CN106212275A - 一种乌头附子种苗组织培养快繁再生方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乌头附子种苗组织培养快繁再生方法，以乌头带腋芽茎段、茎段、无菌叶片和种子为外植体，通过消毒条件、芽诱导、芽增殖、生根及移栽、愈伤组织诱导、增殖及分化等环节建立优化乌头的快速繁殖体系、种子无菌培养和再生体系，为工厂化育苗提供技术支撑；包括：乌头快速繁殖方法、乌头再生繁殖方法和乌头快速育苗方法；乌头快速繁殖方法包括：乌头茎段快速繁殖方法和种子快速繁殖方法；乌头再生繁殖方法包括：乌头茎段和不定根为外植体的再生繁殖方法、乌头无菌叶片为外植体的再生繁殖方法。本发明可以显著提高乌头快繁育苗的效率及缩短育苗周期，为乌头快繁育苗的生产应用提供了技术支撑，并解决好目前市场上种苗繁育问题。

Description

一种乌头附子种苗组织培养快繁再生方法

技术领域

本发明属于乌头繁殖技术领域，尤其涉及一种乌头附子种苗组织培养快繁再生方法。

背景技术

附子(Radix Aconiti Lateralis Preparata)是毛茛科植物乌头(AconitumcarmichaeliiDebx.)的子根，味辛、甘，性大热；有毒；归心、肾、脾经、具回阳救逆，补火就阳，逐风寒湿邪功能。它适用于亡阳虚脱，肢冷脉微，阳痿，宫冷，虚寒吐泻，阴寒水肿，寒湿痹痛，心腹冷痛，阳虚外感22等症。附子被誉为中药中“回阳救逆第一品药”，其药用价值始载于《神农本草经》，韩保升谓：“正者为乌头，两歧者为乌喙，细长三、四寸者为天雄，根旁如芋散生者为附子，旁连生者为侧子，五物同出而异名，苗高二尺许，叶似石龙芮及艾。”《本草纲目》载：“乌头有两种，出彰明者即附子之母，今人谓之川乌头是也，其产江左山南等处者，乃本经所列乌头，今人谓之草乌头是也”。四川江油、布拖和陕西省汉中等地是我国附子主要商品生产基地，年产量占全国总产的90％以上，产品远销全国及出口国外。但附子栽培用乌药种需要每年在高山留种换种，这种栽培方式容易积累病虫害和造成种源混杂，影响附子产品和产量。因此，探索乌头的快速高效种苗繁育技术具有重要经济和研究价值。从发育来源上，附子实质上是一个具有膨大主根的“更新芽”。乌头的种子在秋季脱落时，种胚尚在心形胚或鱼雷形胚早期，种胚在低温湿润条件下约3个月完全长成。种子出土萌发过程中，仅子叶顶着种皮出土，幼苗茎端一直藏于地表之下，形成短缩的地下茎，与增粗的根-下胚轴一起休眠过冬。第二年幼苗抽出地上茎，与此同时，前一年形成的基生叶腋芽产生不定根，并膨大成为附子。附子继续生长，于第二年成为乌头，而其上的腋芽又形成新的附子，如此不断循环。附子是一种特殊的结构，附生在植株的根旁，由一个顶芽、腋芽以及块根状的不定根组成。附子上的腋芽出现后的第二年3月，在附子上腋芽第一节下远轴一侧的部分近似形成层细胞分化，形成了直接与芽端原形成层链连接的不定根原基。同时，腋芽第一节间横向伸出成为连接母株的“桥”。随着不定根上部韧皮部薄壁组织细胞的增生，此根不断增粗，变成新的附子，6、7月达到最大。这种附子的顶芽则是在7、8月后迅速发育，直至秋冬休眠，第三年春再发展成新的植株乌头。因此，附子实际上是一个具有膨大不定根的更新芽，连接母根的”桥”则是腋芽第一节间所形成的一种特殊的地下茎。乌头的栽培，药用植物的繁殖一般通过种子繁殖和营养繁殖两种方式。种子繁殖是由植物雌雄两性配子结合形成胚，再发育成新个体的繁殖方式。由于种子是通过植物的有性器官花经授粉、受精后形成的，故又称为有性繁殖。营养繁殖，又称为无性繁殖，它不通过植物的有性器官，主要是由植物营养器官的一部分根、茎、叶等再生出独立的新个体的繁殖方法。附子的繁殖方式有两种：种子繁殖和块根繁殖，一般采用块根繁殖。栽培中存在的主要问题：连作障碍是指同一种植物或近缘植物在同一块土地上连续多年种植以后,即使在正常管理情况下,也会出现生育状况变差、病虫害严重、产量降低、品质变劣的现象。有明显连作障碍的药用植物有三七、地黄、白术、人参、丹参等，而以往关于连作障碍的研究主要集中在花生、烟草、大豆和果树等。连作障碍形成的原因主要有土壤理化性质的改变、根际土壤的生物学环境变化以及植物的化感自毒作用。连作会使植物的生长发育受到限制、导致病虫害的加重，特别是根部病害，最终影响新陈代谢，降低药材品质。乌头是典型的忌连作作物，利用块根进行无性繁殖，在连年的栽培过程中，由于病毒的侵害和积累，造成了乌头产量下降和质量的退化，具体表现为植株矮小、纤柔，叶子枯萎脱落，病虫害严重，严重影响了乌头产业化的发展。虽然有文献报道，轮作可缓解连作障碍，但仍然制约着乌头的产业化发展；连作对乌头株高、茎粗和产量的影响达到显著水平，乌头母根直径和最大子根直径的差异不显著。而在不同茬次的栽培过程中，二茬时乌头叶斑病和根腐病的发病率已达到100％，病情也是急剧上升，乌头叶片出现严重枯萎和脱落。同时，随着种植年限增加，土壤酸性会大大增强，有效成分的含量也会改变，磷素和钾素会积累，全氮积累量最多。罗霞证实了这个研究结果，并且她认为连作会使乌头子根均重降低185％，而次乌头碱的含量竟下降943％。由此可见，连作对乌头的农学性状、子根重、有效成分含量等有较大的影响。病虫害一直以来都是影响药用植物产量和中药材质量的重要因素，常见药用植物的病虫害主要包括：侵染性病害(真菌病害、细菌病害、病毒病害、线虫病害)、生理病害(环境条件造成)和虫害(底下害虫、刺吸式口器害虫和咀嚼式口器害虫)。乌头栽培过程中，遭受着各种病虫害的侵害，主要的病虫害有附子霜霉病、白绢病和根腐病，此外还有花叶病、叶斑病、根结线虫病、白粉病、轮纹病等等。乌头根腐病、根结线虫病及白绢病、金龟子虫害主要危害根部组织，影响乌头根部水分和养分的吸收，严重时导致整株枯死。而霜霉病、白粉病、叶斑病、花叶病、叶蝉等叶部病害往往会造成叶片病斑、褪绿、变红、黄化、条纹、皱缩或焦枯等，从而影响到呼吸作用及光合作用，以致降低植物的产量和品质，严重时会造成植株全株枯死。红蚜虫和蛀心虫主要危害茎秆，吸食汁液，中段水分和养分输送到植株顶部，造成植株萎焉，减少产量。这几种病害往往相互影响，严重时产量会急剧下降。

现有的乌头栽培方式存在繁殖系数低、耗种量大、病虫害多、品质退化的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乌头附子种苗组织培养快繁再生方法，旨在解决现有的乌头栽培方式存在繁殖系数低、耗种量大、病虫害多、品质退化的问题。

