CN106520661A - 转化玉米的方法 - Google Patents

转化玉米的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106520661A
CN106520661A CN201610889121.5A CN201610889121A CN106520661A CN 106520661 A CN106520661 A CN 106520661A CN 201610889121 A CN201610889121 A CN 201610889121A CN 106520661 A CN106520661 A CN 106520661A
Authority
CN
China
Prior art keywords
corn
suspension cells
callus
salt
agrobacterium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610889121.5A
Other languages
English (en)
Inventor
周文祥
陈莉莉
张世平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Dbn Biotech Co Ltd
Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Dbn Biotech Co Ltd, Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd filed Critical Beijing Dbn Biotech Co Ltd
Priority to CN201610889121.5A priority Critical patent/CN106520661A/zh
Publication of CN106520661A publication Critical patent/CN106520661A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种转化玉米的方法，包括：所述诱导玉米愈伤组织的方法获得的所述初生愈伤组织，采用所述获得玉米悬浮细胞系的方法以获得玉米悬浮细胞系；农杆菌侵染所述玉米悬浮细胞系中的玉米悬浮细胞团。本发明转化玉米的方法首次由玉米幼胚诱导的初生愈伤组织，快速获得悬浮细胞系，实验周期缩短至40‑50天，操作简单方便，重复性好，同时使得玉米遗传转化不受季节性的影响，满足周年稳定转化的需求；再利用农杆菌侵染转化玉米悬浮细胞系，再生成苗；转化效率可以达到30％左右，转基因阳性率可达90％左右，其中单拷贝率约50％；由于显著降低了对玉米外植体(幼胚)供应的压力，进而大大减小了培养外植体所需的人力和物力消耗，实现规模化遗传转化。

Description

转化玉米的方法
技术领域
本发明涉及一种植物转化的方法，特别是涉及一种转化玉米悬浮细胞系获得转基因植株的方法。
背景技术
玉米(Zea mays L.)是世界三大粮食作物之一，也是重要的工业原料和生物能源物质，在我国乃至全世界的粮食生产中都占有举足轻重的地位。在提高玉米单产的诸多因素中，新品种选育的作用占40％。随着分子生物学技术的长足发展，转基因技术开始在玉米新品种选育中发挥重要作用。转基因玉米已经成为仅次于转基因大豆的全球种植面积第二大的转基因作物。
良好的受体系统是玉米遗传转化的一个重要环节，关系到提供适宜转化的受体材料以及转化后的细胞能否再生为正常植株等问题。迄今为止，玉米最有效的受体材料包括幼胚、幼胚诱导的愈伤组织和细胞悬浮培养得到的愈伤组织，另外还有成熟胚诱导的愈伤组织、胚性愈伤组织或悬浮细胞系分离出的原生质体和茎尖分生组织等。与此同时，玉米的遗传转化方法主要有农杆菌介导法、基因枪轰击法、电击法、PEG法和花粉管通道法等，其中农杆菌介导法和基因枪轰击法为目前常用的转基因方法。
目前，农杆菌介导幼胚的玉米遗传转化方法被广泛采用，但其具有成本高、取材受季节限制、以及状态不稳定等缺点。虽然已有成熟胚诱导悬浮细胞系分离出的原生质体和茎尖分生组织的成功案例，但是现有技术一般采用基因枪轰击悬浮细胞系的方法，悬浮细胞系的制备方法需要经过漫长的继代过程才能获得TypeII型愈伤组织，再由TypeII型愈伤组织制备悬浮细胞系，不仅操作繁琐，而且周期长；由基因枪轰击法获得的转化子不仅转基因拷贝数高，加大了后续性状筛选工作的难度，而且转化效率较低、不稳定；而经农杆菌侵染后的悬浮细胞系，会产生防卫反应，释放活性氧，易导致愈伤组织褐化死亡，难以获得抗性愈伤组织进而再生成稳定表达的植株。因此，需要开发一个成本低，取材方便，周期短、转化效率稳定的遗传转化体系。
发明内容
