CN111374057A - 一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法 - Google Patents

一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法，属于花卉繁殖方法领域。为解决现有耐寒丰花月季繁殖方法效率低、污染性大的问题，本发明提供了一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法，包括以下步骤：一、外植体灭菌处理；二、初代培养；三、增殖培养；四、生根培养；五、驯化移栽。将其用于月季繁殖中，所得月季可在满足能在冬季寒冷地区露地越冬的要求的同时，提高增殖系数和萌芽率，降低污染率。降低繁殖过程中对环境产生的污染。

Description

一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法
技术领域
本发明属于花卉繁殖方法领域，尤其涉及一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法。
背景技术
丰花月季(Rosa floribunda L.)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa L.)的重要观赏植物之一，丰花月季的花色丰富、栽培管理简单，适于在园林绿化中广泛应用且商业价值很高。耐寒丰花月季是近几年培育出的丰花月季新品种系列，具有能够在寒冷地区露地越冬、花期长、耐粗放管理特点，亟需大量的苗木以进入推广应用。目前月季的繁殖技术依旧沿袭了传统的扦插、嫁接等方法。但是，通过一般的扦插繁殖，不仅繁殖速度慢、效率低、种苗易退化，而且成苗率受季节、插穗质量、插穗位置、基质、温度等诸多因素的影响，难以在相对较短的时间内获得大量种苗。而有些月季品种扦插不易生根，繁殖速度受到很大限制。一些新育出和引进的品种，由于数量极少，短期内难以推广。而大量现有的耐寒丰花月季的繁殖方法，在组织培养中，会利用到氯化汞溶液，其具有极大的污染性。
发明内容
为解决上述现有耐寒丰花月季繁殖方法效率低、污染性大的问题，本发明提供了一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法。
本发明的技术方案：
一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法，包括以下步骤：
一、外植体灭菌处理：将所选取的外植体部位，切成2～3cm的小段，每小段带有一个腋芽；用商业洗洁精溶液浸泡外植体15～20min，经流水充分冲洗40min后，将处理后的外植体放入灭菌的烧杯中，用酒精溶液杀菌30～40s，无菌水冲洗3次，将其加入到NaClO溶液中进行灭菌处理，灭菌时间为6～12min，然后用无菌水对其冲洗5次后晾干；
二、初代培养：待外植体表面干燥后，将其接种在1/2MS培养基中，在培养室中培养20～25天；
三、增殖培养：将已经长出的幼苗分别从茎段上切下，并将其接种至增殖培养基J1中，在培养室中进行继代培养，继代培养周期为30天，连续继代3次后，将幼苗移至增殖培养基J2中，进行第4及第5次继代培养；
四、生根培养：将生长到4～5cm丛生苗分离、剪下移入生根培养基中，在培养室中培养20～25天，无菌苗长出白色根须；
五、驯化移栽：直接移栽至苗钵，浇透水放置在保湿培养盒内，保持盒内湿度，15天后打开培养盒的透气孔，30天后去掉外罩，完成组织培养。
进一步的，外植体取材时期为6月和7月，生长旺盛时期；外植体取材为当年生长势健壮的半木质化带芽点的枝条，外植体取材部位为枝条的中部茎段。
进一步的，步骤一所述商业洗洁精溶液的体积百分浓度为0.05％，所述酒精溶液的体积百分浓度为75％，所述NaClO溶液的质量百分比浓度为2％～5％。
进一步的，步骤一所述NaClO溶液的质量百分比浓度最优为4％，NaClO灭菌时间最优为12min。
进一步的，步骤二、步骤三及步骤四所述培养室的培养室内温度为22～25℃，24h中培养室内光照时间为14h、黑暗时间为10h，光照强度为1800～2000Lux。
进一步的，步骤二所述增殖培养基J1的配方为：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7.5g/L，增殖培养基J1的pH值为5.8；所述增殖培养基J2的配方为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7.5g/L，pH值为5.8。
进一步的，步骤三所述将已经长出的幼苗分别从茎段上切下的过程中，要充分保留部分基部。
