CN107494267A

CN107494267A - 一种德国鸢尾愈伤组织的培养方法

Info

Publication number: CN107494267A
Application number: CN201710895940.5A
Authority: CN
Inventors: 贾思振; 杨恒伟; 王媛花
Original assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Current assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2017-12-22

Abstract

本发明公开了一种德国鸢尾愈伤组织的培养方法，选取叶龄为5～10天叶片基部的1～2cm处作为外植体，将外植体在无菌条件下，进行消毒杀菌处理，消毒后吸干其表面水分，再用无菌刀片将叶片由基部往外切成0.4～0.6毫米的小段，最后用打孔器将叶片打成原片后接种于愈伤组织诱导培养基中；将诱导培养基置于没有光照的黑暗培养箱中，于25℃下培养25～30天后，叶片边缘长出不规则形状的愈伤组织。本发明德国鸢尾愈伤组织的培养方法采用德国鸢尾叶片作为待愈伤组织培养的外植体，结合特定的培养条件和愈伤组织诱导培养基，有效提高了叶片愈伤组织的诱导效率，愈伤组织的诱导率能达到82％以上。

Description

一种德国鸢尾愈伤组织的培养方法

技术领域

本发明涉及一种德国鸢尾愈伤组织的培养方法，属于组织培养技术领域。

背景技术

德国鸢尾是一类重要的园林绿化花卉，它的繁殖方式主要有分株繁殖、种子繁殖和组织培养。德国鸢尾种子结实率低，萌发不规律且非常缓慢，目前常用的繁殖方法是分株繁殖，但繁殖系数相对较低，这使得通过组织培养方法来繁殖鸢尾属植物的技术在国内逐渐兴起。另外，随着的分子生物学研究的深入，在分子机理研究方面，愈伤组织成为常用的试验材料，也是基因工程研究中进行基因转化所必需的试验材料。愈伤组织是指外植体在离体培养条件下，形成的一团无极性、能旺盛分裂的薄壁细胞团，在培养过程中，经过诱导分化可以发育成完整的再生植株。愈伤组织是植物的外植体经过脱分化形成的，多种外植体都可以经过组织培养诱导形成愈伤组织，而植物愈伤组织因为具有以下特点而被广泛应用于植物分子机理和基因工程研究中。虽然鸢尾组织培养国内外已经有报道，但是目前研究与应用中存在一些问题，尤其是存在愈伤组织的诱导率低与分化效果差等问题。而且，目前对于德国鸢尾愈伤组织的研究中多集中在花瓣、花蕾和花轴等部位，叶片愈伤组织研究较少。然而，由于花器官的局限性，限制了德国鸢尾愈伤组织的研究，也不能满足研究需要。因此，通过培养德国鸢尾叶片愈伤组织提高愈伤组织诱导效率，既能够加快德国鸢尾的组培快繁，也能够为分子生物学研究提供充足的原料。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种德国鸢尾愈伤组织的培养方法，该培养方法采用德国鸢尾叶片作为待愈伤组织培养的外植体，结合特定的培养条件和培养基下，有效提高了叶片愈伤组织的诱导效率，从而加快了德国鸢尾的组培快繁。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：

一种德国鸢尾愈伤组织的培养方法，包括如下步骤：

步骤1，选取叶龄为5～10天、10～15天或15～20天的德国鸢尾叶片待用；

步骤2，取步骤1叶片基部的1～2cm处作为外植体，将外植体在无菌条件下，进行消毒杀菌处理，消毒后吸干其表面水分，再用无菌刀片将叶片由基部往外切成0.4～0.6毫米的小段，最后用打孔器将叶片打成原片后接种于愈伤组织诱导培养基中；

步骤3，将步骤2的诱导培养基置于没有光照的黑暗培养箱中，于23～27℃下培养25～30天后，叶片边缘周围长出不规则形状的愈伤组织。

其中，步骤1中，将采摘回来的若干株德国鸢尾清洗干净后养殖在清水中，每1～2天换次水，5天后定植于营养液中培养，培养后分别取叶龄为5～10天、10～15天或15～20天叶片基部的1～2cm处作为待培养的外植体。