本发明的目的是提供一种转化玉米的方法，有效克服现有技术成本高、取材受季节限制、周期长、状态不稳定等技术缺陷。
为实现上述目的，本发明提供了一种诱导玉米愈伤组织的方法，包括将玉米幼胚接种于愈伤组织诱导培养基以诱导初生愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基包含麦草畏、毒莠定和激动素。
优选地，所述麦草畏的浓度为0.2-10mg/L，所述毒莠定的浓度为0.2-10mg/L，所述激动素的浓度为0.01-5mg/L。
更优选地，所述麦草畏的浓度为2mg/L，所述毒莠定的浓度为2.2mg/L，所述激动素的浓度为0.3mg/L。
进一步地，所述愈伤组织诱导培养基还包含苄氨基嘌呤。
优选地，所述苄氨基嘌呤的浓度为0.01-5mg/L。
更优选地，所述苄氨基嘌呤的浓度为0.02mg/L。
更进一步地，所述愈伤组织诱导培养基包含大量盐、微量盐、有机质、脯氨酸、水解酪蛋白、天冬氨酸、蔗糖和2,4-D。
优选地，所述愈伤组织诱导培养基包含MS盐、N6维生素、脯氨酸0.1-5g/L、水解酪蛋白0.1-5g/L、天冬氨酸0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、2,4-D 0.1-5mg/L、麦草畏0.2-10mg/L、毒莠定0.2-10mg/L、激动素0.01-5mg/L和苄氨基嘌呤0-5mg/L。
可选地，所述愈伤组织诱导培养基包含MS盐、N6维生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.2g/L、蔗糖30g/L、2,4-D 1.5mg/L、麦草畏2mg/L、毒莠定2.2mg/L和激动素0.3mg/L。
可选地，所述愈伤组织诱导培养基包含MS盐、N6维生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.2g/L、蔗糖30g/L、2,4-D 1.5mg/L、麦草畏2mg/L、毒莠定2.2mg/L、激动素0.3mg/L和苄氨基嘌呤0.02mg/L。
为实现上述目的，本发明还提供了一种获得玉米悬浮细胞系的方法，包括将所述诱导玉米愈伤组织的方法获得的所述初生愈伤组织通过悬浮培养液进行悬浮培养以获得玉米悬浮细胞系。
具体地，所述获得玉米悬浮细胞系的方法包括：
所述诱导玉米愈伤组织的方法获得的所述初生愈伤组织通过第一悬浮培养液进行悬浮培养和继代以获得悬浮细胞团；
所述悬浮细胞团通过第二悬浮培养液进行悬浮培养以获得悬浮细胞系。
更具体地，所述获得玉米悬浮细胞系的方法包括：
所述诱导玉米愈伤组织的方法获得的所述初生愈伤组织通过第一悬浮培养液进行悬浮培养10-25天，然后继代2-3次以获得悬浮细胞团；
所述悬浮细胞团通过第二悬浮培养液进行悬浮培养5-7天以获得悬浮细胞系。
在上述技术方案的基础上，所述第一悬浮培养液包含MS盐或N6盐、MS维生素、脯氨酸0.1-5g/L、水解酪蛋白0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、麦草畏0.2-10mg/L和2,4-D 0.1-5mg/L。
优选地，所述第一悬浮培养液包含MS盐、MS维生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖45g/L、麦草畏1.5mg/L和2,4-D 1mg/L。
进一步地，所述第二悬浮培养液包含MS盐或N6盐、MS维生素、脯氨酸0.1-5g/L、水解酪蛋白0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L和麦草畏0.2-10mg/L。
优选地，所述第二悬浮培养液包含MS盐、MS维生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖30g/L和麦草畏1.5mg/L。
为实现上述目的，本发明还提供了一种大量扩增玉米悬浮细胞系的方法，包括采用所述获得玉米悬浮细胞系的方法获得的所述玉米悬浮细胞系通过悬浮培养液进行继代以扩增玉米悬浮细胞系。
具体地，所述大量扩增玉米悬浮细胞系的方法包括采用所述获得玉米悬浮细胞系的方法获得的所述玉米悬浮细胞系通过第二悬浮培养液进行继代以扩增玉米悬浮细胞系。
优选地，所述第二悬浮培养液包含MS盐或N6盐、MS维生素、脯氨酸0.1-5g/L、水解酪蛋白0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L和麦草畏0.2-10mg/L。
具体地，所述第二悬浮培养液包含MS盐、MS维生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖30g/L和麦草畏1.5mg/L。