进一步的，步骤四所述生根培养基的配方为：1/2MS+NAA0.1+蔗糖20g/L+琼脂粉7.5g/L，生根培养基的pH值为5.8。
进一步的，步骤四所述根须为白色，根量为6～7根，根长度为4～5cm。
进一步的，步骤五所述苗钵内蛭石、珍珠岩及草炭土的体积比为1：1：1，苗钵的直径为8～10cm。
本发明的有益效果：
1、本方法将丰花月季的繁殖与当地气候气温相结合，繁殖出的丰花月季可在冬季寒冷地区露地越冬，在保留了丰花月季原有的耐寒性好、花期长、耐粗放管理的优点的同时，改善了传统月季繁殖速度慢、效率低、种苗易于退化的不足。提高了丰花月季幼苗的增殖速度、提高发芽率，提高了繁殖速度，减少了繁殖过程中产生的污染。
2、取材时期选为6月和7月，外植体取材为当年生长势健壮的半木质化带芽点的枝条，外植体取材部位为枝条的中部茎段。可达到外植体萌芽率较高、污染率较小的有益效果，在有利于外植体后期生长的同时可降低污染。
3、选用质量百分比浓度为4％的NaClO溶液进行灭菌，灭菌时间为12min，可在达到较好的灭菌效果的同时，达到外植体发芽率较高、污染率较低的有益效果。同时本方法用NaClO溶液代替了HgCl2溶液进行消毒，降低了消毒过程中的污染性。
4、本方法选用的增殖培养基J、增殖培养基J2、生根培养基的配方保证了幼苗培养具有较高的增殖系数和稳定性，进一步提高了丰花月季的繁殖效率。
5、苗钵选用蛭石、珍珠岩及草炭土作为基质，提高幼苗成活率幼苗成活率可达98％以上，并可缩短驯化时间2～3天，进一步提高了丰花月季的繁殖效率。
附图说明
图1为实施例1所述初代培养5天观察结果示意图；
图2为实施例1所述初代培养5天观察结果示意图；
图3为实施例1所述将幼苗接种至增殖培养基J1示意图；
图4为实施例1所述将继代培养三次后幼苗接种至增殖培养基J2示意图；
图5为实施例1所述生根培养前将丛生苗接种至生根培养基示意图；
图6为实施例1所述生根培养后丛生苗长出的白色根须示意图；
图7为实施例1所述苗钵示意图；
图8为实施例1所述培养盒示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
一、外植体灭菌处理：取6月所取的当年生长势健壮的半木质化带芽点的枝条的中部茎段，切成2cm的小段，茎段下放斜切约45度角，每小段带有1个腋芽。用体积百分浓度为0.05％商业洗洁精溶液浸泡外植体20min，用纱布包好后，将其经流水充分冲洗40min，放入经灭菌过的烧杯，用75％的酒精杀菌40s，无菌水冲洗3次。将处理后的外植体加入NaClO中灭菌，NaClO的浓度为4％，灭菌时间为12min。处理过后，用无菌水对其冲洗5次后晾干。
二、初代培养：将所得外植体接种在1/2MS培养基中，培养室内温度为24℃，每24h中培养室内光照时间为14h，培养室内黑暗时间10h，光照强度为2000勒克斯(Lux)。分时段观察外植体，初代培养第5天观察结果如图1所示，初代培养第15天观察结果如图2所示。培养15天后，观察外植体萌芽和污染情况，并按下列计算公式计算萌芽率及污染率，重复3次实验，取平均值，统计结果见表一、表二、表三。
污染率＝(污染外植体数/接种外植体数)×100％
萌发率＝(萌发外植体数/接种外植体数)×100％
三、增殖培养：将初代培养20天后已经长出的幼苗分别从茎段上切下，要充分保留部分基部，接种到增殖培养基J1：MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.05 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7.5g/L pH5.8，如图3所示。培养室内温度为24℃，每24h中培养室内光照时间为14h，培养室内黑暗时间10h，光照强度为2000勒克斯(Lux)，继代周期为30天，继代培养3次后，将幼苗接种在增殖培养基J2：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7.5g/L上，进行第4次及第5次连续继代培养，如图4所示。对所得幼苗的增殖系数和茎长的观察如表四、表五、表六所示。
四、生根培养：将生长到4～5cm的丛生苗分离、剪下移入生根培养基中，培养基配方：1/2MS+NAA0.1+蔗糖20g/L+琼脂粉7.5g/L；pH5.8，如图5所示，培养室内温度为22～25，℃一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内黑暗时间10小时，光照强度为1800～2000勒克斯(Lux)，培养24天，丛生苗无菌，长出白色根须，如图6所示。根量6～7根，根长度为4～5cm为宜，生根率达100％，植株生长旺盛。
