CN109964810A - 一种获得香根鸢尾与德国鸢尾远缘杂种的方法 - Google Patents

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Abstract

一种获得香根鸢尾与德国鸢尾远缘杂种的方法，属于观赏植物生物技术育种技术领域，以香根鸢尾作为母本，德国鸢尾作为父本，通过对香根鸢尾花雌蕊柱头进行前处理、授粉、对授粉后20～35天膨大的子房经清洗和消毒后剥出幼胚、再经诱导愈伤、诱导分化成苗、扩繁和生根培养，即获得香根鸢尾与德国鸢尾远缘杂种幼苗。采用本发明获得的杂种成活率高，可以最大程度地克服香根鸢尾与德国鸢尾亲本之间的杂交障碍，最终实现了德国鸢尾与其近缘野生种的远缘杂交育种，对实现香味、抗性、复花等复杂性状的改良具有重要的现实意义。

Description

一种获得香根鸢尾与德国鸢尾远缘杂种的方法
技术领域
本发明属于观赏植物生物技术育种技术领域，具体涉及获得香根鸢尾与德国鸢尾远缘杂种的方法。
背景技术
观赏鸢尾（ornamental iris）泛指鸢尾科（Iridaceae）鸢尾属（Iris）中具有观赏价值的植物，可分为有髯鸢尾（bearded iris）、无髯鸢尾（beardless iris）和冠饰鸢尾（crested iris）3个类群。德国鸢尾（I. germanica）与香根鸢尾（I. pallida）均为观赏鸢尾中的有髯鸢尾类群，其特色是在外轮三枚花瓣的中肋部位具有一条浓密的髯毛附属物，髯毛的颜色、长度和形态在不同的品种或种之间富于变化，具有较高的观赏价值。
德国鸢尾被誉为观赏价值最高的鸢尾，在世界上分布范围最广、包含品种最多，花大、色艳、花型多样，目前已广泛应用于公园配置、盆栽甚至切花等生产领域。德国鸢尾的遗传背景较为复杂，据统计，至少有8个原生种在德国鸢尾的栽培进化过程中发挥了关键作用，致使德国鸢尾的花色、株高、花型等性状得到了极大的丰富。然而，在德国鸢尾的人工选育过程中，育种工作者往往更加重视观察起来更为直观的观赏性状的改良，而忽略了香味、抗性、复花等较难评价的生物学性状的改良。因此，目前德国鸢尾的优良品种丢失了许多原生种中本来所具有的优良的性状。近年来，随着德国鸢尾在世界范围内的广泛普及，除了花色、花型等性状外，其花香、抗性、复花以及繁殖能力等综合性状改良逐渐受到各国育种工作者的重视，实现各种优良性状的聚合已成为各国育种工作者的终极目标。
香根鸢尾是德国鸢尾的近缘种之一，不仅是一种观赏植物还是重要的香料作物，花香浓郁。利用香根鸢尾的根茎可以提取精油应用于化工产业，以鸢尾精油作为材料制成的香水被称为贵族香水，价格十分昂贵。除此之外，香根鸢尾叶片表皮毛较为浓密，具有较强的抗病、虫害能力，而且复花性状稳定、花量大。这些优异的性状对德国鸢尾综合性状的改良具有重要的应用价值。然而，德国鸢尾与香根鸢尾虽然亲缘关系较近，但是仍然存在明显的远缘杂交障碍，常规条件下杂交结实率极低，很难得到远缘杂种，尤其是以德国鸢尾作为母本，杂交障碍更为明显，目前尚无德国鸢尾与香根鸢尾杂交成功的报道，如能克服两者之间的远缘杂交障碍、获取远缘杂种，则有望实现德国鸢尾综合性状的提升，对于德国鸢尾品种改良以及更广范围的生产应用都具有积极的意义。
发明内容
本发明的目的就在于解决德国鸢尾与香根鸢尾远缘杂交障碍问题，提供一种获得香根鸢尾与德国鸢尾远缘杂种的方法。
本发明以香根鸢尾作为母本，德国鸢尾作为父本，本发明在选择亲本开展杂交育种时，作为父本的所述德国鸢尾的花期与香根鸢尾的花期相近。香根鸢尾自然花期为4月10日～20日，较早于德国鸢尾，优先选择与香根鸢尾花期相近的德国鸢尾品种作为父本；如花期不遇，需对德国鸢尾进行花期调控，使德国鸢尾花期提前，从而实现父母本花期相遇。
