CN104396743B - 一种甜瓜的快速繁殖方法及应用 - Google Patents

一种甜瓜的快速繁殖方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甜瓜的快速繁殖方法及应用，属于植物组织培养技术领域。本发明所提供的方法是将甜瓜种子经过剥壳灭菌后切成胚块，在依次经过启动培养、不定芽培养、伸长培养和生根培养后，再对所得植株进行驯化，最终获得甜瓜再生苗。本发明所提供的方法能够明显提高了甜瓜的繁殖系数、再生频率和外植体再生芽数。同时，相比于传统方法，可缩短培育周期13天。

Description

一种甜瓜的快速繁殖方法及应用
技术领域
本发明涉及一种甜瓜的快速繁殖方法及应用，属于植物组织培养技术领域。
背景技术
甜瓜(CucumismeloL.)是葫芦科黄瓜属一年生蔓性草本植物，茎被短刚毛。卷须不分叉，叶柄有短刚毛；叶片近圆形或肾形，长宽均8-15厘米，边缘有锯齿。雌雄同株，花萼裂片，花冠黄色，裂片卵状矩圆形，果实的形状、颜色因品种而已，有香味，果皮平滑，种子呈白色。果实作为水果或蔬菜，瓜蒂和种子可药用，广泛栽培于温带至热带地区。
目前，国内外对于甜瓜的快速繁殖的研究主要是通过对甜瓜组织进行离体培养，进而获得再生植株。国内目前已经能够通过子叶、带牙茎段、真叶、胚轴和茎尖等多种外植体诱导再生出植株。如张大力从甜瓜子叶愈伤组织诱导获得再生植株、蔡润等分别利用甜瓜的生长点、子叶、下胚轴为外植体进行离体培养，成功得到再生植株。国外已建立的甜瓜离体再生体系包括子叶、真叶、下胚轴和茎等。如Niedz等人以幼龄甜瓜子叶为外植体，成功建立了4个厚皮甜瓜基因型的再生体系。虽然，现有技术已经能够通过离体组织培养获得再生植株，但现有方法均存在繁殖周期长、繁殖系数不高，成活率低以及成本高等问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种甜瓜的快速繁殖方法，所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种甜瓜的快速繁殖方法，该方法是将甜瓜种子经过剥壳灭菌后切成胚块，在依次经过启动培养、不定芽培养、伸长培养和生根培养后，再对所得植株进行驯化，最终获得甜瓜再生苗。
所述方法的步骤如下：
1)将甜瓜的种子剥壳，灭菌后切成胚块；
2)将步骤1)中所得胚块放到启动培养基中培养，获得启动培养胚块；
3)将步骤2)中所得的启动培养胚块，转移到不定芽培养基中培养，获得不定芽培养胚块；
4)将步骤3)所得的不定芽培养胚块转移到伸长培养基中培养，获得伸长培养胚块；
5)去除步骤4)所得的伸长培养胚块的不定芽，并移植到生根培养基中培养，获得再生植株；
6)驯化步骤5)所得的再生植株，获得甜瓜再生苗。
其中，步骤1)所述灭菌，是用70％体积分数的酒精灭菌30s，再用0.05％质量分数的升汞消毒；所述切成胚块，是去除胚子叶前端和胚根部分。
步骤2)所述启动培养，启动培养基组成为：1/8MS基本培养基+BA2.0mg/L+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为，28℃下，暗培养1-2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天27-29℃，晚上24-26℃，黑暗7-9h/d，光照15-17h/d，光照强度为1800-2200Lx，培养时间为10d。
步骤3)所述不定芽培养，不定芽培养基组成为：MS基本培养基+BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx，培养时间为20天。
步骤4)所述伸长培养基，组成为：MS基本培养基+BA0.05mg/L+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为，28℃下，暗培养2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天27-29℃，晚上24-26℃，黑暗7-9h/d，光照15-17h/d，光照强度为1800-2200Lx，培养时间为20天。
步骤5)所述生根培养基，组成为：MS基本培养基+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：28℃下，暗培养2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天27-29℃，晚上24-26℃，黑暗7-9h/d，光照15-17h/d，光照强度为1800-2200Lx，培养时间为10天。
所述方法的具体步骤如下：
1)将甜瓜的种子剥壳，用70％体积分数的酒精灭菌30s，再用0.05％质量分数的升汞消毒，再去除胚子叶前端和胚根部分，获得甜瓜胚块；
2)将步骤1)中所得胚块放到启动培养基中培养，培养条件为，28℃暗培养2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx,光照条件，培养10天，获得启动培养胚块；
所述启动培养基的组成是：1/8MS基本培养基+BA2.0mg/L+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；
3)将步骤2)所得的启动培养胚块均匀切成四小块，并转移到不定芽培养基中培养，培养条件为：白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx，培养时间为20天，获得不定芽培养胚块；
所述不定芽培养基组成为：MS基本培养基+BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；
