CN107372125B - 一种乌头花托愈伤组织诱导及分化不定芽方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种乌头花托愈伤组织诱导及分化不定芽方法。该方法包括如下步骤：选取花托外植体并进行预处理及常规消毒；将无菌花托在启动培养基上进行诱导培养，首先暗培养1周，然后转至弱光下培养30～40 d，产生初始愈伤组织；将初始愈伤组织，转接到增殖培养基中进行增殖培养；将初始或增殖愈伤组织，转接到不定芽培养基进行不定芽分化培养，首先弱光培养4 d，然后转至正常环境中培养，分化出不定芽。采用本发明所述方法，可快速获得大量花托愈伤组织及不定芽，诱导率分别达100%和93%，从而攻克了乌头愈伤组织诱导率低、诱导质量差、不定芽分化困难这一技术难题，为乌头品种改良和生物技术育种奠定了良好的基础。

Description

一种乌头花托愈伤组织诱导及分化不定芽方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种乌头花托愈伤组织诱导及分化不定芽方法。
背景技术
乌头（Aconitum carmichaeli）是毛茛科乌头属多年生草本植物，茎直立，为重要的中药，神农本草经中列为下品。其母根乌头，为镇痉剂，冶风庳，风湿神经痛。侧根（附子）有回阳、逐冷、祛风湿的作用（张永清等，2013）。乌头花美丽，可供观赏，清人吴其浚在《植物名实图考》曰：“其花色碧，殊娇纤，名鸳鸯菊，花镜谓之双鸾菊，朵头如比邱帽，帽拆内露双鸾并首，形似无二，外分二翼一尾”。亦可作切花（姚德生等，2001）。
乌头野生资源匮乏，生长缓慢，其根头小且需5年后才能采集入药，采用分根繁殖，其繁殖系数很小；而种子萌发率较低，且易变异，性状不稳定，不能满足生产的需要。乌头优良种苗的缺乏已成为制约其快速发展的瓶颈。截至目前，以乌头发根、叶片等为外植体进行愈伤组织的诱导已有一些报道（李昌禹等, 2006；李昌禹等, 2012；Li et al., 2013；刘莉莉等，2015），但存在愈伤组织质量差，分化困难等问题，在离体诱导乌头花托愈伤组织及分化不定芽方面尚未见进展。因此，以花托为外植体，提高乌头愈伤组织诱导率、诱导质量及不定芽分化率，为乌头细胞或基因工程改良提供技术支撑，促进乌头种质创新、获得新品种，将很大程度上促进乌头产业的发展，带来巨大的经济效益。
发明内容
本发明是为了克服现有技术的不足，建立一种乌头花托愈伤组织诱导及分化不定芽方法，提高乌头愈伤组织的诱导率、诱导质量及不定芽分化率，为深入开展乌头生物技术育种研究提供一种新的技术平台。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：首先，选取适合的乌头花托外植体，进行预处理及常规消毒；然后，对外植体进行初始愈伤组织的诱导，获得初始愈伤组织；再次，对初始愈伤组织进行增殖培养，使愈伤组织快速增殖；最后，对增殖的愈伤组织进行不定芽分化诱导，以达到再生的目的。
本发明所述乌头花托愈伤组织诱导及分化不定芽方法包括如下步骤：
1) 花托外植体的选取与消毒：选取直径为1.0～1.3cm的花蕾，4 ℃冰箱预处理2～3d后，常规消毒，剥取无菌花托，花托直径为0.3～0.5cm；
2)启动培养：将无菌花托在启动培养基上暗培养1周，然后转至弱光下培养30～40d，产生初始愈伤组织；弱光下的培养条件为：培养温度23±1℃，光照13 h/d，弱光光照强度800～1000 Lx；所述启动培养基为MS + 2，4-D 0.5～1.0 mg/L + KT 1.0～2.0 mg/L+谷氨酰胺0.2g/L+酪氨酸0.3g/L；
3) 增殖培养：将启动培养获得的愈伤组织，转接到增殖培养基中进行增殖培养；培养条件为：培养温度23±1℃，光照13 h/d，光照强度1500 Lx；所述增殖培养基为MS + 2，4-D 0.5～1.0 mg/L + KT 0.8～1.5 mg/L+ NAA 1.0～1.5mg/L+谷氨酰胺0.2g/L+酪氨酸0.3g/L；