本发明通过以上步骤进行杂交育种：
步骤1：香根鸢尾花雌蕊柱头前处理：取外三轮花瓣完全伸展开，内三轮花瓣顶部尚未分离的香根鸢尾花朵，掰除所有花瓣以及雄蕊，仅保留雌蕊柱，将雌蕊柱头顶端纵向切成2～4片，或者横向剪去柱头总长度的1/3～1/2，再采用柱头处理液对柱头喷施2～3次。
本发明喷施2～3次，主要为了喷施均匀并给予处理液适当的反应时间，从而保证对雌蕊柱头表皮结构具有最佳的处理效果。
由于鸢尾花的花瓣颜色鲜艳，容易吸引昆虫，去除花瓣可以避免昆虫引起的杂交，保证后期定向杂交的准确性，从而保证杂种的纯度，而且去除花瓣后可以使后续杂交操作起来更为方便、快捷。远缘杂交障碍主要分为受精前障碍和受精后障碍，受精前障碍主要表现为授粉后雌蕊柱头发生胼胝质反应，形成的胼胝质会阻止花粉管进入子房。两种柱头纵向、横向物理切割处理的方法则都可以对柱头细胞的细胞壁以及胼胝质造成一定程度破坏，再结合处理液喷施，可以使花粉管顺利穿过柱头细胞间隙，进入子房完成受精，以克服远缘杂交的不亲和反应。
上述柱头处理液由无菌水和0.1～0.3 wt%硼酸、0.6～0.8 wt%CaCl2 、0.3～0.5wt%牛血清白蛋白（BSA）、0.2～0.4 wt%果胶酶、0.4～0.6 wt%纤维素酶和0.1～0.2 wt%赤霉酸组成，pH值为5～6。
由于植物柱头表皮结构成分复杂，含有纤维素、果胶，木质素等成分，上述采用的果胶酶、纤维素酶等可以促进柱头外壁溶解，破坏表皮结构，利于花粉管的进入，酶用量过少，则破坏效果不明显，花粉管仍然无法进入；用量过大，则可能对雌蕊甚至子房结构造成致命损伤，不利于受精、结实，结合香根鸢尾柱头组织较为发达的特点，故而选择上述的具体用量；组分中的牛血清白蛋白是酶的稳定剂，能有效减轻酶的变性；硼酸和氯化钙中的硼元素和钙元素以及赤霉素均是促进花粉管萌发和伸长的关键物质，上述物质的综合作用可以为花粉萌发、花粉管伸长以及进入柱头完成授粉受精提供良好的条件。
步骤2：将德国鸢尾花药内花粉涂抹在经过柱头前处理的香根鸢尾的柱头上，然后套上硫酸纸袋，完成授粉。具体是：用镊子夹取开花后第二天的德国鸢尾整个花药，将花药内花粉均匀地涂抹在经过柱头处理液喷施处理后20～30分钟的香根鸢尾的柱头上；授粉后置于23～27℃的温室中。
本发明在喷施处理后20～30分钟进行授粉，主要为了喷施均匀并给予处理液适当的反应时间，从而保证对雌蕊柱头表皮结构具有最佳的处理效果。
本发明授粉时，父本德国鸢尾的取粉时间为开花后第二天效果最佳，前期试验结果表明此时花粉的活力最高，过早则花药仍未开裂取不到花粉，过晚则花粉活力下降。
步骤3：选择授粉后20～35天膨大的子房，去除果柄和干掉的花序，先采用浓度为1～5wt %的洗洁精水溶液清洗后，用自来水流水冲洗，再在无菌工作台上，将子房置于浓度为70～75 wt %的酒精中浸泡30～60秒后，置于由吐温-20和过氧化氢水溶液组成的消毒液中浸泡后以无菌水冲洗，然后剥开果皮，取出胚珠并剥出幼胚。
经过以上步骤1、2处理后，可以大大克服远缘杂交过程中的受精前障碍，然而，完成授粉受精后，往往还存在受精后障碍，主要表现为胚胎败育，本发明利用幼胚拯救技术，在无菌条件下对香根鸢尾与德国鸢尾的杂种幼胚进行无菌培养。
本发明选择授粉后20～35天膨大的子房是因为此时杂种幼胚已形成，且种皮组织幼嫩，有助于剥出幼胚进行接种，过早幼胚尚未发育，过晚则幼胚开始败育，果皮开裂，包裹幼胚的种皮因为失水而变得坚硬致使剥出幼胚的难度增加，因此选择上述时间点作为幼胚的取材时间点。
进一步地，因果荚长期生长在自然环境下，表面不够洁净而且分布杂菌较多，无菌接种之前需对果荚进行清洗并消毒，本发明采用洗洁精水溶液进行清洗、流水冲洗后再通过酒精处理去低残留物，无污染，对生态环境友好。再用以吐温-20和过氧化氢水溶液组成的消毒液消毒后更为彻底。