五、驯化移栽：提前准备好培养土和苗钵，用温水洗掉生根苗基部培养基，直接移栽至苗钵并放置在保湿培养盒内，放置在培养室内，保持盒内湿度，15天后打开培养盒的透气孔，30天后去掉外罩，计算成活率，完成组织培养。所述苗钵的直径为8～10cm，苗钵内的基质为混合基质，基质内含有蛭石、珍珠岩及草炭，蛭石、珍珠岩及草炭的体积比为1：1：1。苗钵如图7所示，培养盒如图8所示。观察基质上生根苗的成活率，统计结果见表七。
实施例2
实施例2与实施例1的区别仅在于取材时期为7月。
对比例1
对比例1与实施例1的区别仅在于取材时期为5月。
对比例2
对比例2与实施例1的区别仅在于取材时期为8月。
表一 不同取材时期对萌芽率和污染率的影响
Figure BDA0002465406070000041
Figure BDA0002465406070000051
由表一可以观察出，实施例1、实施例2及对比例2的萌芽率较高，实施例1、实施例2及对比例1的污染率较低，综合以上两个结果，实施例1及实施例2，即在6月及7月所取的外植体可在保证萌芽率高的同时，达到低污染的效果。
实施例3
实施例3与实施例1的区别仅在NaClO的浓度为2％。
对比例3
对比例3与实施例1的区别仅在于NaClO的浓度为6％。
实施例4
实施例4与实施例1的区别仅在于NaClO灭菌时间为10min。
实施例5
实施例5与实施例1的区别仅在于NaClO灭菌时间为8min。
表二 不同NaClO浓度污染率及萌芽率的影响(灭菌处理时间为12min)
处理 NaClO浓度 污染率(％) 萌芽率
实施例1 4％ 10.00±10.00bc 93.33±5.77a
实施例3 2％ 13.33±5.77bc 86.67±5.77a
对比例3 6％ 3.33±5.77c 6.67±5.77d
表三 不同灭菌处理时间对污染率及萌芽率的影响(NaClO浓度的4％)
处理 处理时间 污染率(％) 萌芽率
实施例1 12min 10.00±10.00bc 93.33±5.77a
实施例4 10min 16.67±15.28bc 83.33±15.28a
实施例5 8min 16.67±5.77bc 83.33±5.77a
由表二可以观察出，灭菌处理时间相同时，NaClO浓度在2％～6％范围内，浓度越高，污染率越低。对比例3的萌芽率极低，其原因是消毒剂的浓度较大，对外植体的伤害较大，不利于外植体的后期生长。因此NaClO浓度为6％不予采纳，而通过对实施例1及实施例3的观察，NaClO浓度越高，萌芽率越高。综上所述4％为NaClO的最佳浓度选择。
由表三可以观察出，相同的NaClO浓度时，处理时间越长，污染率越小，萌芽率越高。因此12mim为最优的灭菌处理时间。
综上所述，外植体灭菌处理的NaClO灭菌处理过程中，4％为NaClO的最佳浓度选择、12mim为最佳的灭菌处理时间。当采用4％NaClO溶液进行灭菌处理12min时，可达到最好的NaClO灭菌处理效果，污染率最低，萌芽率最高。
对比例4
对比例4与实施例1的区别仅在于增殖培养基的配方与增殖培养基J1的配方不同，具体为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，pH5.8。
对比例5
对比例5与实施例1的区别仅在于增殖培养基的配方与增殖培养基J1的配方不同，具体为：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，pH5.8。
对比例6
对比例6与实施例1的区别仅在于增殖培养基的配方与增殖培养基J1的配方不同，具体为：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，pH5.8。
对比例7
对比例7与实施例1的区别仅在于增殖培养基的配方与增殖培养基J1的配方不同，具体为：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.15mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，pH5.8。
对比例8
对比例8与实施例1的区别仅在于，增殖培养以增殖培养基J1进行连续继代培养1次后结束。对所得幼苗的增殖系数和茎长的观察如表五所示。
对比例9
对比例9与实施例1的区别仅在于，增殖培养以增殖培养基J1进行连续继代培养2次后结束。对所得幼苗的增殖系数和茎长的观察如表五所示。
对比例10
对比例10与实施例1的区别仅在于，增殖培养以增殖培养基J1进行连续继代培养4次后结束。对所得幼苗的增殖系数和茎长的观察如表五所示。