为实现上述目的，本发明还提供了一种节省玉米外植体的方法，包括所述诱导玉米愈伤组织的方法获得的所述初生愈伤组织，采用所述获得玉米悬浮细胞系的方法以获得玉米悬浮细胞系，将所述玉米悬浮细胞系通过悬浮培养液进行继代以扩增玉米悬浮细胞系。
为实现上述目的，本发明还提供了一种提高农杆菌侵染效率的方法，包括农杆菌侵染预处理后的玉米悬浮细胞团，所述玉米悬浮细胞团来自采用所述获得玉米悬浮细胞系的方法获得的所述玉米悬浮细胞系，所述预处理包括热激处理。
进一步地，所述热激处理的时间为不超过8分钟。
更进一步地，所述热激处理的温度为30-60℃。
优选地，所述热激处理的温度为42℃或60℃。
更优选地，所述热激处理为温度60℃烘箱热激处理5分钟。
可选地，所述预处理还包括超声波处理。
在上述技术方案的基础上，所述提高农杆菌侵染效率的方法包括：
玉米悬浮细胞团经过预培养以获得预培养后的玉米悬浮细胞团；
所述预培养后的玉米悬浮细胞团经过预处理以获得预处理后的玉米悬浮细胞团；
农杆菌侵染所述预处理后的玉米悬浮细胞团；
侵染后的玉米悬浮细胞团与所述农杆菌共培养以获得共培养后的玉米悬浮细胞团。
为实现上述目的，本发明还提供了一种有效筛选玉米抗性愈伤组织的方法，包括将所述提高农杆菌侵染效率的方法获得的所述共培养后的玉米悬浮细胞团在含有选择剂的筛选培养基上培养并选择抗性愈伤组织。
进一步地，所述选择剂为抗生素、除草剂或糖类。
具体地，所述有效筛选玉米抗性愈伤组织的方法包括：将所述提高农杆菌侵染效率的方法获得的所述共培养后的玉米悬浮细胞团在含有双丙氨膦的第一筛选培养基上培养后，再在含有双丙氨膦的第二筛选培养基上进行培养，选择抗性愈伤组织。
优选地，所述第二筛选培养基中双丙氨膦的浓度为50-100mg/L。
进一步地，所述第二筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、麦草畏0.2-10mg/L、毒莠定0.2-10mg/L、特美汀20-500mg/L、激动素0.01-5mg/L和双丙氨膦50-100mg/L。
优选地，所述第二筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麦草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激动素0.2mg/L和双丙氨膦100mg/L。
在上述技术方案的基础上，所述第一筛选培养基中双丙氨膦的浓度为3-5mg/L。
优选地，所述第一筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、麦草畏0.2-10mg/L、毒莠定0.2-10mg/L、特美汀20-500mg/L、激动素0.01-5mg/L和双丙氨膦3-5mg/L。
可选择地，所述第一筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麦草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激动素0.2mg/L和双丙氨膦3mg/L。
可选择地，所述第一筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麦草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激动素0.2mg/L和双丙氨膦5mg/L。
为实现上述目的，本发明还提供了一种转化玉米的方法，包括：
所述诱导玉米愈伤组织的方法获得的所述初生愈伤组织，采用所述获得玉米悬浮细胞系的方法以获得玉米悬浮细胞系；
农杆菌侵染所述玉米悬浮细胞系中的玉米悬浮细胞团。
所述农杆菌侵染所述玉米悬浮细胞系中的玉米悬浮细胞团具体为农杆菌侵染预处理后的所述玉米悬浮细胞系中的玉米悬浮细胞团，所述预处理包括热激处理。
进一步地，所述热激处理的时间为不超过8分钟。
更进一步地，所述热激处理的温度为30-60℃。
优选地，所述热激处理的温度为42℃或60℃。
更优选地，所述热激处理为温度60℃烘箱热激处理5分钟。
可选地，所述预处理还包括超声波处理。
在上述技术方案的基础上，所述转化玉米的方法包括：
所述玉米悬浮细胞系中的玉米悬浮细胞团经过预培养以获得预培养后的玉米悬浮细胞团；
所述预培养后的玉米悬浮细胞团经过预处理以获得预处理后的玉米悬浮细胞团；
农杆菌侵染所述预处理后的玉米悬浮细胞团；
侵染后的玉米悬浮细胞团与所述农杆菌共培养以获得共培养后的玉米悬浮细胞团。
为实现上述目的，本发明还提供了一种生产稳定转化的玉米植物的方法，包括：
所述诱导玉米愈伤组织的方法获得的所述初生愈伤组织，采用所述获得玉米悬浮细胞系的方法以获得玉米悬浮细胞系；
农杆菌侵染所述玉米悬浮细胞系中的玉米悬浮细胞团；