步骤4：幼胚诱导：将幼胚接种于诱导培养基中进行诱导愈伤。
诱导培养基中含有：MS、0.2~0.5mgL-1 2,4-D、0.2~0.5mgL-1TDZ、蔗糖20~30gL-1和琼脂6~8gL-1，所述诱导培养基的pH值为5.6~5.8；
本发明采用激素2,4-D和TDZ，并利用上述浓度的激素处理对于幼胚愈伤诱导最具效果。
步骤5：对诱导愈伤后的幼胚进行诱导分化成苗，转接并扩繁，最后进行生根培养，即获得香根鸢尾与德国鸢尾远缘杂种幼苗。
具体方法是：所述步骤5）中，将经过25～35天诱导愈伤处理后的胚芽转接于由MS、0.05～0.1mgL-1 2,4-D、0.05～0.1 mgL-1TDZ、20～30gL-1蔗糖和6～8gL-1琼脂组成的、pH值为5.6～5.8的分化诱导培养基中进行分化诱导20～30天。
切取经过分化诱导后形成的幼苗的丛芽转入由MS、0.05～0.1mgL-1 2,4-D、0.2～0.5 mgL-1TDZ、20～30gL-1蔗糖和6～8gL-1琼脂组成的、pH值为5.6～5.8的组成的扩繁培养基，每15～20天转接入新鲜的扩繁培养基一次，进行扩繁培养。本发明每15～20天转接入新鲜的扩繁培养基是防止在同一扩繁培养基中时间过长导致培养基受污染、幼苗发生褐化死亡。
扩繁培养结束后转入由1/2MS、0.05～0.1mgL-1 NAA、20～30gL-1蔗糖和6～8gL-1琼脂组成的、pH值为5.6～5.8的生根培养基中进行生根培养，
步骤5）中的各个培养阶段的温度分别为20～25℃，光周期12～14hd-1，光照强度1500～2000lux。
本发明以上方法合理、获得的杂种成活率高。经反复试验表明，此方法可以最大程度的克服香根鸢尾与德国鸢尾亲本之间的杂交障碍，通过花期调控克服了父母本花期不遇的难题；通过柱头处理以及重复授粉克服了受精前杂交障碍；利用幼胚拯救技术克服了受精后杂交障碍，最终实现了德国鸢尾与其近缘野生种的远缘杂交育种，拓宽了德国鸢尾的育种思路和领域，扩展了德国鸢尾的遗传基础，通过本方法获得的远缘杂交新种质对于促进德国鸢尾栽培品种的更新，实现香味、抗性、复花等复杂性状的改良具有重要的现实意义。
进一步地，为了保证充足的花粉量，提高杂交的成功率，本发明所述步骤2）中，每隔20～30分钟重复将花粉涂抹在柱头上一次，循环操作2～3次。
所述步骤3中，所述消毒液中含有0.5～1 wt %的吐温-20和10～15 wt %的过氧化氢；以消毒液浸泡15～20分钟。添加吐温-20是因为果荚表面具有蜡质层，添加少量吐温-20具有活化效果，使消毒液与果皮接触更为充分，消毒更为彻底。所述消毒时间为15～20分钟是选择在过氧化氢安全浓度条件下，经反复的试验结果显示，采用该相应时间才能达到消毒杀菌的最佳效果。
所述步骤4中，在温度条件为20～25℃，在光周期为8～10hd-1、光照强度为1500～2000lux的条件下进行诱导愈伤。此条件可以保障杂种幼胚从活体到离体状态的转变，经恒温培养以及适当的光、暗交替处理，幼胚可在最短时间内适应诱导条件，实现较好的愈伤诱导。
具体实施方式
实施例1：
1）亲本选择：
以香根鸢尾作为母本，选择花期相差在3~5天以内的德国鸢尾作为父本，开展杂交育种工作。
2）雌蕊前处理：
无菌水配制柱头处理液，以使形成的处理液中含0.3 wt%硼酸、0.8 wt%CaCl2 、0.5wt%牛血清白蛋白（BSA）、0.4 wt%果胶酶、0.6 wt%纤维素酶、0.2 wt%赤霉酸，并且其pH值为5.4。
选择外三轮花瓣完全伸展开，内三轮花瓣顶部尚未分离的香根鸢尾花朵，用镊子掰除所有花瓣以及雄蕊，只保留雌蕊柱，利用手术剪将雌蕊柱头长度横向剪去柱头的1/3～1/2。