4)将步骤3)所得的不定芽培养胚块转移到伸长培养基中培养，培养条件为：白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx，培养20天，获得伸长培养胚块；
所述伸长培养基的组成是：MS基本培养基+BA0.05mg/L+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；
5)去除步骤4)所得伸长胚块中长于3cm的不定芽并移植到生根培养基中，白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx光照条件，培养10天，获得再生植株；
所述生根培养基，组成是：MS基本培养基+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；
6)将步骤5)中获得的再生植株进行修剪后，栽植到营养土中驯化，获得甜瓜再生苗。
所述方法用于甜瓜的遗传育种和快速繁殖。
本发明有益效果：
1，提高繁殖系数，能在短时间获得较多的组培苗。
2，为甜瓜离体再生开辟了新的方法，大大解决甜瓜组组培苗再生率低的问题。
3，大大缩短了甜瓜的繁殖周期。
附图说明
图1为实施例1再生植株的培养过程；
(A，种子接种到培养基中出苗；B,C切好的子叶节接种到启动培养基中；D，30天后产生不定芽；E,不定芽在伸长培养基上一周；F，再生植株在生根培养基上生根；G，再生苗)。
图2为实施例2中甜瓜种子去皮切胚。
图3为实施例2中切好的胚块在启动培养基中培养。
图4为实施例2中在启动培养基胚块放在不定芽培养基中培养。
图5为实施例2中胚块在伸长培养基中培养。
图6为实施例2中再生植株的移栽成活。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例所用的材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中常规的材料、试剂、仪器和方法。
实施例1
本实施例提供了一种传统的繁殖甜瓜的方法，步骤如下：
1.无菌苗的培养，取上述籽粒饱满、大小均一的甜瓜种子，温汤浸种4～5h，流水冲洗，在超净工作台上先用75％酒精浸泡1min，再用0.1％HgCl2溶液浸泡10～15min，其间轻轻摇动，最后用无菌水冲洗5～6次，将种子平放于1/2MS培养基(每升含蔗糖30g、琼脂7g，pH值5.8)。28℃暗培养1～2d，50％种子露白后转至光下培养:25℃，光照16h/d，黑暗8h/d，光照强度为2000lx，培养时间为5d。
2.不定芽的诱导，取5d左右两片子叶脱离种皮、但未完全张开的甜瓜无菌苗，切去生长点及下胚轴，两片子叶均切去上半部分(1/2～1/3)，留取子叶下半部分，将子节叶接种于芽诱导培养基:M1(MS+0.5mg/L6-BA+0mg/LIAA)、M2(MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LIAA)、M3(MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LIAA)、M4(MS+1.0mg/L6-BA+0mg/LIAA)、M5(MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LAA)、M6(MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LIAA)、M7(MS+1.5mg/L6-BA+0mg/LIAA)、M8(MS+1.5mg/L6-BA+0.1mg/LAA)、M9(MS+1.5mg/L6-BA+0.5mg/LIAA)、M11(MS+2.0mg/L6-BA+0mg/LIAA)。M10(MS+2.0mg/L6-BA+0.1mg/LIAA)、M10(MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LIAA)每个处理设3次重复，每次重复10个外植体。培养条件:温度25℃，光照16h/d，黑暗8h/d，光照强度为2000lx。每7～10d继代一次，30d后统计不定芽数目，计算再生频率和每外植体再生芽数。
3.不定芽的伸长，以CM-15甜瓜自交系为试材，从子叶节外植体上将诱导出的丛生芽切下，接种于伸长培养基:E0(MS)、E1(MS+0.01mg/L6-BA)、E2(MS+0.05mg/L6-BA)、E3(MS+0.1mg/L6-BA)、E4(MS+0.15mg/L6-BA)，15d后统计芽的伸长量。每个处理设3次重复，每次重复8个外植体。培养条件及数据处理方法同上。
4.不定根的诱导将伸长良好、生长健壮的小苗从基部切下，转接到生根培养基(MS)上进行生根培养，培养条件与伸长培养条件相同。
实施例2
本实施了提供了一种根据本发明技术方案进行甜瓜快速繁殖的方法，步骤如下：
(1)取材灭菌，将甜瓜种子剥去壳后。用70％酒精灭菌30s,再用0.05％升汞消毒10分钟，在超净工作台上用灭菌水洗3－4次。每次泡1分钟。灭菌完成后，用刀片去除胚子叶前端和胚根部分(如图2所示)。
(2)启动培养，将灭菌后切好的胚块放在启动培养基中培养。首先在28℃下暗培养2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx,光照条件，培养10天。培养基组成为1/8MS+BA2.0mg/L+IAA0.1mg/L，琼脂中(其中每升含蔗糖30g、琼脂7.5g，pH值5.8)，培养时间为10d(如图3所示)，获得启动培养胚块。
(3)不定芽培养，将步骤(2)所得的所得的启动培养胚块均匀切成四小块，并转移到不定芽培养基中培养，培养条件为：白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx，培养时间为20天，获得不定芽培养胚块；