对比例11
对比例11与实施例1的区别仅在于，增殖培养以增殖培养基J1进行连续继代培养5次后结束。对所得幼苗的增殖系数和茎长的观察如表五所示。
对比例12
对比例12与实施例1的区别仅在于，增殖培养以增殖培养基J1进行连续继代培养6次后结束。对所得幼苗的增殖系数和茎长的观察如表五所示。
对比例13
对比例13与实施例1的区别仅在于，继代培养3次后，将幼苗接种在增殖培养基：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7.5g/L上，进行第4次及第5次连续继代培养。
对比例14
对比例14与实施例1的区别仅在于，继代培养3次后，将幼苗接种在增殖培养基：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7.5g/L上，进行第4次及第5次连续继代培养。
表四 不同培养基配方下培养的幼苗的增殖和生长情况
处理 6-BA(mg/L) NAA(mg/L) 增殖系数 茎长(cm)
实施例1 1.5 0.05 6.1 5.8
对比例4 1.0 0.05 1.5 2.8
对比例5 0.5 0.05 1.2 2.6
对比例6 1.5 0.1 4.5 5.6
对比例7 1.5 0.15 3.2 4.3
增殖培养主要对初代诱导出的腋芽从茎段上分离，并诱导增殖，提高增殖倍数。分化出的腋芽长至5～6cm时，约25～30天，将腋芽切下，有多个生长点的可以分离，同时较长带芽点茎段又可以单独接种在增殖培养基中。
根据实际情况，培养基中6-BA的浓度范围为0.5～1.5mg/L、NAA的浓度范围为0.05～0.15mg/L。由表四的实施例1、对比例4、对比例5可以观察出，NAA含量相同时，在满足浓度范围的情况下6-BA的含量越高，该配方下培养的幼苗的增殖系数越高、茎长越长、长势越好；由表四的实施例1、对比例6及对比例7可以观察出，6-BA的含量相同时，在满足浓度范围的情况下NAA的含量越少，该配方下培养的幼苗的增殖系数越高、茎长越长、长势越好。因此实施例5的增殖培养基J1的配方MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，pH5.8为为最优配方，该配方下培养的幼苗增殖系数最高且茎长最长，长势最好，同时茎间缩短、紧密，为后续进一步继代繁殖加大增殖系数打下良好基础。
表五 不同继代系数所得幼苗的增殖系数和茎长
Figure BDA0002465406070000071
Figure BDA0002465406070000081
由表五可以观察出，随着继代次数的增加增殖系数逐渐增大，到继代3～4次，达到最大，前三次的增殖系数累计可以达到16幼苗长势健康。在继代4次时增殖系数及茎长的长势减缓，继代5次植株生长转慢、长势和增殖系数显著下降。继代6次时，植株生长转慢明显、长势和增殖系数显著下降。因此连续继代培养6次的方案不可行，一个完整的增殖培养过程需要连续继代5次。而实施例1的连续继代3次为最优方案，其所得幼苗增殖系数高，茎长长，长势好。
表六 不同增殖培养基配方下幼苗的增殖系数
处理 6-BA(mg/L) NAA(mg/L) 增殖系数
实施例1 0.5 0.05 6.10±0.15a
对比例13 1.0 0.05 4.80±0.1b
对比例14 2.0 0.05 4.51±0.06b
因为一个完整的增殖培养过程需要连续继代5次，所以在第4次继代及第5次继代时需对继代培养基进行更进一步优化。由表六可以观察出，NAA浓度相同时，6-MB的浓度越低，所得幼苗的增至系数越高。第4次继代及第5次继代选用增殖培养基J2：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7.5g/L可得到长势最好的幼苗。
对比例15
对比例15与实施例1的区别仅在于，苗钵内的基质为蛭石。
对比例16
对比例16与实施例1的区别仅在于，苗钵内的基质为草炭。
对比例17
对比例17与实施例1的区别仅在于，苗钵内的基质为蛭石及园土。蛭石与园土的体积比为1：1。
对比例18
对比例18与实施例1的区别仅在于，苗钵内的基质为蛭石及、珍珠岩园土。蛭石、珍珠岩及园土的体积比为1：1：1。
表七 不同同基质上生根苗的成活率
处理 基质 成活率
实施例1 蛭石：珍珠岩：草炭＝1：1：1 98.67±5.77a
对比例15 蛭石 76.67±11.55b
对比例16 草炭 63.33±5.77bc
对比例17 蛭石：园土＝1：1 53.33±5.77c
对比例18 蛭石：珍珠岩：园土＝1：1：1 40.00±10.00c