利用处理液对柱头进行喷施处理，喷施2次，喷施处理后20分钟进行授粉。
3）授粉：
选择开花后第二天的德国鸢尾，用镊子夹取德国鸢尾整个花药，将花药内花粉均匀的抹在处理过的香根鸢尾的柱头上，每隔20～30分钟再将花粉涂抹在柱头上一次，循环操作2～3次。然后套上硫酸纸袋，然后置于温度为23～27℃的智能温室中完成授粉。
4）取得幼胚：
洗洁精水溶液的制备：采用洗洁精和清水，以体积比为5∶100的比例混合，制得洗洁精水溶液。
消毒液的制备：采用吐温-20、过氧化氢和无菌水，以体积比为1∶15∶100的比例混合，制得消毒液。
选择授粉后30天膨大的子房，去除果柄和干掉的花序，首先利用洗洁精水溶液清洗5分钟，然后利用自来水流水冲洗15分钟，之后，在灭过菌的超净工作台上，将清洗过的子房置于体积比为75%的酒精中浸泡40秒，最后在消毒液中消毒20分钟，再以无菌水冲洗3～5次，用灭过菌的镊子和解剖刀剥开果皮，取出胚珠并剥出幼胚。
5）诱导愈伤：
诱导培养基的制备：采用MS、2,4-D（二氯苯氧乙酸）、TDZ（噻苯隆）、蔗糖和琼脂进行混合，并使其中分别含0.3mgL-1 2,4-D、0.5 mgL-1TDZ、20gL-1蔗糖、7gL-1琼脂，并且，诱导培养基的pH值为5.6～5.8。
采用无菌的镊子将幼胚接种于诱导培养基上，在温度为20～25℃、光周期为8hd-1、光照强度为1500lux条件下诱导愈伤。
6）获得幼苗：
分化诱导培养基的制备：采用MS、2,4-D、TDZ、蔗糖和琼脂进行混合，并使其中分别含0.1mgL-1 2,4-D、0.05 mgL-1TDZ、30gL-1蔗糖和7gL-1琼脂，且培养基的pH值为5.6～5.8。
扩繁培养基的制备：采用MS、TDZ、蔗糖和琼脂进行混合，并使其中分别含0.1mgL-1 2,4-D、0.2 mgL-1TDZ、30gL-1蔗糖和7gL-1琼脂，且培养基的pH值为5.6～5.8。
生根培养基的制备：采用MS、NAA（萘乙酸）、蔗糖和琼脂进行混合，并使其中含1/2MS和0.1mgL-1 NAA、30gL-1蔗糖和7gL-1琼脂，且培养基的pH值为5.6～5.8。
将经过30天诱导愈伤后的幼胚转接于分化诱导培养基中进行分化诱导，得到幼苗后切取丛芽转入扩繁培养基进行扩繁，每20天转接入新的扩繁培养基中一次，当幼苗达到100苗时，则扩繁培养结束，转入生根培养基中进行生根培养。
本步骤中以上各培养阶段的条件分别为：温度保持20～25℃，光周期14hd-1，光照强度1600lux。
经过生根培养后，即获得香根鸢尾与德国鸢尾的远缘杂种幼苗。
7）结果：
将根系发育良好的无菌苗置于室内自然条件下开瓶炼苗3～4天，之后用镊子取出幼苗洗净根系上的培养基，移栽到由质量比为1∶1∶1的泥炭、珍珠岩和蛭石组成的培养基质中进行常规管理，30天以后上盆管理。
实施例2：
1）亲本选择：
调控花期：德国鸢尾的花期调控主要是利用温度进行调节，可视具体品种的开花时间提前30～50天将德国鸢尾置于智能日光温室中栽培，保持昼温20～25℃，夜温6～10℃，可以将德国鸢尾开花时间提前5～15天。
温度调控植物花期的重要手段，提高生长环境的温度，可以使植物花期提前，通过多年的实践，本发明确定了使德国鸢尾花期提前的具体处理时间和处理温度，可以有效解决香根鸢尾与德国鸢尾花期不遇的难题。
本发明使用方法简单， 2月底天气回暖，利用日光温室内自然温度即可完成，无需增加电力、设备等额外成本。
以香根鸢尾作为母本，选择花期较晚的德国鸢尾作为父本，开展杂交育种工作。
2）雌蕊前处理：
无菌水配制柱头处理液，以使形成的处理液中含0.3wt%硼酸、0.8 wt%CaCl2 、0.5 wt%牛血清白蛋白（BSA）、0.4 wt%果胶酶、0.6 wt%纤维素酶、0.2 wt%赤霉酸，并且其pH值为5.4。
