CN103651136A - 狐狸尾兰组织培养方法 - Google Patents

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高宏秀
强承魁
张光琴
张莹
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Xuzhou Vocational College of Bioengineering
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Abstract

本发明公开了一种狐狸尾兰组织培养方法。本发明以狐狸尾兰未成熟种子作外植体，应用组织培养等生物技术对狐狸尾兰类原球茎体诱导、增殖和催根并获得狐狸尾兰组织培养所需培养基的最佳条件；（1）液体培养基有利于类原球茎体短期的快速增殖，长期继代培养及保存类原球茎体时选用固体1/2MS培养基适宜；（2）在培养过程中，施加1mg/L的BA的效果更优一些，及可以增加类原球茎体的数目，又不会引起玻璃化的产生；（3）在培养基中加入1.0g/L维生素C可以有效抑制外植体的褐化。

Description

狐狸尾兰组织培养方法
技术领域
本发明涉及一种狐狸尾兰组织培养方法。
背景技术
狐狸尾兰(Rhynchos tylis gigantea)又名钻喙兰、海南钻喙兰、狐尾兰,为兰科钻喙兰尾多年生附生草本，其在野生环境下多附生于橡胶树、枫树或榕树上，是我国海南野生名优兰品种之一。狐狸尾兰叶片肥厚、翠绿，宽带状,外弯，多有数条浅色的纵条纹，茎直立,具数节,不分枝。狐狸尾兰花序直立或呈下垂状，且花序多而密集；花瓣比萼片小；其唇瓣呈浅3裂或不裂状；距两侧压扁；蕊柱短，蕊柱足较短；花粉块2个，有不同程度的裂隙，呈蜡质状；具有狭长的蕊喙柄以及较小粘盘，花期通常在1-3月。狐狸尾兰的花色也较为丰富，有红、粉红、白、蓝、橘等颜色。由于其花型独特，花色丰富，花期长，且花期为我国传统春节前后,是极好的新春贺岁花卉，因此受到人们的极度喜欢[1]。
然而，由于我国海南地区热带森林过量采伐,致使野生狐狸尾兰的自然生境受到严重破坏,加上人为的过度采集出售,致使野生狐狸尾兰数量锐减,严重影响了狐狸尾兰生态群的构成。且由于狐狸尾兰的种子在自然条件下不易萌发,采用种子繁殖很难获得后代，虽然可以采取分株方法,但是这种方法不仅繁殖系数低,且繁殖速度非常慢,远远不能满足市场的需求[2]。
目前，通过组织培养的技术来快速繁殖已在很多兰科植物普遍应用，比较常见的如蝴蝶兰、大花蕙兰等。
发明内容
本发明提供一种狐狸尾兰组织培养方法，为狐狸尾兰工厂化育苗提供科学依据。
本发明是以如下技术方案实现的：一种狐狸尾兰组织培养方法，以狐狸尾兰未成熟种子作外植体,应用组织培养等生物技术对狐狸尾兰类原球茎体诱导、增殖和催根并获得狐狸尾兰组织培养所需培养基的最佳条件；具体步骤如下：
1）无菌材料的获得
用去离子水冲洗狐狸尾兰果实表面,然后在超净工作台上用80%酒精表面消毒果实2min,无菌水冲洗3次,再用无菌滤纸吸干水分,然后用解剖刀切开荚果,取出细小种子,轻轻将种子均匀散落到固体培养基上,每平板接种量为55粒种子；
2）类原球茎体诱导
把狐狸尾兰的种子分别接种于诱导培养基中,诱导原球茎(类原球茎体)的形成。培养基组成成分如下：VW+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L；
3）培养方式的筛选
将诱导出的类原球茎体接种在1/2MS培养基上，分别采用固体培养和液体转动培养两种方式，4次重复，每个处理接种20个三角瓶；四周后统计类原球茎体的增殖倍数；其增殖倍数=新长出的类原球茎体/接种类原球茎体数；
4）植物生长调节剂浓度的筛选
以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的BA,KT,IBA NAA这四种生长调节剂,分别进行单因素试验，每处理4次重复，每个处理接种20个三角瓶；四周后统计类原球茎体的增殖倍数，计算方法同步骤3）；
5）不同添加物对类原球茎体的褐化
以1/2MS为基本培养基，在培养基中分别添加不同浓度的维生素C、活性炭AC和Na2S2O3；分别进行单因素试验，每处理3次重复，每个处理接种20个三角瓶；50天后观察并记录类原球茎体褐化和生长状况。
本发明的有益效果是：本发明通过对不同条件下类原球茎体增殖倍数的研究，来明确培养基中各种成分的作用方式，最终得出如下结论：1）液体培养基有利于类原球茎体短期的快速增殖，长期继代培养及保存类原球茎体时选用固体1/2MS培养基适宜；（2）在培养过程中，施加1mg/L的BA的效果更优，可以增加类原球茎体的数目，又不会引起玻璃化的产生；（3）在培养基中加入1.0g/L维生素C可以有效抑制外植体的褐化。