其中不定芽培养基组成为：MS基本培养基+BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8，然后转移到MS+BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L见有不定芽丛长出后，转移到伸长培养基中MS+BA0.05mg/L+IAA0.1mg/L。图4为在启动培养基培养20天的胚块。
(4)伸长培养，将启动培养获得的胚块均匀切成四小块，转移到伸长培养基中培养(图5)。培养条件为：白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx，培养20天，获得伸长培养胚块。
(5)去除步骤4)所得伸长胚块中长于3cm的不定芽并移植到生根培养基中，培养条件为：白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx光照条件，培养10天，获得再生植株；
所述生根培养基，组成是：MS基本培养基+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8。
(6)再生植株驯化，将生根的甜瓜苗取出，适当修剪，然后栽植到营养土蛭石：草炭＝1:1中，注意保温保湿，2周后与实生苗长势相同(图6)。
实施例3
本实施了提供了另外一种根据本发明技术方案进行甜瓜快速繁殖的方法，步骤如下：
(1)取材灭菌，将甜瓜种子剥去壳后。用70％酒精灭菌30s,再用0.05％升汞消毒10分钟，在超净工作台上用灭菌水洗3－4次。每次泡1分钟。灭菌完成后，用刀片去除胚子叶前端和胚根部分。
(2)启动培养，将灭菌后切好的胚块放在启动培养基中培养。首先在28℃下暗培养1d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天28℃，晚上25℃，黑暗9h/d，光照15h/d，光照强度为2200Lx,光照条件，培养10天。培养基组成为1/8MS+BA2.0mg/L+IAA0.1mg/L，琼脂中(其中每升含蔗糖30g、琼脂7.5g，pH值5.8)，培养时间为10d，获得启动培养胚块。
(3)不定芽培养，将步骤(2)所得的所得的启动培养胚块均匀切成四小块，并转移到不定芽培养基中培养，培养条件为：白天28℃，晚上25℃，黑暗9h/d，光照15h/d，光照强度为2200Lx，培养时间为20天，获得不定芽培养胚块；
其中不定芽培养基组成为：MS基本培养基+BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8，然后转移到MS+BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L见有不定芽丛长出后，转移到伸长培养基中MS+BA0.05mg/L+IAA0.1mg/L。
(4)伸长培养，将启动培养获得的胚块均匀切成四小块，转移到伸长培养基中培养。培养条件为：白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx，培养20天，获得伸长培养胚块。
(5)生根培养，去除步骤4)所得伸长胚块中长于3cm的不定芽并移植到生根培养基中，培养条件为：白天28℃，晚上24℃，黑暗9h/d，光照15h/d，光照强度为2200Lx光照条件，培养10天，获得再生植株；
所述生根培养基，组成是：MS基本培养基+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8。
(6)再生植株驯化，将生根的甜瓜苗取出，适当修剪，然后栽植到营养土蛭石：草炭＝1:1中，注意保温保湿，2周后与实生苗长势相同。
实施例4
本实施了提供了另外一种根据本发明技术方案进行甜瓜快速繁殖的方法，步骤如下：
(1)取材灭菌，将甜瓜种子剥去壳后。用70％酒精灭菌30s,再用0.05％升汞消毒10分钟，在超净工作台上用灭菌水洗3－4次。每次泡1分钟。灭菌完成后，用刀片去除胚子叶前端和胚根部分。
(2)启动培养，将灭菌后切好的胚块放在启动培养基中培养。首先在28℃下暗培养2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx,光照条件，培养10天。培养基组成为1/8MS+BA2.0mg/L+IAA0.1mg/L，琼脂中(其中每升含蔗糖30g、琼脂7.5g，pH值5.8)，培养时间为10d，获得启动培养胚块。
(3)不定芽培养，将步骤(2)所得的所得的启动培养胚块均匀切成四小块，并转移到不定芽培养基中培养，培养条件为：白天28℃，晚上25℃，黑暗7h/d，光照17h/d，光照强度为1800Lx，培养时间为20天，获得不定芽培养胚块；
其中不定芽培养基组成为：MS基本培养基+BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8，然后转移到MS+BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L见有不定芽丛长出后，转移到伸长培养基中MS+BA0.05mg/L+IAA0.1mg/L。
(4)伸长培养，将启动培养获得的胚块均匀切成四小块，转移到伸长培养基中培养。培养条件为：白天28℃，晚上25℃，黑暗7h/d，光照17h/d，光照强度为1800Lx，培养20天，获得伸长培养胚块。
(5)生根培养，去除步骤4)所得伸长胚块中长于3cm的不定芽并移植到生根培养基中，培养条件为：白天28℃，晚上26℃，黑暗7h/d，光照17h/d，光照强度为1800Lx光照条件，培养10天，获得再生植株；