本发明是这样实现的，一种乌头附子种苗组织培养快繁再生方法，所述乌头附子种苗组织培养快繁再生方法包括：乌头快速繁殖方法、乌头再生繁殖方法和乌头快速育苗方法；

所述乌头快速繁殖方法包括：乌头茎段快速繁殖方法和种子快速繁殖方法；

所述乌头茎段繁殖方法包括：以乌头当年生枝条的第二个腋芽为外植体，乌头茎段组织培养的消毒条件是70％乙醇消毒50s，0.1％升汞消毒10min，MS+2mg·L^-16-BA+0.3mg·L^-1NAA中不定芽诱导；不定芽增殖条件：植物生长调节剂诱导；蔗糖浓度为30g·L^-1下增殖；继代周期为40天，继代2次；培养基生根；

所述种子快速繁殖方法包括：10％次氯酸钠消毒处理种子30min，种子的芽诱导培养条件：植物生长调节剂诱导条件是MS+2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA；400mg·L^-1赤霉素浸种12h乌头种子；中芽增殖，组培苗在培养基1/2MS+0.1mg·L^-1NAA上生根培养；移栽基质乌头组培苗生长；

所述乌头再生繁殖方法包括：乌头茎段和不定根为外植体的再生繁殖方法、乌头无菌叶片为外植体的再生繁殖方法；

所述乌头茎段和不定根为外植体的再生繁殖方法包括：以乌头茎段和不定根为外植体，诱导条件为4mg·L^-12,4-D+2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+3mg·L^-1KT；不定根在MS+2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA下诱导，在2.5mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA培养基中愈伤增殖；培养基中愈伤分化；

所述乌头无菌叶片为外植体的再生繁殖方法包括：以乌头无菌叶片直接诱导不定芽，采用MS+4mg·L-16-BA+1mg·L-12,4-D诱导效果最佳；

所述乌头快速育苗方法包括：

以乌头无菌叶片为外植体，采用MS+4mg·L^-16-BA+1mg·L^-12,4-D进行不定芽诱导；叶片产生的不定芽增殖后生根培养，再用其不定根诱导的愈伤组织增殖分化为不定芽，最后再将不定芽增殖生根得到种苗。

进一步，所述乌头茎段繁殖方法中植物生长调节剂诱导条件是MS+2mg·L^-1TDZ+0.3mg·L^-1NAA；培养基1/2MS+0.5mg·L^-1IBA的生根。

进一步，所述种子快速繁殖方法中MS+0.5mg·L^-1TDZ+0.1mg·L^-1NAA中芽增殖；移栽基质为50％营养土+50％河沙下乌头组培苗生长。

进一步，所述乌头茎段和不定根为外植体的再生繁殖方法中：MS+2mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA培养基中愈伤分化。

本发明提供的乌头附子种苗组织培养快繁再生方法，与现有技术相比，具有以下优势：

1.快繁体系的建立

(1)茎段快繁体系：以乌头当年生枝条的第二个腋芽为外植体，通过消毒条件、不定芽诱导、继代增殖、生根试验探索茎段快繁的最佳无菌培养条件。乌头茎段组织培养的最佳消毒条件是70％乙醇消毒50s，0.1％升汞消毒10min，污染率仅为27.78％。MS+2mg·L^-16-BA+0.3mg·L^-1NAA中不定芽诱导效果最好，诱导率达86.67％。不定芽增殖条件：植物生长调节剂最佳诱导条件是MS+2mg·L^-1TDZ+0.3mg·L^-1NAA，增殖率达100％，增殖系数达4.029；蔗糖浓度为30g·L^-1下的增殖效果最好，增殖系数达4.364；继代周期为40天，继代2次下的增殖下效果最好，增殖系数达8.1。培养基1/2MS+0.5mg·L^-1IBA的生根效果最好，15天的生根率可达100％。

(2)种子快繁体系：以乌头种子为外植体，通过消毒条件、芽诱导、芽增殖、生根和移栽试验探索种子快繁的最佳无菌培养条件。10％次氯酸钠消毒处理种子30min，消毒效果最好，外植体污染率仅为5.6％，存活率可达92.3％，因此该条件适合作为乌头种子的消毒剂，而0.1％升汞不适合作为种子的消毒剂。种子的芽诱导培养条件：植物生长调节剂诱导条件是MS+2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA，种子萌芽率达75.1％；400mg·L^-1赤霉素浸种12h下乌头种子萌芽率最高，达97.5％。MS+0.5mg·L^-1TDZ+0.1mg·L^-1NAA中芽增殖效果最好，增殖系数达2.23。组培苗在培养基1/2MS+0.1mg·L^-1NAA上生根培养，生根率可达88.3％，生根条数可达20。移栽基质筛选试验中，基质50％营养土+50％河沙下乌头组培苗生长效果最好，成活率达100％。

(3)茎段快繁中，1节茎段外植体产生7.02株苗需要120天，而种子快繁中，1粒种子外植体产生1.92株苗需要101～120天，因此，相同时间下，茎段快繁能得到更多的苗。

2.再生体系：

(1)以乌头茎段和不定根为外植体，通过愈伤组织诱导、增殖和分化试验探索乌头脱分化再生途径的最佳无菌培养条件。茎段经L₁₆(4⁴)正交试验培养的最佳诱导条件为4mg·L^-12,4-D+2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+3mg·L^-1KT；不定根在MS+2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA下诱导效果最好，诱导率达100％。在2.5mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA培养基中愈伤增殖效果最好，相对愈伤增殖量为2.5g。MS+2mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA培养基中愈伤分化效果最好，愈伤分化率为61.54％，平均芽数为2.25个。

(2)以乌头无菌叶片为外植体，通过不定芽诱导试验探索乌头直接再生途径的最佳无菌培养条件。采用TDZ和NAA时，4mg·L^-1TDZ+0.3mg·L^-1NAA下的不定芽诱导率最高，达92.3％，但叶片褐化严重，大部分愈伤化，且不定芽畸形，生长速度慢，因此TDZ和NAA不适用于叶片不定芽的诱导。而采用2,4-D和6-BA时，MS+4mg·L^-16-BA+1mg·L^-12,4-D中不定芽诱导效果最好，平均芽数达3.167个，毛状根率仅为12.50％。

(3)茎段愈伤诱导不定芽途径中，一个茎段产生3.87个不定芽需要90天，不定根愈伤诱导不定芽途径中，一条不定根产生9.14个不定芽需要90天，而叶片直接诱导不定芽途径中，一叶片产生14.55个不定芽仅需20天。因此叶片直接诱导不定芽途径能在最短的时间内获得最多的不定芽。

3.乌头快繁育苗

叶片产生的不定芽增殖后生根培养，再用其不定根诱导的愈伤组织增殖分化为不定芽，最后再将不定芽增殖生根得到种苗。在最理想的状态下，一叶片经过300天的组织培养可产生91615.4株种苗。

本发明可以显著提高乌头快繁育苗的效率及缩短育苗周期，为乌头快繁育苗的生产应用提供了技术支撑，并解决好目前市场上种苗繁育问题。

附图说明

图1是本发明实施例提供的乌头茎段快速繁殖方法流程图。

图2是本发明实施例提供的乌头种子快速繁殖方法。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例的乌头附子种苗组织培养快繁再生方法包括：乌头快速繁殖方法、乌头再生繁殖方法和乌头快速育苗方法。

所述乌头快速繁殖方法包括：乌头茎段快速繁殖方法、乌头种子快速繁殖方法和乌头茎段快速繁殖方法。

如图1所示，本发明实施例的乌头茎段快速繁殖方法包括以下步骤：

S101：以乌头当年生枝条的第二个腋芽为外植体；

S102：乌头茎段组织采用70％乙醇消毒50s，0.1％升汞消毒10min，MS+2mg·L^-16-BA+0.3mg·L^-1NAA中不定芽诱导；

S103：植物生长调节剂诱导条件MS+2mg·L^-1TDZ+0.3mg·L^-1NAA中不定芽增殖，增殖系数达4.364；继代周期为40天，继代2次下的增殖，培养基1/2MS+0.5mg·L^-1IBA的生根。