其中，所述营养液由如下浓度的物质混合而成：硝酸钙354mg/L、硝酸钾707mg/L、磷酸二氢铵114mg/L和硫酸镁246mg/L。

其中，步骤2中，所述消毒杀菌处理具体是指：将外植体在无菌条件下，先用浓度75％的乙醇消毒，再用无菌去离子水冲洗，接着用浓度10％的次氯酸钠消毒，最后再用无菌去离子水冲洗。

其中，步骤2中，所述愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+2，4-D(1.5～3mg/L)+KT(0.2～0.6mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(6g/L)，愈伤组织诱导培养基的配方优选为：MS+2，4-D(2.5mg/L)+KT(0.4mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(6g/L)。

2，4-D和KT能够很好的协同诱导和促进德国鸢尾叶片愈伤组织的形成(提高诱导率的同时还能使得到的愈伤组织质量好)；蔗糖在植物组织培养基中起到能源物质和渗透调节剂的作用，除供能之外，还能诱导愈伤组织的再分化；琼脂粉在培养基中主要起固定支撑的作用。

其中，所述愈伤组织诱导培养基的PH值为5.8～6.0。

相比于现有技术，本发明技术方案具有的有益效果为：

本发明德国鸢尾愈伤组织的培养方法采用德国鸢尾叶片作为待愈伤组织培养的外植体，结合特定的培养条件和愈伤组织诱导培养基，有效提高了叶片愈伤组织的诱导效率，愈伤组织的诱导率能达到82％以上，从而加快了德国鸢尾的组培快繁，为德国鸢尾的分子生物学以及基因工程研究提供了一条新的途径。

具体实施方式

实施例1

本发明德国鸢尾愈伤组织的培养方法，包括如下步骤：

步骤1，在田间摘取若干株德国鸢尾，将其鳞茎上的淤泥清洗干净后养殖在清水中，每1～2d换次水，5天后定植于营养液中培养，选取叶龄为5～10天的叶片，取叶片基部1～2cm处作为外植体；将外植体在无菌条件下，先用浓度75％的乙醇消毒2分钟，再用无菌去离子水冲洗3次，接着用浓度10％的次氯酸钠消毒5分钟，最后再用无菌去离子水冲洗3次；消毒后用无菌滤纸吸干叶片表面水分，再用无菌的手术刀片小心将叶片由基部往外切成0.5毫米的小段，最后用直径为0.5厘米的打孔器将叶片打成原片后接种于愈伤组织诱导培养基中；愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+2，4-D(2.5mg/L)+KT(0.4mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(6g/L)，诱导培养基的PH值为5.9；

步骤2，将步骤1的诱导培养基置于没有光照的黑暗培养箱中，于25℃下培养25～30天后，叶片边缘长出不规则形状的愈伤组织，82％以上接种的外植体全部分化出了愈伤组织，愈伤组织的直径大于3mm，愈伤组织的直径约为6～7mm，且得到的愈伤组织颗粒紧密，呈黄白色，本发明培养方法不仅叶片愈伤组织诱导率高、分化能力强，且分化出的愈伤组织质量很好。

在无菌条件下切下叶片边缘的愈伤组织接种于愈伤组织增殖培养基中，培养25～30天后，愈伤组织体积迅速增殖到原来体积的2～3倍，增殖后的愈伤组织一部分可用来做分子生物学以及基因工程相关试验，剩余的一部分可再次接种于增殖培养基中继续增殖培养。愈伤组织增殖培养基的配方为：MS+2，4-D(1.5～2mg/L)+NAA(0.2～0.4mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(6g/L)，愈伤组织增殖培养基的PH值为5.8。