具体实施方式
实施例1
1）无菌材料的获得
用去离子水冲洗狐狸尾兰果实表面,然后在超净工作台上用80%酒精表面消毒果实2min,无菌水冲洗3次,再用无菌滤纸吸干水分,然后用解剖刀切开荚果,取出细小种子,轻轻将种子均匀散落到固体培养基上,每平板接种量为55粒种子；
2）类原球茎体诱导
把狐狸尾兰的种子分别接种于诱导培养基中,诱导原球茎(类原球茎体)的形成。培养基组成成分如下：VW+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L；
3）培养方式的筛选
将诱导出的类原球茎体接种在1/2MS培养基上，分别采用固体培养和液体转动培养两种方式，4次重复，每个处理接种20个三角瓶；四周后统计类原球茎体的增殖倍数；其增殖倍数=新长出的类原球茎体/接种类原球茎体数；
4）植物生长调节剂浓度的筛选
以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的BA,KT,IBA NAA这四种生长调节剂,分别进行单因素试验，每处理4次重复，每个处理接种20个三角瓶；四周后统计类原球茎体的增殖倍数，计算方法同步骤3）；
5）不同添加物对类原球茎体的褐化
以1/2MS为基本培养基，在培养基中分别添加不同浓度的维生素C、活性炭AC和Na2S2O3；分别进行单因素试验，每处理3次重复，每个处理接种20个三角瓶；50天后观察并记录类原球茎体褐化和生长状况。
实验结果分析
1、培养条件对类原球茎体增殖的影响
在两种培养模式下的类原球茎体增殖倍数统计见表1。
表1.原球茎体增殖在不同培养条件下的增殖情况
Figure BDA0000431904110000041
注：**表示差异达到极显著水平
由表1看出，液体1/2MS培养基中培养的类原球茎体的增殖倍数极显著的高于固体1/2MS培养基条件下的增殖速度。但同时也表现出固体1/2MS培养基上的类原球茎体的外观表现较好，呈现出嫩绿色的外观，质地紧致。而在液体培养基中类原球茎体粒数多，颗粒大但组织结构较疏松，且严重玻璃化，丧失了分化能力，这与陈春满(2002)在象牙白花兰种子的组织培养研究结果类似[4]。因此，液体培养基有利于类原球茎体短期的快速增殖，一旦时间过长，将丧失分化能力。如果要长期继代培养及保存类原球茎体时选用固体1/2MS培养基适宜。
3.2植物生长调节浓度对类对圆球茎体增值的影响
细胞分裂素种类和浓度的对类圆球茎体增值的影响结果见表2
表2类圆球茎体增值在不同细胞分裂素种类和浓度下的增值情况
Figure BDA0000431904110000042
Figure BDA0000431904110000051
根据表2的结果，可以看出细胞分裂素KT、BA都对类圆球茎体的增值明显的促进作用。表上看，0.45mg/L的KT相对于BA的增值效果更好一些，这样说明了狐狸尾兰类圆球茎体对KT反应较为敏感，超过一定浓度，如浓度达到1mg/L或高于这个浓度，则会增加类圆球茎体玻璃化的几率。因此，笔者认为1.0mg/L浓度的KT相对于BA效果更好，说明此狐狸尾兰的根状茎对KT更敏感。
3.3不同添加物对类圆球茎体褐化的影响
前人的研究认为活性炭、维生素C和Na2S2O3可以减缓或抑制培养物褐化。在1/2MS培养基中添加不同附加物，并观察比较其对类圆球茎体生长状况的影响。施加不同浓度Vc和Na2S2O3的培养基中类圆球茎体褐化程度表见表3.
表3不同添加物对类圆球茎体褐化的影响
Figure BDA0000431904110000052
从表3中我们可以看出Na2S2O3没有有效抑制狐狸尾兰褐化，为了确认这一结果，笔者又对外植体进行了暗培养、接种前用Na2S2O3浸泡外植体等处理，均没有抑制狐狸尾兰褐化。这可能是由于醌类化合物被外植体排到培养基中，从而抑制了植物体内的酶活性。不同浓度维生素C也有在一定程度上也能抑制褐化，不同浓度活性炭一定程度上也能抑制褐化，其原因可能是活性炭吸附了培养基中的有害物质时，也常常会吸附营养物质，因此，笔者推荐0.8mg/L维生素C作为外植体褐化的抑制剂。除此之外，长时间继代培养可使培养物逐渐脱除酚类物质。
结论
根据本发明并结合前人的研究结果，对狐狸尾兰组织培养条件进行了优化研究最终得出如下结论：（1）液体培养基有利于类原球茎体短期的快速增殖，一但时间过长，将丧失分化能力，如果要长期继代培养及保存类原球茎体时选用固体1/2MS培养基适宜；（2）在培养过程中，施加1.0mg/L的BA的效果会更优一些，及可以增加类原球茎体的数目，又不会引起玻璃化的产生；（3）在培养基中加入1.0g/L维生素C可以有效抑制外植体的褐化。

