CN102405830A - 一种月季花托愈伤组织的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种月季花托愈伤组织的诱导方法。该方法包括如下步骤：选取花托外植体并进行预处理及常规消毒；将无菌花托在启动培养基上进行诱导培养，首先暗培养一周，然后转至弱光下培养30～50d，产生初始愈伤组织；将初始愈伤组织，转接到增殖培养基中进行增殖培养。采用本发明所述方法，可快速获得大量花托愈伤组织，诱导率高达100％，从而攻克了月季愈伤组织诱导率低、诱导质量差这一技术难题，为月季品种改良和生物技术育种奠定了良好的基础。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种月季花托愈伤组织的诱导方法。
背景技术
月季(Rosa hybrida L.)是我国最重要的园林植物之一。作为大地景观绿化的重要材料，月季在鲜切花生产与应用中也占有重要位置。在一些重要的观赏植物如兰花上，组织培养技术已开始应用，并大规模商品化生产，同时利用转基因技术向棉花等作物中导入目的基因已经培育出转基因新品系，这为利用转基因技术获得抗逆性强、花色特异的月季新品系提供了可能。自上世纪90年代以来月季组织培养的研究在国内外蓬勃开展，但是至今未能获得根本性的突破。研究表明月季组培苗形成途径主要以愈伤组织脱分化为主，而愈伤组织的质量是脱分化的基础。过氧化物酶是植物体内重要的呼吸酶类，其活性高低与酚类物质代谢、植物抗性密切相关，也有可能与愈伤组织的形成有关。月季体内由于存在较高的过氧化物酶含量，存在愈伤组织较难诱导、诱导率低，形成的愈伤组织质量差等问题，导致月季愈伤组织诱导与再生的研究进展缓慢。截至目前，以月季的叶片、叶柄、茎段为外植体进行愈伤组织的诱导取得了一些定的进展，但在离体诱导月季花托愈伤组织方面尚未见报道，因此，以花托为外植体，提高月季愈伤组织诱导率及诱导质量，将在很大程度上促进月季产业的发展，带来巨大的经济效益。
发明内容
本发明是为了克服现有技术的不足，建立一种月季花托愈伤组织的诱导方法，提高月季愈伤组织的诱导率及诱导质量，为深入开展月季生物技术育种研究提供一种新的技术平台。
本发明所采用的技术方案如下：
首先，选取适合的月季花托外植体，进行预处理及常规消毒；然后，对外植体进行初始愈伤组织的诱导，获得初始愈伤组织；最后，对初始愈伤组织进行增殖培养，以达到使愈伤组织快速增殖的目的。
本发明所述月季花托愈伤组织的诱导方法具体包括如下步骤：
1)花托外植体的选取与消毒：选取直径为0.4～0.6cm的花蕾，4℃冰箱预处理1～3d后，常规消毒，剥取无菌花托；
2)启动培养：将所述无菌花托在启动培养基上进行暗培养7d，然后转至弱光下培养30～50d，产生初始愈伤组织；其中：所述暗培养的培养温度为25±1℃；所述弱光下培养的培养条件为：培养温度25±1℃，光照14h/d，光照强度800～1000Lx；所述启动培养基为MS+2，4-D 4～5.5mg/L+6-BA 0～0.5mg/L；
3)增殖培养：将所述初始培养获得的愈伤组织，转接到增殖培养基中进行增殖培养；所述增殖培养基为MS+2，4-D 2.0～3.0mg/L+6-BA 0.1～0.3mg/L+NAA 1.5～2.5mg/L；培养条件为：培养温度25±1℃，光照14h/d，光照强度1500Lx；。
作为一种优选方案，所述步骤2)中，所述启动培养基为MS+2，4-D 5.0mg/L+6-BA 0.5mg/L。
作为一种优选方案，所述步骤3)中，所述增殖培养基为MS+2，4-D 2.0mg/L+6-BA 0.2mg/L+NAA 2.0mg/L。
上述各种培养基，均以MS为基本培养基，含琼脂5.4g/L、蔗糖30g/L，培养基灭菌前pH为5.8～6.0。
本发明的有益效果在于：采用本发明所述方法，可快速获得大量花托愈伤组织，诱导率高达100％，从而攻克了月季愈伤组织诱导率低、诱导质量差这一技术难题，为月季品种改良和生物技术育种奠定了良好的基础。
附图说明
图1为月季花托在启动培养基上获得的初始愈伤组织。
具体实施方式
以下实施例用来说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。
以下各实施例中，实验材料均为月季“粉和平”和“红帽子”’，两种月季品种的实验结果一致。基本培养基为MS，含琼脂5.4g/L，蔗糖30g/L，培养基灭菌前pH为5.8～6.0。培养条件为(另有说明的除外)：培养温度25±1℃，光照14h/d，光照强度1500Lx。
实施例1花托外植体的选取与消毒
在4～10月份，选取田间直径为0.4～0.6cm、含苞欲放的月季花蕾，4℃冰箱预处理1～2d，流水冲洗1～2h，超净工作台上将花蕾放入70％乙醇30s，再转入0.1％HgCl2溶液中8min，无菌水冲洗3～4次，剥去花萼、花瓣、雄蕊群及雌蕊群，取下花托切成4块备用。