实施例2

本发明德国鸢尾愈伤组织的培养方法，包括如下步骤：

步骤2，将步骤1的诱导培养基置于有光照的黑暗培养箱中，于25℃下培养25～30天后，只有少数外植体分化出了愈伤组织，且愈伤组织的直径小于3mm，愈伤组织颗粒疏松，呈白色水渍状，不仅诱导率低，且分化出的愈伤组织质量差，因此对本发明培养方法而言，不适宜在光照下进行培养，需要在全黑暗环境下培养。

实施例3

本发明德国鸢尾愈伤组织的培养方法，选取叶龄为10～15天的德国鸢尾叶片作为待愈伤培养的对象，包括如下步骤：

步骤1，在田间摘取若干株德国鸢尾，将其鳞茎上的淤泥清洗干净后养殖在清水中，每1～2d换次水，5天后定植于营养液中培养，选取叶龄为10～15天的叶片，取叶片基部1～2cm处作为外植体；将外植体在无菌条件下，先用浓度75％的乙醇消毒2分钟，再用无菌去离子水冲洗3次，接着用浓度10％的次氯酸钠消毒5分钟，最后再用无菌去离子水冲洗3次；消毒后用无菌滤纸吸干叶片表面水分，再用无菌的手术刀片小心将叶片由基部往外切成0.5毫米的小段，最后用直径为0.5厘米的打孔器将叶片打成原片后接种于愈伤组织诱导培养基中；愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+2，4-D(1.5mg/L)+KT(0.2mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(6g/L)，诱导培养基的PH值为5.8；

步骤2，将步骤1的诱导培养基置于没有光照的黑暗培养箱中，于27℃下培养25～30天后，只有少数外植体分化出了愈伤组织，且愈伤组织的直径小于3mm，愈伤组织颗粒疏松，呈白色水渍状，不仅诱导率低，且分化出的愈伤组织质量差。

实施例4

本发明德国鸢尾愈伤组织的培养方法，选取叶龄为15～20天的德国鸢尾叶片作为待愈伤培养的对象，包括如下步骤：

步骤1，在田间摘取若干株德国鸢尾，将其鳞茎上的淤泥清洗干净后养殖在清水中，每1～2d换次水，5天后定植于营养液中培养，选取叶龄为15～20天的叶片，取叶片基部1～2cm处作为外植体；将外植体在无菌条件下，先用浓度75％的乙醇消毒2分钟，再用无菌去离子水冲洗3次，接着用浓度10％的次氯酸钠消毒5分钟，最后再用无菌去离子水冲洗3次；消毒后用无菌滤纸吸干叶片表面水分，再用无菌的手术刀片小心将叶片由基部往外切成0.5毫米的小段，最后用直径为0.5厘米的打孔器将叶片打成原片后接种于愈伤组织诱导培养基中；愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+2，4-D(3mg/L)+KT(0.6mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(6g/L)，诱导培养基的PH值为6；

步骤2，将步骤1的诱导培养基置于没有光照的黑暗培养箱中，于23℃下培养25～30天后，只有少数外植体分化出了愈伤组织，且愈伤组织的直径小于3mm，愈伤组织呈白色水渍状，不仅诱导率低，且分化出的愈伤组织质量差。

将叶龄为5～10天的叶片分别接种于不同激素配比的愈伤组织诱导培养基中，不同激素配比的愈伤组织诱导培养基对德国鸢尾叶片愈伤组织的诱导影响如表1所示：

表1为不同激素配比的愈伤组织诱导培养基对德国鸢尾叶片愈伤组织诱导的影响

由表1可知，当愈伤组织诱导培养基中添加的2，4-D和6-BA浓度分别为2.5mg/L和0.4mg/L时，产生的愈伤组织大小适中，组织紧密，颜色黄白色，组织分化能力强，愈伤组织诱导率可达到82％。

将德国鸢尾叶片的三个不同叶龄(5-10天、10-15天、15-20天)的叶片分别接种于MS+2，4-D(2.5mg/L)+KT(0.4mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(6g/L)诱导培养基上，不同叶龄的叶片对德国鸢尾叶片愈伤组织诱导的影响如表2所示：