所述生根培养基，组成是：MS基本培养基+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8。
(6)再生植株驯化，将生根的甜瓜苗取出，适当修剪，然后栽植到营养土蛭石：草炭＝1:1中，注意保温保湿，2周后与实生苗长势相同。
实施例5
本实施例对实施例1-4所提供的方法的效果进行了测定。对甜瓜再生植株培育过程中，繁殖系数、再生频率、外植体再生芽数及培植周期进行了测定和统计，结果见表1。
表1实施例1-4方法培植再生植株的效果
繁殖系数 再生频率 外植体再生芽数 培植周期
实施例1 3 70 3 67d
实施例2 5 90 6 54d
实施例3 6 85 7 54d
实施例4 8 88 6 54d
从表1可知，本发明所提供的方法在繁殖系数、再生频率及外植体再生芽数方面明显优于传统方法，而培植周期却比传统方法短13天。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (2)

1.一种甜瓜的快速繁殖方法，其特征在于，步骤如下：
1)将甜瓜的种子剥壳，灭菌后切成胚块；所述灭菌，是用体积分数70％的酒精灭菌30s，再用质量分数0.05％的升汞消毒；所述切成胚块，是去除胚子叶前端和胚根部分；
2)将步骤1)中所得胚块放到启动培养基中培养，获得启动培养胚块；所述放到启动培养基中培养，所用启动培养基组成为：1/8MS基本培养基+BA2.0mg/L+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为，28℃下，暗培养1-2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天27-29℃，晚上24-26℃，黑暗7-9h/d，光照15-17h/d，光照强度为1800-2200Lx，培养时间为10d；
3)将步骤2)中所得的启动培养胚块，转移到不定芽培养基中培养，获得不定芽培养胚块；所述转移到不定芽培养基中培养，所用不定芽培养基组成为：MS基本培养基+BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx，培养时间为20天；
4)将步骤3)所得的不定芽培养胚块转移到伸长培养基中培养，获得伸长培养胚块；所述转移到伸长培养基中培养，所用伸长培养基组成为：MS基本培养基+BA0.05mg/L+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：28℃下，暗培养2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天27-29℃，晚上24-26℃，黑暗7-9h/d，光照15-17h/d，光照强度为1800-2200Lx，培养时间为20天；
5)去除步骤4)所得的伸长培养胚块的不定芽，并移植到生根培养基中培养，获得再生植株；所述移植到生根培养基中培养，所用生根培养基组成为：MS基本培养基+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：28℃下，暗培养2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天27-29℃，晚上24-26℃，黑暗7-9h/d，光照15-17h/d，光照强度为1800-2200Lx，培养时间为10天；
6)驯化步骤5)所得的再生植株，获得甜瓜再生苗。
2.权利要求1所述方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)将甜瓜的种子剥壳，用70％体积分数的酒精灭菌30s，再用质量分数0.05％的升汞消毒，再去除胚子叶前端和胚根部分，获得甜瓜胚块；
2)将步骤1)中所得胚块放到启动培养基中培养，培养条件为：28℃暗培养2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx，培养10天，获得启动培养胚块；
所述启动培养基的组成为：1/8MS基本培养基+BA2.0mg/L+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；
3)将步骤2)所得的启动培养胚块均匀切成四小块，并转移到不定芽培养基中培养，培养条件为：白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx，培养时间为20天，获得不定芽培养胚块；
所述不定芽培养基组成为：MS基本培养基+BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；
4)将步骤3)所得的不定芽培养胚块转移到伸长培养基中培养，培养条件为：白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx，培养20天，获得伸长培养胚块；所述伸长培养基的组成是：MS基本培养基+BA0.05mg/L+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；
5)去除步骤4)所得伸长胚块中长于3cm的不定芽并移植到生根培养基中培养，培养条件为：白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx，培养10天，获得再生植株；所述生根培养基，组成是：MS基本培养基+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；
6)将步骤5)中获得的再生植株进行修剪后，栽植到营养土中驯化，获得甜瓜再生苗。
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