如图2所示，本发明实施例的乌头种子快速繁殖方法包括以下步骤：

S201：以乌头种子为外植体，10％次氯酸钠消毒处理种子30min；

S202：种子的芽诱导培养，条件为：植物生长调节剂诱导条件是MS+2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA，种子萌芽率达75.1％；400mg·L^-1赤霉素浸种12h；

S203：MS+0.5mg·L^-1TDZ+0.1mg·L^-1NAA中芽增殖，增殖系数达2.23；组培苗在培养基1/2MS+0.1mg·L^-1NAA上生根培养，移栽基质50％营养土+50％河沙下乌头组培苗生长。

本发明实施例的乌头再生繁殖方法包括：乌头茎段和不定根为外植体的再生繁殖方法、乌头无菌叶片为外植体的再生繁殖方法。

本发明实施例的乌头茎段和不定根为外植体的再生繁殖方法包括以下步骤：

以乌头茎段和不定根为外植体，茎段诱导条件为4mg·L^-12,4-D+2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+3mg·L^-1KT；不定根在MS+2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA下诱导；

在2.5mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA培养基中愈伤增；

MS+2mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA培养基中愈伤分化。

下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。

1本试验以乌头的带腋芽茎段、茎段、无菌叶片和种子为外植体，通过消毒条件、芽诱导、芽增殖、生根及移栽、愈伤组织诱导、增殖及分化等方面建立乌头茎段的快速繁殖体系、种子快繁体系和再生体系，提出乌头种苗快繁的技术路线，为工厂化育苗提供技术支撑。

2材料与方法

2.1试验材料、试剂及仪器

2.1.1试验材料

附子采自西南科技大学乌头种质资源圃，该资源圃位于四川省北川县桂泽乡，选取材料为江油地区主栽品种。种子采集时间为2013年11月和2014年11月。块根采集为2014年11月，并于当年12月种植于本课题组加代实验室内以方便茎段采集。茎段为2015年剪取的资源圃或加代室当年生植株。

2.1.2试剂

植物生长调节剂：2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，6-苄基腺嘌呤(6-BA)，吲哚乙酸(IAA)，吲哚丁酸(IBA)，萘乙酸(NAA)，噻苯隆(TDZ)，氯吡苯脲(CPPU)，赤霉素(GA₃)均购买自成都科龙试剂公司。

蒸馏水、升汞、水解乳蛋白、琼脂粉和次氯酸钠均购买自成都科龙试剂公司，氢氧化钠、盐酸、硝酸铵、硝酸钾、高锰酸钾、二水氯化钙、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硼酸、四水硫酸镁、七水硫酸锌、钼酸钠、五水硫酸钙、六水氯化钴、七水硫酸铁、乙二胺四乙酸二钠、肌醇、甘氨酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素和蔗糖均为市售分析纯。

2.1.3仪器

HP250G-C型智能光照培养箱(武汉瑞华仪器设备有限责任公司)，J-GJ-1G水平送风净化工作台((尚净验设备有限公司)，KQ-100VDB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，HHS216型电热恒温水浴锅(常熟医疗器械)，LDZF-50KB-Ⅱ立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)，智能人工气候箱RTOP-280Y(浙江托普仪器有限公司)，电子分析天平(奥豪斯国际贸易上海有限公司)，万用电炉(北京中兴伟业仪器有限公司)，DHG-9245A电热恒温鼓风干燥器(上海齐欣科学仪器有限公司)，PH-030(A)干燥/培养二用箱(上海齐欣科学仪器有限公司)，BCD-539WT海尔双开门冰箱(青岛海尔股份有限公司)。

2.2试验方法

2.2.1培养条件

培养基为MS培养基(生根为1/2MS培养基)，附加30g·L^-1蔗糖，6.5g·L^-1琼脂粉，pH6.2，培养温度(20±1)℃，光照周期12h/d，光照强度1500～2000lx。

2.2.2乌头茎段快繁和种子快繁体系的建立

2.2.2.1乌头茎段快繁体系的建立

(1)外植体消毒时间的选择

将带腋芽茎段表面污垢除净，饱和洗衣粉水浸泡5min后，流水下冲洗4小时。在超净工作台上，先用70％乙醇处理50s，无菌水换洗两次，0.1％HgCl₂分别消毒5min、8min、10min和15min，无菌水换洗9次，接种。两周后记录外植体污染率、死亡率和褐化率。

(2)外植体取材部位的选择

选取顶芽、第一个腋芽、第二个腋芽和第三个腋芽这四种部位的带腋芽茎段接种于启动培养基上，一周后考察诱导率、死亡率和褐化率。

(3)不定芽诱导培养

a.植物生长调节剂的单因素试验

在MS培养基中，分别添加植物生长调节剂的种类和质量浓度如下：6-BA(0.5、1、2、4mg·L^-1)、TDZ(0.1、0.5、1、2、4mg·L^-1)、IAA(0.1、0.3、0.5、1mg·L^-1)、NAA(0.05、0.1、0.3、0.5、1、2mg·L^-1)，共19个处理，每个处理重复5次，每瓶3个外植体为一次重复。记录生长状态，一个月后考察诱导率和芽长。

b.最佳诱导培养基的选择

通过单因素生长调节剂的选择，得知6-BA和NAA对芽诱导影响较大。以MS为基本培养基，加入6-BA(1、2、4mg·L^-1)和NAA(0.1、0.3、0.5mg·L^-1)进行二因素三水平随机试验，共9个处理，每个处理重复5次，每瓶3个外植体为一次重复。记录生长状态，一个月后考察诱导率和芽长。

(4)继代增殖培养

a.增殖培养激素组合的筛选

将初代培养获得的不定芽转接到继代培养基中进行增殖培养，共4种处理：Z1：MS+0.5mg·L^-1CPPU+0.1mg·L^-1NAA；Z2：MS+0.1mg·L^-1TDZ+0.1mg·L^-1NAA；Z3：MS+2mg·L^-1TDZ+0.3mg·L^-1NAA；Z4：MS+1mg·L^-1TDZ+0.3mg·L^-1NAA，每个处理重复5次，每瓶3个外植体为一次重复。继代两次即60天后考察增殖率和增殖系数，记录生长状态。

b.蔗糖浓度对增殖的影响

MS为基本培养基，分别添加蔗糖10、20、30、40、50g·L^-1，共4个处理，每个处理均添加2mg·L^-1TDZ和0.3mg·L^-1NAA。记录生长状态，30天后考察增殖率和增殖系数。

c.水解乳蛋白对增殖的影响

MS为基本培养基，分别添加水解乳蛋白0.5、1、2、4g·L^-1，共4个处理，每个处理均添加2mg·L^-1TDZ和0.3mg·L^-1NAA。记录生长状态，30天后考察增殖率和增殖系数。

d.继代周期对增殖的影响

选取生长状况一致的单芽，分别继代培养20、30、40、50天，继代两次。每个处理均以MS为基本培养基，添加2mg·L^-1TDZ和0.3mg·L^-1NAA。记录生长状态，考察增殖率和增殖系数。

e.继代次数对增殖的影响

选取生长状况一致的单芽，分别继代培养1、2、3、4次，继代周期30天。每个处理均以MS为基本培养基，添加2mg·L^-1TDZ和0.3mg·L^-1NAA。记录生长状态，考察增殖率和增殖系数。

(5)组培苗的生根培养

a.基本培养基的选择

增殖苗剪成单芽，分别转接到添加1mg·L^-1IBA的MS和1/2MS这两种基本培养基上，每个处理重复5次，每瓶3个外植体为一次重复，记录根的生长情况，15天后考察生根率、平均根数和根长。

b.生长素对生根的影响

以1/2MS为基本培养基，选择NAA、IBA和IAA这三种生长素，质量浓度设计为0.1、0.3、0.5mg·L^-1，共9种处理，每个处理重复5次，每瓶3个外植体为一次重复，15天后考察生根率、平均根数和根长，记录根的生长情况。