侵染后的玉米悬浮细胞团与所述农杆菌共培养；
在含有选择剂的培养基上培养并选择抗性愈伤组织；
所述抗性愈伤组织再生为玉米植物。
所述农杆菌侵染所述玉米悬浮细胞系中的玉米悬浮细胞团具体为农杆菌侵染预处理后的所述玉米悬浮细胞系中的玉米悬浮细胞团，所述预处理包括热激处理。
进一步地，所述热激处理的时间为不超过8分钟。
更进一步地，所述热激处理的温度为30-60℃。
优选地，所述热激处理的温度为42℃或60℃。
更优选地，所述热激处理为温度60℃烘箱热激处理5分钟。
可选地，所述预处理还包括超声波处理。
在上述技术方案的基础上，所述生产稳定转化的玉米植物的方法包括：
所述玉米悬浮细胞系中的玉米悬浮细胞团经过预培养以获得预培养后的玉米悬浮细胞团；
所述预培养后的玉米悬浮细胞团经过预处理以获得预处理后的玉米悬浮细胞团；
农杆菌侵染所述预处理后的玉米悬浮细胞团。
在上述技术方案的基础上，所述选择剂为抗生素、除草剂或糖类。
所述在含有选择剂的培养基上培养并选择抗性愈伤组织具体为将共培养后的玉米悬浮细胞团在含有双丙氨膦的第一筛选培养基上培养后，再在含有双丙氨膦的第二筛选培养基上进行培养，选择抗性愈伤组织。
优选地，所述第二筛选培养基中双丙氨膦的浓度为50-100mg/L。
进一步地，所述第二筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、麦草畏0.2-10mg/L、毒莠定0.2-10mg/L、特美汀20-500mg/L、激动素0.01-5mg/L和双丙氨膦50-100mg/L。
优选地，所述第二筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麦草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激动素0.2mg/L和双丙氨膦100mg/L。
在上述技术方案的基础上，所述第一筛选培养基中双丙氨膦的浓度为3-5mg/L。
优选地，所述第一筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、麦草畏0.2-10mg/L、毒莠定0.2-10mg/L、特美汀20-500mg/L、激动素0.01-5mg/L和双丙氨膦3-5mg/L。
可选择地，所述第一筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麦草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激动素0.2mg/L和双丙氨膦3mg/L。
可选择地，所述第一筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麦草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激动素0.2mg/L和双丙氨膦5mg/L。
本发明中的克隆基因、表达盒、载体(例如质粒)、蛋白和蛋白片段、以及转化的细胞核植物均可使用标准方法生产。
本发明可用于在玉米植物中表达任何目的基因。目的基因可以是耐除草剂基因、抗病基因或抗虫基因，或者是选择或评价标记，并含有植物可操作的启动子、编码区和终止子区。耐除草剂基因包括对咪唑啉酮或磺酰脲除草剂耐受的AHAS基因、对草丁膦除草剂耐受的PAT或bar基因、对草甘膦除草剂耐受的EPSPS基因等。抗病基因包括抗生素合成酶基因，例如硝吡咯菌素合成酶基因，植物来源的抗性基因等。抗虫基因包括苏云金芽孢杆菌杀虫基因。目的基因也可以编码与生物化学途径有关的酶，该酶的表达可改变食物、饲料、营养药和/或药物生产中重要的性状。目的基因可以位于质粒上。适合本发明使用的质粒可以含有一个以上目的基因和/或农杆菌可含有带有不同目的基因的不同质粒。
本发明中所述“玉米”是指玉蜀黍(Zea mays)，所述方法是以农杆菌介导的目的基因传输到玉米悬浮细胞团，之后再生为转化的玉米植物为基础的。
在选择剂存在的情况下培养转化的玉米细胞。优选地，用草丁膦乙酰转移酶(PAT)基因转化，并且转化的基因在双丙氨磷存在的情况下培养。在含有双丙氨磷为选择剂的培养基中，PAT基因转化的玉米细胞选择性生长。
含有异源核酸(即含有按照本发明的方法转化的细胞或组织)的转基因植物以及通过该转基因植物产生的种子和后代是本发明所涉及的。将转化的细胞培养成有用栽培品种的方法是本领域技术人员公知的。植物组织体外培养技术和整个植株再生技术也是公知的。相应的，所述“种子”包括这些转化植物的种子以及转化植物后代产生的种子。所述“植物”不仅包括转化和再生的植物，还包括通过本发明的方法产生的转化和再生植物的后代。