选择外三轮花瓣完全伸展开，内三轮花瓣顶部尚未分离的香根鸢尾花朵，用镊子掰除所有花瓣以及雄蕊，只保留雌蕊柱，利用解剖刀片将顶端部位纵向切成2～4片。
利用处理液对柱头进行喷施处理，喷施3次，喷施处理后20分钟进行授粉。
3）授粉：
选择开花后第二天的德国鸢尾，用镊子夹取德国鸢尾整个花药，将花药内花粉均匀的抹在处理过的香根鸢尾的柱头上，重复2～3次，套上硫酸纸袋，然后置于温度为23～27℃的智能温室中完成授粉。
4）取得幼胚：
洗洁精水溶液的制备：采用洗洁精和清水，以体积比为5∶100的比例混合，制得洗洁精水溶液。
消毒液的制备：采用吐温-20、过氧化氢和无菌水，以体积比为1∶15∶100的比例混合，制得消毒液。
选择授粉后30天膨大的子房，去除果柄和干掉的花序，首先利用洗洁精水溶液清洗5分钟，然后利用自来水流水冲洗15分钟，之后，在灭过菌的超净工作台上，将清洗过的子房置于体积比为75%的酒精中浸泡40秒，最后在消毒液中消毒20分钟，再以无菌水冲洗3～5次，用灭过菌的镊子和解剖刀剥开果皮，取出胚珠并剥出幼胚。
5）诱导愈伤：
诱导培养基的制备：采用MS、2,4-D（二氯苯氧乙酸）、TDZ（噻苯隆）、蔗糖和琼脂进行混合，并使其中分别含0.3mgL-1 2,4-D、0.5 mgL-1TDZ、20gL-1蔗糖、7gL-1琼脂，并且，诱导培养基的pH值为5.6～5.8。
采用无菌的镊子将幼胚接种于诱导培养基上，在温度为20～25℃、光周期为8hd-1、光照强度为1500lux条件下诱导愈伤。
6）获得幼苗：
分化诱导培养基的制备：采用MS、2,4-D、TDZ、蔗糖和琼脂进行混合，并使其中分别含0.1mgL-1 2,4-D、0.05 mgL-1TDZ、30gL-1蔗糖和7gL-1琼脂，且培养基的pH值为5.6～5.8。
扩繁培养基的制备：采用MS、TDZ、蔗糖和琼脂进行混合，并使其中分别含0.1mgL-1 2,4-D、0.2 mgL-1TDZ、30gL-1蔗糖和7gL-1琼脂，且培养基的pH值为5.6～5.8。
生根培养基的制备：采用MS、NAA（萘乙酸）、蔗糖和琼脂进行混合，并使其中含1/2MS和0.1mgL-1 NAA、30gL-1蔗糖和7gL-1琼脂，且培养基的pH值为5.6～5.8。
将经过30天诱导愈伤后的幼胚转接于分化诱导培养基中进行分化诱导，得到幼苗后切取丛芽转入扩繁培养基进行扩繁，每20天转接入新的扩繁培养基中一次，当幼苗达到100苗时，则扩繁培养结束，转入生根培养基中进行生根培养。
本步骤中以上各培养阶段的条件分别为：温度保持20～25℃，光周期14hd-1，光照强度1600lux。
经过生根培养后，即获得香根鸢尾与德国鸢尾的远缘杂种幼苗。
7）结果：
将根系发育良好的无菌苗置于室内自然条件下开瓶炼苗3～4天，之后用镊子取出幼苗洗净根系上的培养基，移栽到由质量比为1∶1∶1的泥炭、珍珠岩和蛭石组成的培养基质中进行常规管理，30天以后上盆管理。
实施例3：
1）亲本选择：
以香根鸢尾作为母本，选择花期相差在3~5天以内的德国鸢尾作为父本，开展杂交育种工作。
2）雌蕊前处理：
无菌水配制柱头处理液，以使形成的处理液中含0.3 wt%硼酸、0.8 wt%CaCl2 、0.5wt%牛血清白蛋白（BSA）、0.4 wt%果胶酶、0.6 wt%纤维素酶、0.2 wt%赤霉酸，并且其pH值为5.4。
选择外三轮花瓣完全伸展开，内三轮花瓣顶部尚未分离的香根鸢尾花朵，用镊子掰除所有花瓣以及雄蕊，只保留雌蕊柱，利用手术剪将雌蕊柱头长度横向剪去柱头的1/3～1/2，同时利用解剖刀片将柱头顶端纵向切成2～4片。
利用处理液对柱头进行喷施处理，喷施2次，喷施处理后20分钟进行授粉。
3）授粉：