实施例2：启动培养中不同浓度2，4-D和6-BA组合对愈伤组织诱导的影响
将月季的无菌花托切块接种到含有不同浓度6-BA(0，0.3，0.5mg/L)和2，4-D(4.5，5，5.5mg/L)组合的MS启动培养基上先暗培养7d，然后转至弱光下(800～1000Lx)培养。30d后比较外源激素对愈伤组织诱导的影响。其结果如表1所示：各启动培养基的诱导效果有显著差异，其中以培养基MS+2，4-D 5.0mg/L+6-BA 0.5mg/L的诱导率最高，诱导质量最好，愈伤组织呈黄绿色、松散颗粒状(如图1所示)，且随培养时间的延长逐渐增多，可培养至50d。因此，月季花托愈伤组织诱导的最适启动培养基为MS+2，4-D 5.0mg/L+6-BA0.5mg/L，适合的诱导时间为弱光下培养30～50d。
表1不同浓度2，4-D和6-BA组合对愈伤组织诱导的影响
实施例3：不同浓度2，4-D和6-BA组合对愈伤组织增殖的影响
将在最适启动培养基(MS+2，4-D 5.0mg/L+6-BA 0.5mg/L)上诱导所得的黄绿色、松散颗粒状初始愈伤组织转接到增殖培养基(MS+2，4-D 2.0～3.0mg/L+6-BA 0.1～0.3mg/L+NAA 1.5～2.5mg/L)中进行增殖培养，愈伤组织可快速增殖，其中以增殖培养基MS+2，4-D 2.0mg/L+6-BA 0.2mg/L+NAA 2.0mg/L的增殖效果最好(如表2)。
表2不同浓度2，4-D和6-BA对愈伤增殖的影响
实施例4不同外植体对愈伤组织诱导的影响
在植物组织培养中，诱导愈伤组织常用的外植体为叶片、花托、叶柄、茎段。本实施例所用外植体为：叶片，取自植株上部第三个复叶；叶柄，取自植株上部第三个复叶小叶叶柄；花托，取自小拇指大小的花蕾；茎段，取自植株中上部枝条上相邻叶片间的茎段。将上述外植体分别接种于最适启动培养基(MS+2，4-D 5.0mg/L+6-BA 0.5mg/L)中进行诱导培养，先暗培养一周，然后转至弱光下(800～1000Lx)培养30d，不同外植体的愈伤组织诱导结果如表3所示：外植体为叶柄时，叶柄处膨大出现愈伤组织，诱导率为80％，愈伤组织小；外植体为叶片、茎段时，愈伤组织诱导率分别为92％、70％，愈伤组织较小；外植体为花托时，愈伤组织诱导率为100％，且愈伤组织大而疏密适宜。因此，花托是月季‘粉和平’、‘红帽子’愈伤组织诱导的最佳外植体。
表3不同月季外植体对愈伤组织诱导的影响
| 外植体 | 叶柄 | 叶片 | 花托 | 茎段 |
| 愈伤组织诱导率、大小 | 80％，小 | 92％，较小 | 100％，大 | 70％，较小 |
Claims (3)
1.一种月季花托愈伤组织的诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)花托外植体的选取与消毒：选取直径为0.4～0.6cm的花蕾，4℃冰箱预处理1～3d后，常规消毒，剥取无菌花托；
2)启动培养：将所述无菌花托在启动培养基上进行暗培养7d，然后转至弱光下培养30～50d，产生初始愈伤组织；其中：所述暗培养的培养温度为25±1℃；所述弱光下培养的培养条件为：培养温度25±1℃，光照14h/d，光照强度800～1000Lx；所述启动培养基为MS+2，4-D 4～5.5mg/L+6-BA 0～0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.4g/L；
3)增殖培养：将所述初始愈伤组织，转接到增殖培养基中进行增殖培养；所述增殖培养基为MS+2，4-D 2.0～3.0mg/L+6-BA 0.1～0.3mg/L+NAA 1.5～2.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.4g/L；所述增殖培养的培养条件为：培养温度25±1℃，光照14h/d，光照强度1500Lx。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述启动培养基为MS+2，4-D5.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.4g/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述增殖培养基为MS+2，4-D2.0mg/L+6-BA 0.2mg/L+NAA 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.4g/L。
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