2.2.2.2乌头种子组织培养快繁体系的建立

(1)外植体消毒

a.次氯酸钠溶液作为消毒剂

种子洗净后，用自来水清洗干净，晾干，备用。置于超净工作台中，用70％乙醇处理后和不同浓度(5％、10％和20％)次氯酸钠溶液处理不同时间(5、15、30min)，无菌水换洗8次，接种。记录种子污染率和存活率。

b.0.1％升汞作为消毒剂

种子洗净后，用自来水清洗干净，晾干，备用。置于超净工作台中，用70％乙醇处理后和0.1％升汞溶液分别处理3、5、8、10min，无菌水换洗8次，接种。记录种子污染率和存活率。

(2)芽诱导培养

采用MS为基本培养基，加入素6-BA(1、2、2.5mg·L^-1)，和NAA(0.1、0.2、0.4mg·L^-1)进行二因素三水平随机试验，共9种处理，每种处理接种10瓶，每瓶3个外植体，观察萌发情况，记录萌芽率。

(3)不同化学试剂浸种处理对种子发芽的影响

取籽粒饱满、无病虫害的种子各30粒，分别用三种不同浓度的化学试剂(表15)浸泡24小时，洗净，置于超净工作台消毒后接种于MS+2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA。观察萌发情况，记录萌芽率。

(4)赤霉素浸种时间对种子发芽的影响

取籽粒饱满、无病虫害的种子各30粒，分别用400mg·L^-1赤霉素浸泡6、12、24、36、48小时，洗净，置于超净工作台消毒后接种于MS+2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA。观察萌发情况，记录萌芽率。

(5)继代增殖培养

在无菌条件下，将生长良好的芽转到增殖培养基上继续培养。培养基中添加噻苯隆TDZ(0.1、0.5、1mg·L^-1)和NAA(0.1、0.3mg·L^-1)，共六个处理，每个处理接种10瓶，每瓶3个外植体。一个月后统计增殖系数。

(6)组培苗的生根培养及移栽

将长势良好的组培苗转入添加0.1mg·L^-1NAA的1/2MS固体培养基，观察生根情况。

选择根系发达、生长良好的组培苗(苗高3cm以上)，用温水洗净根部培养基，移栽于灭菌后的营养土：沙蛭石＝1：1混合土壤，置于25℃加代实验室培养。

2.2.3乌头再生体系的建立

2.2.3.1不同培养基配方对茎段愈伤诱导的试验

取乌头茎段接种于不同激素浓度配比的MS培养基中，30d后统计愈伤组织诱导率，记录生长状态。采用四因素四水平正交试验设计L₁₆(4⁴)(表3-18)，MS培养基中添加不同激素2,4-D(1、2、3、4mg·L^-1)、6-BA(0、0.5、1、2mg·L^-1)、NAA(0、0.1、0.2、0.3mg·L^-1)和KT(0、1、2、3mg·L^-1)。

2.2.3.2 6-BA和NAA不同浓度组合对不定根愈伤诱导的试验

取无菌苗的不定根接种于不同激素浓度配比的MS培养基中，30d后统计愈伤组织诱导率，记录生长状态。不同培养基中，NAA浓度为0.1、0.3mg·L^-1，6-BA浓度为1、2、4mg·L^-1，共6种处理。

2.2.3.3不同激素对愈伤增殖的试验

(1)植物生长调节剂的单因素试验

MS培养基中，分别添加植物生长调节剂的种类和浓度分别为6-BA(0.5、1、2mg·L^-1)、TDZ(0.1、0.5、1mg·L^-1)、NAA(0.1、0.3、0.5mg·L^-1)和IAA(0.1、0.3、0.5mg·L^-1)共12种处理，记录生长状态，一个月后考察相对愈伤增殖量。

(2)不同激素组合对愈伤增殖的影响

通过单因素试验得知，6-BA和NAA对愈伤增殖影响较大。以MS为基本培养基，加入6-BA(1、1.5、2、2.5mg·L^-1)和NAA(0.1、0.3mg·L^-1)进行二因素随机试验，共八个处理，记录生长状态，一个月后考察相对愈伤增殖量。

2.2.3.4不同激素对愈伤分化的试验

选择质地疏松的乌头愈伤组织转接到不同的培养基中进行不定芽的分化培养，一个月后考察愈伤组织分化率、平均芽数，记录生长状态。培养基中激素种类和浓度分别为6-BA(2、4mg·L^-1)、TDZ(1、2mg·L^-1)和NAA(0.05、0.1、0.2、0.3mg·L^-1)，共八种处理。

2.2.3.5TDZ和NAA不同浓度组合对叶片直接诱导不定芽试验

取无菌苗的叶片，将叶片剪成1×1cm小块，以叶片正面朝上平放于培养基。培养基中，NAA浓度为0.3mg·L^-1，TDZ浓度为0.1、0.5、1、2、4mg·L^-1，共5种处理。记录生长状态，二十天后考察不定芽诱导率、不定芽数、平均芽数。

2.2.3.6 6-BA和2,4-D不同浓度组合叶片直接诱导不定芽试验

取无菌苗的叶片，将叶片剪成1×1cm小块，以叶片正面朝上平放于培养基。培养基中，2,4-D的浓度分别为1、2mg·L^-1，6-BA的浓度分别为0.5、1、4mg·L^-1，共6种处理。记录生长状态，二十天后考察不定芽诱导率、毛状根率、平均芽数。

2.2.4数据统计与分析

污染率(％)＝污染外植体数/接种外植体数×100％

死亡率(％)＝死亡外植体数/存活外植体数×100％

褐化率(％)＝褐化外植体数/存活外植体数×100％

芽诱导率(％)＝萌芽外植体数/接种外植体数×100％

增殖率(％)＝增殖苗数/接种外植体总数×100％

增殖系数＝增殖的丛生芽总数/接种外植体总芽数

生根率(％)＝生根外植体数/接种外植体总数×100％

平均根数(条)＝单株根数之和/生根株数

种子污染率(％)＝污染种子数/接种种子数×100％

种子存活率(％)＝萌动种子数/未污染种子数×100％

萌芽率(％)＝发芽种子数/存活种子数×100％

不定芽诱导率(％)＝诱导出不定芽的叶片数/接种的叶片数×100％

不定芽数(个)＝各个处理诱导出的不定芽总数(个)

平均芽数(个)＝不定芽总数/诱导出不定芽的叶片数×100％

毛状根率(％)＝诱导出毛状根的叶片数/接种的叶片数×100％

愈伤组织诱导率(％)＝诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数×100％

相对愈伤增殖量(g)＝接种时愈伤组织量(g)-培养后愈伤组织量(g)

愈伤分化率(％)＝分化出芽的愈伤数/接种的愈伤数×100％

试验数据采用SPSS软件和excel软件进行分析。

3结果分析

3.1乌头快繁体系的建立

3.1.1乌头茎段快繁体系的建立

3.1.1.1外植体消毒

在乌头外植体消毒试验中，用0.1％HgCl₂分别消毒5、8、10、15min的效果差异显著(P<0.05)(表3-1)。消毒时间10min的污染率最低，为27.78％，死亡率也是最低(15.39％)。消毒5min下的褐化率最低(25.00％)，但污染率过高(55.56％)。而消毒时间15min时，外植体污染率和死亡率均达到最高，且外植体全部褐化，不利于试验，这可能是消毒时间过长导致植物细胞死亡。因此乌头茎段的最佳消毒方法是0.1％HgCl₂消毒10min。