选择开花后第二天的德国鸢尾，用镊子夹取德国鸢尾整个花药，将花药内花粉均匀的抹在处理过的香根鸢尾的柱头上，重复2～3次，套上硫酸纸袋，然后置于温度为23～27℃的智能温室中完成授粉。
4）取得幼胚：
洗洁精水溶液的制备：采用洗洁精和清水，以体积比为5∶100的比例混合，制得洗洁精水溶液。
消毒液的制备：采用吐温-20、过氧化氢和无菌水，以体积比为1∶15∶100的比例混合，制得消毒液。
选择授粉后30天膨大的子房，去除果柄和干掉的花序，首先利用洗洁精水溶液清洗5分钟，然后利用自来水流水冲洗15分钟，之后，在灭过菌的超净工作台上，将清洗过的子房置于体积比为75%的酒精中浸泡40秒，最后在消毒液中消毒20分钟，再以无菌水冲洗3～5次，用灭过菌的镊子和解剖刀剥开果皮，取出胚珠并剥出幼胚。
5）诱导愈伤：
诱导培养基的制备：采用MS、2,4-D（二氯苯氧乙酸）、TDZ（噻苯隆）、蔗糖和琼脂进行混合，并使其中分别含0.3mgL-1 2,4-D、0.5 mgL-1TDZ、20gL-1蔗糖、7gL-1琼脂，并且，诱导培养基的pH值为5.6～5.8。
采用无菌的镊子将幼胚接种于诱导培养基上，在温度为20～25℃、光周期为8hd-1、光照强度为1500lux条件下诱导愈伤。
6）获得幼苗：
分化诱导培养基的制备：采用MS、2,4-D、TDZ、蔗糖和琼脂进行混合，并使其中分别含0.1mgL-1 2,4-D、0.05 mgL-1TDZ、30gL-1蔗糖和7gL-1琼脂，且培养基的pH值为5.6～5.8。
扩繁培养基的制备：采用MS、TDZ、蔗糖和琼脂进行混合，并使其中分别含0.1mgL-1 2,4-D、0.2 mgL-1TDZ、30gL-1蔗糖和7gL-1琼脂，且培养基的pH值为5.6～5.8。
生根培养基的制备：采用MS、NAA（萘乙酸）、蔗糖和琼脂进行混合，并使其中含1/2MS和0.1mgL-1 NAA、30gL-1蔗糖和7gL-1琼脂，且培养基的pH值为5.6～5.8。
将经过30天诱导愈伤后的幼胚转接于分化诱导培养基中进行分化诱导，得到幼苗后切取丛芽转入扩繁培养基进行扩繁，每20天转接入新的扩繁培养基中一次，当幼苗达到100苗时，则扩繁培养结束，转入生根培养基中进行生根培养。
本步骤中以上各培养阶段的条件分别为：温度保持20～25℃，光周期14hd-1，光照强度1600lux。
经过生根培养后，即获得香根鸢尾与德国鸢尾的远缘杂种幼苗。
7）结果：
将根系发育良好的无菌苗置于室内自然条件下开瓶炼苗3～4天，之后用镊子取出幼苗洗净根系上的培养基，移栽到由质量比为1∶1∶1的泥炭、珍珠岩和蛭石组成的培养基质中进行常规管理，30天以后上盆管理。

Claims (4)

1.一种获得香根鸢尾与德国鸢尾远缘杂种的方法，以香根鸢尾作为母本，德国鸢尾作为父本，通过以下步骤进行杂交育种：
1）对香根鸢尾花雌蕊柱头进行前处理；
2）将德国鸢尾花药内花粉涂抹在经过柱头前处理的香根鸢尾的柱头上，然后套上硫酸纸袋，完成授粉；
3）选择授粉后20～35天膨大的子房，去除果柄和干掉的花序，经清洗和消毒后剥出幼胚；
4）将幼胚接种于诱导培养基中进行诱导愈伤；
5）对诱导愈伤后的幼胚进行诱导分化成苗，转接并扩繁，最后进行生根培养，即获得香根鸢尾与德国鸢尾远缘杂种幼苗；
其特征在于：
作为父本的所述德国鸢尾的花期与香根鸢尾的花期相近；
所述步骤1）中，取外三轮花瓣完全伸展开，内三轮花瓣顶部尚未分离的香根鸢尾花朵，掰除花瓣和雄蕊，仅保留雌蕊柱，将雌蕊柱头顶端纵向切成2～4片，或者横向剪去柱头总长度的1/3～1/2，再采用柱头处理液对柱头喷施2～3次；
所述柱头处理液由无菌水和0.1～0.3 wt%硼酸、0.6～0.8 wt%CaCl2 、0.3～0.5 wt%牛血清白蛋白、0.2～0.4 wt%果胶酶、0.4～0.6 wt%纤维素酶和0.1～0.2 wt%赤霉酸组成，pH值为5～6；