4)不定芽分化培养：将启动培养或增殖培养获得的愈伤组织，转接到不定芽分化培养基上弱光环境培养4 d，然后置于正常环境下培养；所述不定芽分化培养基为MS + ZT1.5～2.0 mg/L + 6-BA 5.0～7.0 mg/L +水解乳蛋白8.0～10.0mg/L。
作为一种优选方案，所述花托直径为0.3～0.5 cm，所述步骤2）中，所述启动培养基为MS + 2，4-D 0.8mg/L + KT 1.5 mg/L+谷氨酰胺0.2g/L+酪氨酸0.3g/L；所述初始愈伤组织培养环境为弱光：光照强度800～1000Lx。
作为一种优选方案，所述步骤3）中，所述增殖培养基为MS + 2，4-D 0.8 mg/L +KT 1.2 mg/L+ NAA 1.2 mg/L +酪氨酸0.3g/L+谷氨酰胺0.2g/L；所述步骤4）中，所述不定芽分化培养基为MS + ZT 1.7 mg/L + 6-BA 6.0 mg/L +水解乳蛋白9.0mg/L。
作为一种优选方案，所述步骤4）中，所述弱光环境培养条件为：培养温度20±1℃，光照13 h/d，光照强度500～600 Lx；所述步骤4）中，所述正常环境培养条件为：培养温度23±1℃，光照13 h/d，光照强度1800 Lx。
上述各种培养基，均以MS为基本培养基，含琼脂5.6g/L、蔗糖28g/L，培养基灭菌前pH为5.8～6.0。
本发明的有益效果在于：采用本发明所述方法，可快速获得大量花托愈伤组织，诱导率高达100%，诱导的愈伤组织采用本发明所述方法诱导分化不定芽，分化率达到93%，从而攻克了乌头愈伤组织诱导率低、诱导质量差及不定芽分化率低这一技术难题，为乌头品种改良和生物技术育种奠定了良好的基础。
附图说明
图1为乌头花托诱导的愈伤组织；图2不定芽分化培养基上获得的不定芽。
具体实施方式
以下实施例用来说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。
以下各实施例中，实验材料为山西乌头、多裂乌头，两个乌头品种的实验结果一致。基本培养基为MS，含琼脂5.6g/L，蔗糖28 g/L，培养基灭菌前pH为5.8～6.0。培养条件为（另有说明的除外）：培养温度23±1℃，光照13 h/d，光照强度1800 Lx。
实施例1花托外植体的选取与消毒
在9～10月份，选取田间直径为1.0～1.2cm含苞欲放的乌头花蕾，4℃冰箱预处理2d，流水冲洗1～2 h，在超净工作台上将花蕾放入75%乙醇30 s，再转入0.15% HgC12溶液中8 min，无菌水冲洗5～6次，用解剖刀剥去花萼、花瓣、雄蕊及雌蕊，切成3～4块备用。
实施例2：不同浓度2，4-D和KT组合对愈伤组织诱导的影响
将经过消毒处理乌头花托切块，然后接种到含有不同浓度2，4-D（0.5, 0.8, 1.0mg/L）和KT（1, 1.5,2.0mg/L)组合的MS培养基上，先暗培养1周，然后转至弱光下（800～1000 Lx）培养。30 d后比较外源激素对愈伤组织诱导的影响。其结果如表1所示：各启动培养基的诱导效果有显著差异，培养基MS + 2，4-D 0.8 mg/L + KT 1.5 mg/L的诱导率最高，诱导质量最好，愈伤组织呈黄绿色、松散颗粒状，且随培养时间的延长逐渐增多，可培养至50 d。因此，乌头花托愈伤组织诱导的最适启动培养基为MS + 2，4-D 0.8 mg/L + KT1.5mg/L，适合的诱导时间为弱光下培养30～50 d。
表1 不同浓度2，4-D、KT对愈伤组织诱导的影响
实施例3 不同外植体对愈伤组织诱导的影响
在植物组织培养中，诱导愈伤组织常用的外植体为叶片、花瓣、花丝、花托、叶柄、茎段。本实施例所用外植体为：叶片，取自植株上部第三个叶；叶柄，取自植株上部第2个叶叶柄；花托，取自小拇指大小的花蕾；花瓣与花丝，取自植株顶部盛花期含苞欲放的花朵花瓣、花丝。将上述外植体分别接种于最适启动培养基（MS + 2，4-D 0.8 mg/L + KT 1.5mg/L+谷氨酰胺0.2g/L+酪氨酸0.3g/L）中进行诱导培养，先暗培养1周，然后转至弱光下（800～1000 Lx）培养30 d，不同外植体的愈伤组织诱导结果如表2所示：外植体为叶柄时，叶柄处膨大出现愈伤组织，诱导率为72%，愈伤组织小；外植体为叶片、花瓣、花丝时，愈伤组织诱导率分别为78%、82%、85%，愈伤组织较小；外植体为花托时，愈伤组织诱导率为100%，且愈伤组织大而疏密适宜。因此，花托是山西乌头、多裂乌头诱导的最佳外植体。