表3-1不同消毒时间对乌头外植体的影响

3.1.1.2外植体取材部位的选择

培养一周后，同一茎段不同部位的外植体的诱导情况差异显著(P<0.05)(表3-2)。顶芽的诱导率最低(13.34％)，死亡率最高(66.67％)，褐化较严重(褐化率达86.67％)。茎段的第一个腋芽和第三个腋芽的诱导率差异不大，但第三个腋芽褐化较严重(褐化率80.00％)。这可能是因为茎端具有顶端优势，抑制芽的形成，而第三个腋芽开始木质化，生长能力减退，芽诱导能力下降。第二个腋芽诱导效果最好(53.34％)，死亡外植体最少，是理想的外植体材料。

3.1.1.3不定芽诱导培养

(1)植物生长调节剂的单因素试验

植物生长调节剂的种类和质量浓度对芽诱导影响很大，为筛选合适的生长调节剂种类和质量浓度，首先进行单因素试验，结果表明不同种类的细胞分裂素和生长素对乌头带腋芽茎段的芽诱导效果差异显著(P<0.05)(表3-3)。6-BA的诱导率在66.67％～91.67％，芽长在1.519～1.748cm之间，TDZ的诱导率在69.22％～81.82％，而芽长在1.106～2.031cm，但经TDZ处理的外植体叶片普遍皱缩，甚至畸形，这可能是TDZ的活性太强造成外植体分化不均匀。因此细胞分裂素选择6-BA有利于芽的启动培养。NAA和IAA对芽诱导的效果影响不大，均有一定的促进作用，但浓度越高越抑制芽的诱导(使用2mg·L^-1NAA时，诱导率仅为10.00％)。从经济角度考虑，生长素选择NAA更实惠。此外，在不同种类的生长调节剂中生长的植株细弱，叶片黄绿，可见只添加细胞分裂是或者生长素对外植体启动培养是不利的。综合考虑，芽启动培养的细胞分裂素选择6-BA，生长素选择NAA。

表3-2取材部位对外植体诱导的影响

(2)最佳诱导培养基的选择

将带腋芽茎段接种至添加不同质量浓度的6-BA和NAA配比的MS培养基上(表3-4)，不同激素组合的培养基均能使带腋芽茎段诱导出芽。培养5天后，腋芽开始萌发，13天后，茎段与培养基接触的部分形成少量愈伤组织，但不分化成芽。当NAA浓度为0.3mg·L^-1时，与不同质量浓度的6-BA组合更有利于芽的诱导，均能得到相对较高的诱导率，其中6-BA浓度为2mg·L^-1时，诱导率最高，为86.67％，芽长1.947cm，茎干粗壮，叶片翠绿，生长旺盛。6-BA浓度为4mg·L^-1时，诱导率下降，叶片开始卷曲，不利于植株生长。而6-BA浓度为1mg·L^-1时，诱导率最低，叶片易愈伤化，添加0.1mg·L^-1NAA使芽诱导率仅为40％，芽长也仅为0.968cm，NAA浓度提高后，诱导率仅提高为46.67％，且叶片细窄，不利于培养，可见1mg·L^-16-BA不适合芽诱导。6-BA浓度为2mg·L^-1时，添加0.1mg·L^-1NAA的诱导率为73.34％，NAA浓度为0.3mg·L^-1诱导率最高，为86.67％，但NAA浓度提高为0.5mg·L^-1时，诱导率降低至66.67％。4mg·L^-16-BA和0.1mg·L^-1NAA，这种组合的芽诱导率最低，仅为33.34％，提高NAA的浓度仅使诱导率在60％左右。由此可见，在芽诱导过程中，细胞分裂素和生长素的质量浓度有着重要作用，细胞分裂素和生长素的比例也是相当关键。因此，芽诱导培养的最佳激素组合为2mg·L^-16-BA和0.3mg·L^-1NAA。

3.1.1.4继代增殖培养

(1)增殖培养激素组合的筛选

将不定芽切分转接到4种增殖培养基中，60天后统计增殖情况(表3-5)。各增殖培养基均具有芽增殖的现象，其中Z3处理(2mg·L^-1TDZ和0.3mg·L^-1NAA)的增殖效果最好，增殖率100％，增殖系数达到4.029，显著高于其他处理(P<0.05)，平均苗高在2.930cm左右，苗粗壮，叶片浓绿，生长较好，但与培养基接触部分有少量愈伤组织。TDZ浓度为0.1mg·L^-1时，增殖系数为2.700，苗高在2.772cm左右，但叶片较大，且部分未伸展；TDZ浓度为1mg·L^-1时，增殖系数提高到2.85，苗高2.930cm左右，但部分叶片枯黄。继续提高TDZ浓度到4mg·L^-1，芽多偏畸形，不利于生长(数据未显示)。乌头组培中首次采用CPPU(氯吡脲)这种细胞分裂素用于增殖试验，使用浓度为0.5mg·L^-1，但增殖系数仅为1.875，苗高3.922cm，但该细胞分裂素处理下的芽全部细长而弱小，而叶片数仅为1～2片，难以存活。因此，适宜的增殖培养基为MS+2mg·L^-1TDZ+0.3mg·L^-1NAA。

表3-3植物生长调节剂对芽诱导的影响

表3-4不同激素组合对芽诱导的影响

表3-5不同培养基配方对增殖的影响

(3)水解乳蛋白对增殖的影响

水解乳蛋白作为氨基酸对培养物的生长有良好的促进作用，但在本试验中对芽增殖生长有明显的抑制作用(表3-7)。浓度为0.5g·L^-1和4g·L^-1时的增殖系数显著高于其他两个浓度，达3.0及以上，同时芽的死亡率也较高，分别为50.00％和54.44％。浓度为1g·L^-1时，死亡率最低，为22.22％，增殖系数为2.4，但植株最矮小，平均苗高仅为1.097cm。浓度2g·L^-1时，增殖率最大，为100％，但死亡率也最高，为66.67％，平均苗高也显著高于其他水解乳蛋白的处理，为2.061cm，却显著低于空白处理(2.930cm)，因此，水解乳蛋白并不适用于乌头芽的增殖培养。

表3-6蔗糖浓度对芽增殖的影响

表3-7水解乳蛋白对芽增殖的影响

(4)继代周期对增殖的影响

将乌头丛生芽切割成单芽转入增殖培养基分别培养20天、30天、40天和50天，继代两次，结果显示所有处理下的芽增殖率均达到100％，继代周期对芽的增殖系数有显著影响(P<0.05)(表3-8)。继代周期40天下的芽增殖系数达到8.1，与继代20天培养下的芽增殖系数差异不显著(增殖系数7.0，平均苗高3.505cm)，但显著高于其他处理，平均苗高3.216cm，部分植株的叶片有黑色斑点。继代20天和继代50天的芽增殖系数差异显著，分别为4.0和5.286，平均苗高也差异不显著，分别为2.891和2.896，但继代50天下的植株叶片有褐色斑点，且部分植株有花芽，不利于芽的继代增殖。因此，乌头芽继代增殖培养的继代周期选择40天。

(5)继代次数对增殖的影响

将乌头丛生芽切割成单芽转入增殖培养基40天，分别继代一次、两次、三次和四次，结果显示所有处理下的芽增殖率均达到100％，继代次数对芽的增殖系数有显著影响(P<0.05)(表3-9)。继代两次的芽增殖系数最高，达7.9，与继代三次的增殖系数差异不显著(增殖系数5.667，平均苗高2.671cm)，但显著高于其他处理，平均苗高差异不显著，该处理下的平均苗高为2.836cm，此外，植株的部分叶片颜色不均匀。继代一次的增殖系数(2.857)和继代三次的处理(5.667)差异显著，与继代四次下的增殖系数差异不显著(4.364)。继代三次和继代四次的植株叶片均出现枯黄现象，继代四次的植株根部出现愈伤组织，这可能和生长时间过长，部分细胞功能退化有关。因此，乌头芽的继代增殖培养的继代次数为两次。