可以从本发明的方法产生的植物中筛选成功的转化植物。为了开发改良的植物和种子品系，可以持续地筛选和选择本发明再生植物的种子和子代植物以使转基因和整合的核酸序列持续存在。因此，可以将所需要的转基因核酸序列移入(即渐渗或交配)其它的遗传品系如某些原种或商业上有用的品系或品种中。渐渗目的基因进入遗传植物品系的方法可通过本领域公知的多种技术来实现，包括通过传统的育种、原生质体融合、细胞核转移以及染色体转移。育种方法和技术也是本领域公知的。根据本发明获得的转基因植物和自交系可用于生产商业上有价值的杂交植物和农作物。
本发明提供了一种转化玉米的方法，具有以下优点：
1、稳定。本发明转化玉米的方法在实验室条件下即可大量繁殖悬浮细胞系，克服了大田材料受天气条件限制，无法准确的预计外植体收获情况的缺陷，从而使得玉米遗传转化不受季节性的影响，满足周年稳定转化的需求。
2、周期短。本发明转化玉米的方法中可由玉米幼胚诱导的初生愈伤组织快速获得悬浮细胞系，而无需在固体培养基上长时间继代获得TypeII型愈伤组织，再由TypeII型愈伤组织获得悬浮细胞系，故实验周期由6个月缩短至40-50天，且操作简单方便，重复性好。
3、本发明首次由玉米幼胚获得悬浮细胞系，优选地选择愈伤组织诱导培养基CIM-D获得的愈伤组织表面突起明显、颜色鲜嫩，并且生长速度明显提高，有利于直接制备玉米悬浮细胞系；再利用农杆菌侵染转化玉米悬浮细胞系，优选地，经预处理(即60℃热处理5分钟)的玉米悬浮细胞系可以显著提高农杆菌侵染效率；经过筛选的玉米悬浮细胞系再生成苗，优选地，当筛选培养基S2中双丙氨磷浓度达到100mg/L时，阳性率和转化效率最高。
4、转化效率高。本发明转化玉米的方法的转化效率可以达到30％左右，转基因阳性率可达90％左右，其中单拷贝率约40％。
5、转化成本低。由于本发明转化玉米的方法可以提供大量优良的玉米悬浮细胞系，所以显著降低了对玉米外植体(幼胚)供应的压力，进而大大减小了培养外植体所需的人力和物力消耗，可进行规模化遗传转化。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明转化玉米的方法的重组克隆载体DBN01-T构建流程图；
图2为本发明转化玉米的方法的重组表达载体DBN100001构建流程图；
图3为本发明转化玉米的方法的诱导的愈伤组织形态图；
图4为本发明转化玉米的方法的多个玉米悬浮细胞团效果图；
图5为本发明转化玉米的方法的玉米悬浮细胞系效果图；
图6为本发明转化玉米的方法的玉米悬浮细胞团中红色荧光蛋白DsRed的瞬时表达效果图；
图7为本发明转化玉米的方法的转基因阳性玉米植株效果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明转化玉米的方法的技术方案。
第一实施例、重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌
1、构建含有目的基因的重组克隆载体
将PAT核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T(Promega，Madison，USA，CAT：A3600)上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体DBN01-T，其构建流程如图1所示(其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启动子；PAT为草丁膦乙酰转移酶基因核苷酸序列(SEQ ID NO:1)；MCS为多克隆位点)。
然后将重组克隆载体DBN01-T用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞(Transgen，Beijing，China，CAT：CD501)，其热激条件为：50μL大肠杆菌T1感受态细胞、10μL质粒DNA(重组克隆载体DBN01-T)，42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时(200r/min转速下摇床摇动)，在表面涂有IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000r/min转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μL冰预冷的溶液I(25mM Tris-HCl，10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)悬浮；加入200μL新配制的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS(十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μL冰冷的溶液III(3M醋酸钾，5M醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000r/min条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000r/min条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度(V/V)为70％的乙醇洗涤后晾干；加入30μL含RNase(20μg/mL)的TE(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。