表2为不同叶龄的叶片对德国鸢尾叶片愈伤组织诱导的影响

叶片的不同生长时期对愈伤组织的诱导有很大的影响，从表2可以看出，叶龄为5～10天的叶片作为外植体对象，容易诱导出愈伤组织，诱导率达到80％，而当叶龄增大，组织分化能力减弱，愈伤组织质量不好，诱导率低。

将两组叶龄为5～10天的德国鸢尾叶片分别接种于MS+2，4-D(2.5mg/L)+KT(0.4mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(6g/L)诱导培养基上，其中一组在光照环境下培养，另一组在完全遮光的黑暗条件下培养，光照和暗培养对德国鸢尾叶片愈伤组织诱导的影响如表3所示：

表3为光照对德国鸢尾叶片愈伤组织诱导的影响

由表3可知，黑暗条件下有利于德国鸢尾叶片愈伤组织的分化，在完全黑暗条件下培养，愈伤组织的诱导率可达到82％，且分化出的愈伤组织质量也很好，因此，本发明培养方法在黑暗条件下有利于愈伤组织的形成。

本发明德国鸢尾愈伤组织的培养方法需要在完全黑暗的条件下培养，若按照平时普通外植体愈伤组织培养的条件(置于光照下培养)培养本发明的外植体，得到的愈伤组织不仅质量差，而且愈伤组织诱导率非常低，而在完全黑暗条件下培养得到的愈伤组织，诱导率可达到82％，分化出的愈伤组织质量也很好。

叶片愈伤组织质量的评价指标：

(1)愈伤组织的颗粒大小

以培养28天的叶片愈伤组织为准，愈伤组织的直径小于3毫米为不合格愈伤组织，愈伤组织直径大于3毫米为合格愈伤组织。

(2)愈伤组织的颗粒散碎度

颗粒散碎表示愈伤组织容易松散，不紧密，愈伤组织表面毛刺状不平滑；颗粒致密表示愈伤组织颗粒致密硬度高，愈伤组织表面光滑状，细胞致密，胞质密度高，愈伤组织边缘清晰。

(3)愈伤组织的色泽

黄白色愈伤组织没有水渍化现象，组织颗粒致密，硬度高，愈伤组织表层细胞层清晰，有明显的表层致密层结构，是质量好的愈伤组织。

Claims

1.一种德国鸢尾愈伤组织的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤3，将步骤2的诱导培养基置于没有光照的黑暗培养箱中，于23～27℃下培养25～30天后，叶片边缘长出不规则形状的愈伤组织。

2.根据权利要求1所述的德国鸢尾愈伤组织的培养方法，其特征在于：步骤1中，将采摘回来的若干株德国鸢尾清洗干净后养殖在清水中，每1～2d换次水，5天后定植于营养液中培养，培养后分别取叶龄为5～10天、10～15天或15～20天叶片基部的1～2cm处作为待培养的外植体。

3.根据权利要求2所述的德国鸢尾愈伤组织的培养方法，其特征在于：所述营养液由如下浓度的物质混合而成：硝酸钙354mg/L、硝酸钾707mg/L、磷酸二氢铵114mg/L和硫酸镁246mg/L。

4.根据权利要求1所述的德国鸢尾愈伤组织的培养方法，其特征在于：步骤2中，所述消毒杀菌处理具体是指：将外植体在无菌条件下，先用浓度75％的乙醇消毒，再用无菌去离子水冲洗，接着用浓度10％的次氯酸钠消毒，最后再用无菌去离子水冲洗。

5.根据权利要求1所述的德国鸢尾愈伤组织的培养方法，其特征在于：步骤2中，所述愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+2，4-D(1.5～3mg/L)+KT(0.2～0.6mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(6g/L)。

6.根据权利要求5所述的德国鸢尾愈伤组织的培养方法，其特征在于：所述愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+2，4-D(2.5mg/L)+KT(0.4mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(6g/L)。

7.根据权利要求5所述的德国鸢尾愈伤组织的培养方法，其特征在于：所述愈伤组织诱导培养基的PH值为5.8～6.0。