3.1.1.5生根培养

(1)基本培养基的选择

乌头组培苗的生根培养采用MS和1/2MS这两种培养基(表3-10)，本试验中附加1mg·L^-1IBA作为生长素，组培苗在两种培养基上均有生根现象，但平均根数和根形态均有差异。MS培养基的生根率仅为50％，平均根数6.3条，而1/2MS培养基的生根率达75％，平均根数达8.1条，根短粗，有黄色绒毛。综合考虑，选用1/2MS为生根培养的基本培养基。

表3-8继代周期对芽增殖的影响

表3-9继代次数对芽增殖的影响

表3-10基本培养基对生根的影响

(2)生长素的选择

以1/2MS为基本培养基，添加NAA、IAA和IBA这三种广泛用于不定根诱导的生长素，每种培养基处理下的外植体均有生根现象，但但生根率、平均根数和平均根长有差异显著(P<0.05)(表3-11)。IBA对乌头组培苗的生根有明显促进作用，生根率在75～100％，浓度为0.3mg·L^-1时，虽生根率仅为80％，平均根长可达1.285cm，平均根数6条，浓度在1mg·L^-1的平均根数也有8.1条，而浓度为0.5mg·L^-1时，生根率可达100％，平均根长0.906cm左右，平均根数10.5条，叶色翠绿，生长旺盛。0.1mg·L^-1NAA处理下的生根率75％，平均根数6.2条，而根短又细，随着浓度提高，生根率和平均根数逐渐降低。0.5mg·L^-1IAA处理下的平均根数7.2条，平均根长也在1.070cm左右，但根的长度差异明显。0.1mg·L^-1IAA处理的生根率最低，仅为22.20％，但平均根数达4.5条。结合生根率、根数和根长三方面综合考虑，适宜的生根培养基为1/2MS+0.5mg·L^-1IBA，15天的生根率可达100％。

表3-11生长素对生根的影响

3.1.2乌头种子组织培养快繁体系的建立

3.1.2.1消毒方法

(1)0.1％升汞作为消毒剂

0.1％升汞作为最常用的消毒剂之一，在本试验中对乌头的种子消毒效果较好(表3-12)，在处理3、8和10min下均未出现污染情况，仅5min处理的种子的污染率为5.00％。0.1％升汞对种子发芽也有明显影响，处理时间5、8和10min下的种子两个月均无发芽迹象，种皮呈深褐色，而3min处理的种子的发芽率仅为6.67％，叶片颜色浅绿。升汞消毒效果好，但是可能抑制种胚生长发育，因此升汞不适合作为种子的消毒剂。

表3-12 0.1％升汞对种子消毒的影响

(2)次氯酸钠溶液作为消毒剂

乌头消毒试验中，次氯酸钠溶液的各浓度和不同时间处理下的消毒效果差异显著(P<0.05)(表3-13)。相同浓度下，外植体随处理时间的延长，污染率逐步降低，存活率提高；相同处理时间下，外植体污染率随次氯酸钠浓度提高而降低，存活率也提高。其中5％次氯酸钠消毒种子5min的效果最差，污染率100％，而10％次氯酸钠消毒种子30min的效果最好，污染率仅为5.6％，存活率可达92.3％。因此，乌头种子的最佳消毒剂为10％次氯酸钠消毒30min。

3.1.2.2芽诱导培养

经消毒处理的种子接种于10种诱导培养基中，观察发现种子开始萌发时间为22天，最晚的萌发启动时间为60天(表3-14)。在种子萌发期间，6-BA和NAA的影响较大，6-BA三个浓度下的平均萌芽率分别为45.97％、60.97％和33.63％，NAA三个浓度下的平均萌芽率分别为61.43％、34.73％和44.40％。在诱导种子萌发过程中，不但需要控制植物生长调节剂的浓度，细胞分裂素和生长素的配比更为重要。在各诱导培养基中，2mg·L^-16-BA和0.1mg·L^-1NAA组合萌芽率最高(75.1％)，其次是2.5mg·L^-16-BA和0.1mg·L^-1NAA组合(萌芽率70.3％)。在外植体伸长、生长过程中，6-BA的浓度对外植体叶片生长发育影响较大。当6-BA浓度为1mg·L^-1时外植体叶片颜色浅绿，部分叶片颜色不均匀，当浓度为2mg·L^-1时叶片颜色浓绿，浓度继续增大时叶片全部皱缩。而NAA处理下，乌头外植体在较低浓度下的生长情况明显优于较高浓度。综合生长状况和结果，促进乌头种子萌发和生长的最佳激素组合为2mg·L^-16-BA和0.1mg·L^-1NAA，萌芽率达75.1％，叶片呈绿色，无皱缩叶片，生长速度快。

表3-13次氯酸钠溶液对种子的影响

3.1.2.3不同化学试剂浸种处理对种子发芽的影响

为提高萌芽率，用三种化学试剂对种子进行浸种后再消毒接种，结果表明化学试剂对种子萌发影响显著(P<0.05)(表3-15)。高锰酸钾和硝酸钾对种子萌发有抑制作用，高锰酸钾浓度为1.2％时，萌芽率最高，仅为43.3％，低于自来水处理时的种子萌发率(73.3％)。赤霉素处理的种子萌发率较高，浓度为100mg·L^-1略低于自来水处理，浓度200mg·L^-1和400mg·L^-1对种子的萌发有促进作用，浓度400mg·L^-1时萌芽率最高，达93.3％。因此，可先用400mg·L^-1赤霉素浸种处理后再进行消毒接种。

3.1.2.4赤霉素浸种时间对种子发芽的影响

赤霉素浸种处理种子会提高种子的萌发率，因此继续探索赤霉素浸种时间对发芽的影响。赤霉素浸种时间对乌头种子萌发率有显著影响(P<0.05)(表3-16)。浸种时间为12h时，萌芽率显著高于其他处理，为97.50％，其次是浸种6h，萌芽率为89.17％。浸种36h和48h的种子萌芽率差异不显著，分别为69.68％和71.11％。各处理下的萌发启动时间不统一，浸种处理24h、48h和空白处理启动较早，均在接种后32天左右，浸种36h的启动时间最长，为45天，此外，处理6h和12h的种子均在第40天萌芽，可见，赤霉素浸种只能提高萌芽率，不能缩短发芽时间，这可能和乌头种子的种胚在尚未成熟有较大关系。因此，赤霉素的最佳浸种时间选择12h。

表3-14不同激素组合对种子萌芽的影响

表3-15不同化学试剂浸种对种子萌芽的影响

表3-16赤霉素浸泡时间对种子发芽的影响

3.1.2.5继代增殖培养

培养二十天后，在无菌条件下，将生长良好的芽转接到六种增殖培养基，一个月后统计增殖芽数(表3-17)。各增殖培养基中，都有芽增殖现象，其中以MS+0.5mg·L^-1TDZ+0.1mg·L^-1NAA处理增殖效果最好，增殖系数为2.23，显著高于其他处理(P<0.05)，其次是处理MS+0.1mg·L^-1TDZ+0.1mg·L^-1NAA，其增殖系数为1.75，与处理MS+0.1mg·L^-1TDZ+0.3mg·L^-1NAA(增殖系数1.62)差异不显著，但显著高于处理三(增殖系数1.33)、处理五(增殖系数1.36)和处理六(增殖系数1.43)。总体看来，TDZ浓度相同时，随着NAA浓度(0.1mg·L^-1、0.3mg·L^-1)提高，增殖系数降低，苗质量也降低；NAA浓度为0.1mg·L^-1，增殖系数随TDZ浓度的提高先提高后降低，而NAA浓度为0.3mg·L^-1，增殖系数随TDZ浓度的提高而降低，说明乌头芽的增殖以低浓度细胞分裂素和低生长素浓度配比为宜。在培养过程中，不分割增殖的芽，以芽丛形式继续增殖，芽丛越大，芽数量越多，增殖越快。