由表七可以观察出，不同基质对生根苗移栽成活率的影响是比较显著的。生根苗在单一基质蛭石中的成活率为76.67％，在单一基质草炭中的成活率为70.00％，单一基质中蛭石较草炭移栽成活率更高。若在基质蛭石中加入园土，则会降低生根苗的成活率。混合基质中蛭石：珍珠岩：草炭＝1：1：1的成活率最高，且在98％以上，叶绿且长势良好，并且以此作为苗钵的基质可缩短驯化时间2～3天。混合基质中加入园土，透气性降低，会显著降低成活率，植株长势较差且叶黄，成活率低至40.00％。

Claims (10)

1.一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
一、外植体灭菌处理：将所选取的外植体部位，切成2-3cm的小段，每小段带有一个腋芽；用商业洗洁精溶液浸泡外植体15～20min，经流水充分冲洗40min后，将处理后的外植体放入灭菌的烧杯中，用酒精溶液杀菌30～40s，无菌水冲洗3次，将其加入到NaClO溶液中进行灭菌处理，灭菌时间为6～12min，然后用无菌水对其冲洗5次后，用灭菌的滤纸吸干表面水分；
二、初代培养：待外植体表面干燥后，将其接种在1/2MS培养基中，在培养室中培养20～25天；
三、增殖培养：将已经长出的幼苗分别从茎段上切下，并将其接种至增殖培养基J1中，在培养室中进行继代培养，继代培养周期为30天，连续继代3次后，将幼苗移至增殖培养基J2中，进行第4及第5次继代培养；
四、生根培养：将生长到4～5cm丛生苗分离、剪下移入生根培养基中，在培养室中培养20～25天，无菌苗长出白色根须；
五、驯化移栽：直接移栽至苗钵，浇透水放置在保湿培养盒内，保持盒内湿度，15天后打开培养盒的透气孔，30天后去掉外罩，完成组织培养。
2.根据权利要求1所述一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法，其特征在于，外植体取材时期为6月和7月，生长旺盛时期；外植体取材为当年生长势健壮的半木质化带芽点的枝条，外植体取材部位为枝条的中部茎段。
3.根据权利要求2所述一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法，其特征在于，步骤一所述商业洗洁精溶液的体积百分浓度为0.05％，所述酒精溶液的体积百分浓度为75％，所述NaClO溶液的质量百分比浓度为2％～5％。
4.根据权利要求3所述一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法，其特征在于，步骤一所述NaClO溶液的质量百分比浓度最优为4％，NaClO灭菌时间最优为12min。
5.根据权利要求4所述一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法，其特征在于，步骤二、步骤三及步骤四所述培养室的培养室内温度均为22～25℃，24h中培养室内光照时间均为14h、黑暗时间均为10h，光照强度均为1800～2000Lux。
6.根据权利要求5所述一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法，其特征在于，步骤二所述增殖培养基J1的配方为：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7.5g/L，增殖培养基J1的pH值为5.8；所述增殖培养基J2的配方为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7.5g/L，pH值为5.8。
7.根据权利要求6所述一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法，其特征在于，步骤三所述将已经长出的幼苗分别从茎段上切下的过程中，要充分保留部分基部。
8.根据权利要求7所述一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法，其特征在于，步骤四所述生根培养基的配方为：1/2MS+NAA0.1+蔗糖20g/L+琼脂粉7.5g/L，生根培养基的pH值为5.8。
9.根据权利要求8所述一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法，其特征在于，步骤四所述根须为白色，根量为6～7根，根长度为4～5cm。
10.根据权利要求9所述一种耐寒丰花月季环保高效微繁殖方法，其特征在于，步骤五所述苗钵内蛭石、珍珠岩及草炭土的体积比为1：1：1，苗钵的直径为8～10cm。
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