表2 不同乌头外植体对愈伤组织诱导的影响
外植体 叶柄 叶片 花托 花瓣 花丝
愈伤组织诱导率、大小 72%，小 78%，较小 100%，大 82%，较小 85%，较小
实施例4 弱光预处理对愈伤组织分化不定芽的影响
植物再生途径中，愈伤组织分化不定芽是植物间接再生的关键。将在最适启动培养基诱导所得的黄绿色、松散颗粒状初始愈伤组织转接到不定芽分化培养基（MS + ZT 1.7mg/L + 6-BA 6 mg/L +水解乳蛋白9mg/L）上，采用2种培养方案：一种直接在正常环境中培养30d；一种是先弱光环境培养4d，然后在正常环境中培养26d；所述弱光环境培养条件为：培养温度20±1℃，光照13 h/d，光照强度500～600 Lx；所述正常环境培养条件为：培养温度23±1℃，光照13 h/d，光照强度1800 Lx。其结果如表3所示：2种培养方案不定芽诱导率差异很大，先弱光后正常培养的诱导率最高，诱导质量最好。
表3不同环境处理对愈伤组织分化不定芽的影响
培养方案 正常环境 先弱光后正常光照环境
不定芽分化率、质量 74%，质量一般 93%，质量好

Claims (3)

1.一种乌头花托愈伤组织诱导及分化不定芽方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）花托外植体的选取与消毒：选取直径为1.0～1.3cm的花蕾，4 ℃冰箱预处理2～3d后，常规消毒，剥取无菌花托，花托直径为0.3～0.5cm；
2）启动培养：将无菌花托在启动培养基上暗培养1周，然后转至弱光下培养30～40 d，产生初始愈伤组织；弱光下的培养条件为：培养温度23±1℃，光照13 h/d，弱光光照强度800～1000 Lx；所述启动培养基为MS + 2，4-D 0.5～1.0 mg/L + KT 1.0～2.0 mg/L+酪氨酸0.3g/L+谷氨酰胺0.2g/L；
3）增殖培养：将启动培养获得的愈伤组织，转接到增殖培养基中进行增殖培养；培养条件为：培养温度23±1℃，光照13 h/d，光照强度1500 Lx；所述增殖培养基为MS + 2，4-D0.5～1.0 mg/L + KT 0.8～1.5 mg/L+ NAA 1.0～1.5mg/L +酪氨酸0.3g/L+谷氨酰胺0.2g/L；
4）不定芽分化培养：将启动培养或增殖培养获得的愈伤组织，转接到不定芽分化培养基上弱光环境培养4 d，然后置于正常环境下培养；所述不定芽分化培养基为MS + ZT 1.5～2.0 mg/L + 6-BA 5.0～7.0 mg/L +水解乳蛋白8.0～10.0 mg/L；所述弱光环境培养条件为：培养温度20±1℃，光照13 h/d，光照强度500～600 Lx；所述正常环境培养条件为：培养温度23±1℃，光照13 h/d，光照强度1800 Lx。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述花托直径为0.3～0.5 cm，所述步骤2）中，所述启动培养基为MS + 2，4-D 0.8mg/L + KT 1.5 mg/L+谷氨酰胺0.2g/L+酪氨酸0.3g/L；所述初始愈伤组织培养环境为弱光：光照强度800～1000Lx。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中，所述增殖培养基为MS + 2，4-D 0.8 mg/L + KT 1.2 mg/L+ NAA 1.2 mg/L +酪氨酸0.3g/L+谷氨酰胺0.2g/L；所述步骤4）中，所述不定芽分化培养基为MS + ZT 1.7 mg/L + 6-BA 6.0 mg/L +水解乳蛋白9.0mg/L。
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