所述步骤2）中，用镊子夹取开花后第二天的德国鸢尾整个花药，将花药内花粉均匀地涂抹在经过柱头处理液喷施处理后20～30分钟的香根鸢尾柱头上；授粉后置于23～27℃的温室中；
所述步骤3）中，取去除果柄和花序已干掉的子房，先采用浓度为1～5wt %的洗洁精水溶液清洗后，用自来水流水冲洗，再在无菌工作台上，将子房置于浓度为70～75 wt %的酒精中浸泡30～60秒后，置于由吐温-20和过氧化氢水溶液组成的消毒液中浸泡后以无菌水冲洗，然后剥开果皮，取出胚珠并剥出幼胚；
所述步骤4）中，诱导培养基中含有：MS、0.2～0.5mgL-1 2,4-D、0.2～0.5mgL-1TDZ、蔗糖20～30gL-1和琼脂6～8gL-1，所述诱导培养基的pH值为5.6～5.8；
所述步骤5）中，将经过25～35天诱导愈伤处理后的胚芽转接于由MS、0.05～0.1mgL-1 2,4-D、0.05～0.1 mgL-1TDZ、20～30gL-1蔗糖和6～8gL-1琼脂组成的、pH值为5.6～5.8的分化诱导培养基中进行分化诱导20～30天；
切取经过分化诱导后形成的幼苗的丛芽转入由MS、0.05～0.1mgL-1 2,4-D、0.2～0.5mgL-1TDZ、20～30gL-1蔗糖和6～8gL-1琼脂组成的、pH值为5.6～5.8的扩繁培养基，每15～20天转接入新鲜的扩繁培养基一次，进行扩繁培养；
扩繁培养结束后转入由1/2MS、0.05～0.1mgL-1 NAA、20～30gL-1蔗糖和6～8gL-1琼脂组成的、pH值为5.6～5.8的生根培养基中进行生根培养；
步骤5）中的各个培养阶段的温度为20～25℃，光周期12～14hd-1，光照强度1500～2000lux。
2.根据权利要求1所述获得香根鸢尾与德国鸢尾远缘杂种的方法，其特征在于：所述步骤2）中，每隔20～30分钟重复将花粉涂抹在柱头上一次，循环操作2～3次。
3.根据权利要求1所述获得香根鸢尾与德国鸢尾远缘杂种的方法，其特征在于：所述步骤3）中，所述消毒液中含有0.5～1 wt %的吐温-20和10～15 wt %的过氧化氢；以消毒液浸泡15～20分钟。
4.根据权利要求1所述获得香根鸢尾与德国鸢尾远缘杂种的方法，其特征在于：所述步骤4）中，在温度条件为20～25℃，在光周期为8～10hd-1、光照强度为1500～2000lux的条件下进行诱导愈伤。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114027188A (zh) * 2021-11-02 2022-02-11 江苏省中国科学院植物研究所 一种利用幼胚获得鸢尾种间杂交后代的培养基及其应用
CN116784230A (zh) * 2023-08-14 2023-09-22 江苏省中国科学院植物研究所 一种快速获得荷兰鸢尾后代幼苗及优异种球的方法
CN116965325A (zh) * 2023-08-14 2023-10-31 江苏省中国科学院植物研究所 一种获得荷兰鸢尾杂交种子及种子萌发的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100775080B1 (ko) * 2006-06-29 2007-11-08 강원도 노랑무늬붓꽃의 생장점 배양을 통한 체세포배 형성과식물체 대량생산방법
CN103416296A (zh) * 2013-08-09 2013-12-04 镇江瑞繁农艺有限公司 一种提高睡莲自交结实率的方法
CN105746334A (zh) * 2016-03-03 2016-07-13 山东农业大学 一种促进植物远缘杂交结实的雌蕊处理试剂及其应用方法