表3-17不同激素浓度配比对芽增殖的影响

3.1.2.6组培苗的生根培养及移栽

长势良好的组培苗转入添加0.1mg·L^-1NAA的1/2MS固体培养基培养7天后，芽基部开始形成白色凸点，培养20天长出较多的白色不定根，生根率可达88.3％，生根条数可达20条，最少5条，部分根为浅黄色毛状不定根，植株生长健壮，发育良好。乌头喜湿润，以50％营养土+50％河沙为基质进行移栽，保持加代实验室相对湿度较高，成活率可达100％，植株生长良好。

3.1.3茎段快繁和种子快繁的比较

3.1.3.1效率的比较

茎段快繁体系和种子快繁体系中，各培养阶段的诱导率、增殖系数和生根率差异明显。茎段快繁中，1节茎段外植体可以产生7.02株苗，而种子快繁中，1粒种子外植体仅产生1.92株苗。因此，茎段快繁能得到更多的苗。

3.1.3.2周期的比较

茎段快繁体系和种子快繁体系中，各培养阶段的诱导时间和增殖时间差异明显。茎段快繁110天，而种子快繁需要110天，两者在周期上差异不大。综合效率和周期，茎段快繁中，1节茎段外植体产生7.02株苗需要110天，而种子快繁中，1粒种子外植体产生1.92株苗需要110天，因此，相同时间下，茎段快繁能得到更多的苗。

3.2乌头再生体系的建立

3.2.1茎段愈伤诱导正交试验

表3-18茎段愈伤诱导正交设计表

分别以乌头的茎段、叶片和叶柄为外植体进行愈伤组织诱导，但是在培养过程中叶片和叶柄大部分褐化死亡，成愈率极低(数据未显示)。因此选用茎段为外植体，经L₁₆(4⁴)正交试验培养30天(表3-19、表3-20)，经统计愈伤组织启动时间存在差异，在组合1mg·L^{- 1}2,4-D+1mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA+2mg·L^-1KT中培养，茎段两端切口在第四天开始膨胀，逐渐形成愈伤。组合4mg·L^-12,4-D+4mg·L^-16-BA+4mg·L^-1KT中培养的茎段在第五天膨胀逐渐形成愈伤。组合1mg·L^-12,4-D、组合3mg·L^-12,4-D+0.5mg·L^-16-BA+0.3mg·L^-1NAA+2mg·L^-1KT和组合3mg·L^-12,4-D+2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA愈伤启动时间均在第六天。组合4mg·L^-12,4-D+1mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+3mg·L^-1KT和组合4mg·L^-12,4-D+0.3mg·L^-1NAA+1mg·L^-1KT愈伤启动较晚，分别在第12天和第16天。而茎段在组合2mg·L^{- 1}2,4-D+1mg·L^-16-BA+0.3mg·L^-1NAA中培养二十二天后才形成愈伤。

对于四水平的2,4-D，诱导率随浓度的增大呈先下降再增大趋势，其中浓度为2mg·L^-1时诱导率最低。对于四水平6-BA，愈伤组织诱导率随浓度的增大呈增大趋势。对于四水平的NAA，愈伤诱导率随浓度的增大呈先增大后减少的趋势，其中浓度为0.1mg·L^-1时诱导率最大，浓度0.3mg·L^-1诱导率最低。对于四水平的KT，愈伤诱导率随浓度的增大呈先降低后增大趋势，其中浓度为1mg·L^-1时诱导率最低，浓度为3mg·L^-1时诱导率最高。

四个因素对愈伤组织诱导率的影响程度大小依次是2,4-D、NAA、KT和6-BA，但四个因素对愈伤组织诱导的影响均不显著。为得到诱导率较高的激素组合，只能直观地依照正交试验结果中各平均数进行组合，选择平均数较大的的水平A4、B4、C2、D4进行组合，得到能诱导最多乌头茎段愈伤组织的最佳激素组合为A₄B₄C₂D₄，即4mg·L^-12,4-D+2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+3mg·L^-1KT。

表3-19茎段诱导愈伤正交试验结果

3.2.2 6-BA和NAA不同浓度组合对不定根愈伤诱导的影响

以乌头无菌苗的不定根为外植体接种到六种不同激素组合的培养基中进

行愈伤组织诱导一周后，不定根膨胀，逐渐形成黄白颗粒状的愈伤，部分褐化，部分愈伤分化成苗。不同激素组合的愈伤诱导率差异显著(P<0.05)(表3-21)。NAA浓度为0.1mg·L^-1，三个组合下的愈伤诱导率均为100％，显著高于浓度为0.3mg·L^-1的组合。而当NAA浓度为0.3mg·L^-1时，随着6-BA的浓度升高，诱导率降低，6-BA浓度为4mg·L^-1时，诱导率显著低于其他处理，为75.00％，6-BA浓度为1mg·L^-1和2mg·L^-1的诱导率差异不明显。综合考虑，不定根愈伤组织诱导的最佳激素组合为2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA。

表3-20方差因素分析表

表3-21不同激素组合不定根愈伤组织诱导的影响

3.2.3不同激素组合对愈伤增殖的影响

3.2.3.1植物生长调节剂的单因素试验

选择质地疏松的愈伤组织接种到含有不同浓度的6-BA和TDZ的培养基中，相对愈伤增殖量差异不显著(P<0.05)(表3-22)。愈伤组织在含有TDZ的培养基中，均出现褐化现象，其中在浓度为0.1mg·L^-1中的褐化现象最严重。在含有6-BA的培养基中培养的愈伤组织呈黄白色颗粒状，而在6-BA浓度为0.5mg·L^-1中的愈伤有部分褐化，浓度1mg·L^-1和2mg·L^-1下的相对愈伤增殖量均在2.4g左右。综合考虑，愈伤组织增殖的细胞分裂素选用6-BA，浓度在1～2mg·L^-1左右。

选择质地疏松的愈伤组织在含不同浓度的生长素NAA和IAA的培养基中培养一个月后，相对愈伤增殖量差异显著(P<0.05)(表3-23)，愈伤组织呈黄白色颗粒状，褐化程度较轻。在浓度为0.1mg·L^-1NAA中培养的愈伤组织相对愈伤增殖量最高，为1.5g，0.3mg·L^{- 1}NAA和0.1mg·L^-1IAA处理下的相对愈伤增殖量差异不显著，而0.3mg·L^-1IAA处理下的相对愈伤增殖量最低，仅为0.5g，该处理中的愈伤组织大部分褐化死亡，不宜用于愈伤增殖培养中。综合考虑，愈伤增殖培养中的生长素选用NAA，浓度为0.1～0.3mg·L^-1。

表3-22 6-BA和TDZ对愈伤增殖的影响

3.2.3.2不同激素组合对愈伤增殖的影响

综合单因素试验结果，选用6-BA和NAA这两种激素用于愈伤组织的增殖培养，培养一个月后，相对愈伤增殖量差异显著(P<0.05)(表3-24)。在处理1mg·L^-16-BA+0.3mg·L^{- 1}NAA下生长的愈伤呈绿褐色，但相对愈伤增殖量最低，仅为0.7g。培养基1.5mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA、培养基2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA、培养基1.5mg·L^-16-BA+0.3mg·L^{- 1}NAA和培养基2mg·L^-16-BA+0.3mg·L^-1NAA下的愈伤部分褐化，相对愈伤增殖量差异不显著。培养基2.5mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA中愈伤的相对愈伤增殖量最大，为2.5g，愈伤组织呈黄白色颗粒状，质地疏松，是较好的分化材料。

