030-0.0042g多效唑、6.8-7.2g琼脂，pH为5.7-5.9。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，每升基本培养基MS中还含有下列重量的物质：100g蔗糖、0.0040g多效唑、7.0g琼脂，pH为5.8。

3.如权利要求1或2所述的培养基在微型姜苗组培快繁中的应用。

4.一种微型姜苗组培快繁的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a.在无菌条件下，将继代姜苗去除上部叶鞘和大部分根部，留1-2cm根茎部为外殖体；

b.在无菌条件下，将步骤a所述的外殖体接种于含有60ml权利要求1所述培养基的封口玻璃瓶中，在温度23-26℃，相对湿度70-80％，控制光照时间为11-14h/d，光照强度1800-3000Lux的无菌培养室中培养60天-110天，获得微型姜苗。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤a所述外殖体在无菌环境内进行消毒，先倒入70％酒精至浸没材料，振荡30-60sec后，将酒精倒出，无菌水冲洗1-2遍，再倒入0.2％的升汞溶液振荡灭菌8-10min，用无菌水洗涤5-7遍。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于还包括步骤c：将玻璃瓶移入温室中，温度20-30℃，遮阳网遮阳，20-26h后掀去玻璃瓶封口膜，炼苗6-8天，移入装有灭菌蛭石的营养钵中，及时喷水保湿，待返苗后，每两天浇1/4Hoagland营养液一次，以浇透为止，10-12天后转移到大田，正常田间管理。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述的培养60-80天的微型姜苗，作为继代姜苗。