Claims (1)

1.一种狐狸尾兰组织培养方法，其特征在于：以狐狸尾兰未成熟种子作外植体,应用组织培养等生物技术对狐狸尾兰类原球茎体诱导、增殖和催根并获得狐狸尾兰组织培养所需培养基的最佳条件；具体步骤如下：
1）无菌材料的获得
用去离子水冲洗狐狸尾兰果实表面,然后在超净工作台上用80%酒精表面消毒果实2min,无菌水冲洗3次,再用无菌滤纸吸干水分,然后用解剖刀切开荚果,取出细小种子,轻轻将种子均匀散落到固体培养基上,每平板接种量为55粒种子；
2）类原球茎体诱导
把狐狸尾兰的种子分别接种于诱导培养基中,诱导原球茎(类原球茎体)的形成；培养基组成成分如下：VW+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L；
3）培养方式的筛选
将诱导出的类原球茎体接种在1/2MS培养基上，分别采用固体培养和液体转动培养两种方式，4次重复，每个处理接种20个三角瓶；四周后统计类原球茎体的增殖倍数；其增殖倍数=新长出的类原球茎体/接种类原球茎体数；
4）植物生长调节剂浓度的筛选
以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的BA,KT,IBA NAA这四种生长调节剂,分别进行单因素试验，每处理4次重复，每个处理接种20个三角瓶；四周后统计类原球茎体的增殖倍数，计算方法同步骤3）；
5）不同添加物对类原球茎体的褐化
以1/2MS为基本培养基，在培养基中分别添加不同浓度的维生素C、活性炭AC和Na2S2O3；分别进行单因素试验，每处理3次重复，每个处理接种20个三角瓶；50天后观察并记录类原球茎体褐化和生长状况。
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