表3-23生长素NAA和IAA对愈伤增殖的影响

表3-24 6-BA和NAA对愈伤增殖的影响

3.2.4不同激素对愈伤分化的影响

将乌头茎段和不定根诱导产生的愈伤组织转接到不定芽分化培养基中，培养一周后愈伤组织开始分化不定芽，培养一个月时发现部分愈伤分化为毛状根或不定根。各处理均能诱导出不定芽，激素对乌头愈伤组织分化率和平均芽数有较大影响，各处理间差异显著(P<0.05)(表3-25)。当6-BA浓度为2mg·L^-1时，分化率随NAA浓度的增大呈先增大后减小的趋势，NAA浓度为0.2mg·L^-1下的愈伤分化率最高，为61.54％，平均芽数为2.25个，NAA浓度为0.3mg·L^-1时平均芽数最多，为2.5个，但分化率仅为26.67％。此外，NAA浓度为0.3mg·L^-1的处理下的平均芽数较多，为2.43个，而一株长了类似于块根的瘤状物。6-BA浓度为4mg·L^-1时，分化率随NAA浓度的增大呈增大趋势，分别为33.33％和40.00％，平均芽数也差异显著，分别为1.42个和2.5个。当NAA浓度为0.2mg·L^-1时，愈伤分化率在TDZ的两个浓度梯度下呈减少趋势，而部分愈伤组织分化为毛状根。综合考虑，愈伤分化培养基选择培养基2mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA。

表3-25不同激素组合对愈伤组织分化的影响

表3-26 TDZ和NAA对叶片直接诱导不定芽的影响

3.2.6 6-BA和2,4-D不同浓度组合叶片直接诱导不定芽试验

接种一周后，无菌叶片开始增厚，颗粒状愈伤组织逐渐形成，十二天后愈伤开始分化成芽，部分分化为毛状根。一个月后统计的不同处理下的叶片诱导率、毛状根率和平均芽数差异显著(P<0.05)(表3-27)。2,4-D浓度为1mg·L^-1时，6-BA浓度分别为0.5mg·L^-1、1mg·L^-1这两种处理下的诱导率差异不显著，分别为27.66％和22.22％，6-BA浓度为4mg·L^-1时的诱导率(65.63％)显著高于其他处理。当2,4-D浓度为2mg·L^-1时，6-BA浓度为0.5mg·L^-1处理下的诱导率为零，6-BA浓度分别为1mg·L^-1和4mg·L^-1处理下的诱导率差异显著，分别为20.83％和50.00％。处理0.5mg·L^-16-BA+2mg·L^-12,4-D培养中的叶片无不定芽的产生，0.5mg·L^-16-BA+1mg·L^-12,4-D、1mg·L^-16-BA+1mg·L^-12,4-D和4mg·L^-16-BA+2mg·L^-12,4-D这三种培养基中的平均芽数差异不显著，分别为1.500个、1.375个和1.429个。4mg·L^-16-BA+1mg·L^-12,4-D处理下的平均芽数最高，达3.167个。此外，各个处理下均有毛状根的产生。0.5mg·L^-16-BA+2mg·L^-12,4-D培养基中虽无不定芽的产生，毛状根诱导率却显著高于其他处理，为73.33％。0.5mg·L^-16-BA+1mg·L^-12,4-D和1mg·L^-16-BA+2mg·L^-12,4-D这两种培养基中的毛状根率差异不显著，1mg·L^-16-BA+1mg·L^-12,4-D、4mg·L^-16-BA+1mg·L^-12,4-D和4mg·L^-16-BA+2mg·L^-12,4-D也差异不显著，但4mg·L^-16-BA+mg·L^{- 1}2,4-D处理下的毛状根率最低，仅为12.50％。综合考虑，无菌叶片直接诱导不定芽的培养基选用4mg·L^-16-BA+1mg·L^-12,4-D。转接分化的不定芽到增殖培养基MS+2mg·L^-1TDZ+0.3mg·L^-1NAA中的生长速度很快，三十天后长满到瓶口。

表3-27 6-BA和2,4-D对叶片直接诱导不定芽的影响

3.2.7三条再生途径的比较

茎段愈伤诱导不定芽的途径中，一个茎段可产生3.87个不定芽，不定根愈伤诱导不定芽的途径中，一条不定根可产生9.14个不定芽，而叶片直接诱导不定芽的途径中，一叶片可产生14.55个不定芽。因此叶片直接诱导不定芽途径能获得最多的不定芽。茎段愈伤诱导不定芽途径和不定根愈伤诱导不定芽途径所需时间相同均为90天，叶片直接诱导不定芽途径所需时间最短，仅为20天。综合效率和周期，茎段愈伤诱导不定芽途径中，一个茎段产生3.87个不定芽需要90天，不定根愈伤诱导不定芽途径中，一条不定根产生9.14个不定芽需要90天，而叶片直接诱导不定芽途径中，一叶片产生14.55个不定芽仅需20天。因此叶片直接诱导不定芽途径能在最短的时间内获得最多的不定芽。

综上可知，在最理想的状态下，(将叶片产生的不定芽增殖后生根培养，再用其不定根诱导的愈伤组织增殖分化为不定芽)能得到更多种苗，即一叶片经过300天的组织培养可产生91615.4株种苗。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种乌头附子种苗组织培养快繁再生方法，其特征在于，所述乌头附子种苗组织培养快繁再生方法包括：乌头快速繁殖方法、乌头再生繁殖方法和乌头快速育苗方法；

所述乌头快速繁殖方法包括：乌头茎段快速繁殖方法和种子快速繁殖方法；

所述乌头茎段繁殖方法包括：以乌头当年生枝条的第二个腋芽为外植体，乌头茎段组织培养的消毒条件是70％乙醇消毒50s，0.1％升汞消毒10min，MS+2mg·L^-16-BA+0.3mg·L^-1NAA中不定芽诱导；不定芽增殖条件：植物生长调节剂诱导；蔗糖浓度为30g·L^-1下增殖；继代周期为40天，继代2次；培养基生根；

所述种子快速繁殖方法包括：10％次氯酸钠消毒处理种子30min，种子的芽诱导培养条件：植物生长调节剂诱导条件是MS+2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA；400mg·L^-1赤霉素浸种12h乌头种子；中芽增殖，组培苗在培养基1/2MS+0.1mg·L^-1NAA上生根培养；移栽基质乌头组培苗生长；

所述乌头再生繁殖方法包括：乌头茎段和不定根为外植体的再生繁殖方法、乌头无菌叶片为外植体的再生繁殖方法；

所述乌头茎段和不定根为外植体的再生繁殖方法包括：以乌头茎段和不定根为外植体，诱导条件为4mg·L^-1 2,4-D+2mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1NAA+3mg·L^-1KT；不定根在MS+2mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1NAA下诱导，在2.5mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1NAA培养基中愈伤增殖；培养基中愈伤分化；

所述乌头无菌叶片为外植体的再生繁殖方法包括：以乌头无菌叶片为外植体，采用2,4-D和6-BA时，MS+4mg·L^-1 6-BA+1mg·L^-1 2,4-D中不定芽诱导；

所述乌头快速育苗方法包括：

以乌头无菌叶片为外植体，采用MS+4mg·L^-1 6-BA+1mg·L^-1 2,4-D中不定芽诱导；叶片产生的不定芽增殖后生根培养，再用其不定根诱导的愈伤组织增殖分化为不定芽，最后再将不定芽增殖生根得到种苗。

2.如权利要求1所述的乌头附子种苗组织培养快繁再生方法，其特征在于，所述乌头茎段繁殖方法中植物生长调节剂诱导条件是MS+2mg·L^-1TDZ+0.3mg·L^-1NAA；培养基1/2MS+0.5mg·L^-1IBA的生根。

3.如权利要求1所述的乌头附子种苗组织培养快繁再生方法，其特征在于，所述种子快速繁殖方法中MS+0.5mg·L^-1TDZ+0.1mg·L^-1NAA中芽增殖；移栽基质为50％营养土+50％河沙下乌头组培苗生长。

4.如权利要求1所述的乌头附子种苗组织培养快繁再生方法，其特征在于，所述乌头茎段和不定根为外植体的再生繁殖方法中：MS+2mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA培养基中愈伤分化。