CN107494267A (zh) * 2017-09-27 2017-12-22 江苏农林职业技术学院 一种德国鸢尾愈伤组织的培养方法
CN109156358A (zh) * 2018-09-26 2019-01-08 江苏省中国科学院植物研究所 一种德国鸢尾幼胚诱导胚性愈伤组织的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100775080B1 (ko) * 2006-06-29 2007-11-08 강원도 노랑무늬붓꽃의 생장점 배양을 통한 체세포배 형성과식물체 대량생산방법
CN103416296A (zh) * 2013-08-09 2013-12-04 镇江瑞繁农艺有限公司 一种提高睡莲自交结实率的方法
CN105746334A (zh) * 2016-03-03 2016-07-13 山东农业大学 一种促进植物远缘杂交结实的雌蕊处理试剂及其应用方法
CN107494267A (zh) * 2017-09-27 2017-12-22 江苏农林职业技术学院 一种德国鸢尾愈伤组织的培养方法
CN109156358A (zh) * 2018-09-26 2019-01-08 江苏省中国科学院植物研究所 一种德国鸢尾幼胚诱导胚性愈伤组织的方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARNOLD M.L.: "IRIS NELSONII (IRIDACEAE): ORIGIN AND GENETIC COMPOSITION OF A HOMOPLOID HYBRID SPECIES", 《AMERICAN JOURNAL OF BOTANY》 *
SHANNA, E.ET AL.: "Reproductive Interactions Between Hybridizing Irises: Analyses of Pollen-Tube Growth and Fertilization Success", 《AMERICAN JOURNAL OF BOTANY》 *
娄琦: "鸢尾种间杂交亲和性及胚胎学研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑 D048-219》 *
李玉萍等: "墨兰与大花蕙兰杂交育种研究", 《江苏农业科学》 *
李风童等: "有髯鸢尾杂交结实性分析及优异杂交组合筛选", 《江苏农业科学》 *
杨占辉等: "无髯鸢尾远缘杂交障碍", 《中国农业大学学报》 *
毕晓颖等: "马蔺与溪荪种间杂交亲和性研究", 《园艺学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114027188A (zh) * 2021-11-02 2022-02-11 江苏省中国科学院植物研究所 一种利用幼胚获得鸢尾种间杂交后代的培养基及其应用
CN116784230A (zh) * 2023-08-14 2023-09-22 江苏省中国科学院植物研究所 一种快速获得荷兰鸢尾后代幼苗及优异种球的方法
CN116965325A (zh) * 2023-08-14 2023-10-31 江苏省中国科学院植物研究所 一种获得荷兰鸢尾杂交种子及种子萌发的方法
CN116965325B (zh) * 2023-08-14 2024-05-03 江苏省中国科学院植物研究所 一种获得荷兰鸢尾杂交种子及种子萌发的方法

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