提取的质粒经酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体DBN01-T中插入的PAT核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
按照上述构建重组克隆载体DBN01-T的方法，将DsRed核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T上，得到重组克隆载体DBN02-T。酶切和测序验证重组克隆载体DBN02-T中插入的DsRed核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
2、构建含有目的基因的重组表达载体
用限制性内切酶KpnI和PvuI分别酶切重组克隆载体DBN02-T和DBNBC-01(载体骨架：基于pCAMBIA3300改造(CAMBIA机构可以提供))，将切下的DsRed核苷酸序列插入到表达载体DBNBC-01中，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBNBC-01-DsRed；进而用限制性内切酶SacI和SnaBI分别酶切DBN01-T和前面所述重组表达载体DBNBC-01-DsRed，将切下的PAT核苷酸序列插入到表达载体DBNBC-01-DsRed中，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN100001，其构建流程如图2所示(Kan：卡那霉素基因序列；RB：右边界；pr35S：花椰菜花叶病毒35S启动子序列(SEQ ID NO:3)；DsRed：红色荧光蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)；tNos：胭脂碱合成酶基因的终止子序列(SEQ ID NO:4)；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因启动子序列(SEQ ID NO:5)；PAT：草丁膦乙酰转移酶的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)；t35S：花椰菜花叶病毒35S终止子序列(SEQ ID NO:6)；LB：左边界)。
将重组表达载体DBN100001用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μL大肠杆菌T1感受态细胞、10μL质粒DNA(重组表达载体DBN100001)，42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时(200rpm转速下摇床摇动)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上于温度37℃条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。提取的质粒经酶切后鉴定后，对阳性克隆进行测序鉴定，结果表明PAT核苷酸序列和DsRed核苷酸序列均正确插入到重组表达载体DBN100001中。
3、重组表达载体转化农杆菌
对己经构建正确的重组表达载体DBN100001用液氮法转化到农杆菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015)中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA(重组表达载体)；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素的LB固体平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，酶切验证结果表明重组表达载体DBN100001结构完全正确。
第二实施例、转基因玉米植株的获得
1、玉米幼胚的剥取
将玉米品种齐319(Q319)的种子播种于温室或大田中，待玉米植株长成授粉后7-12天，收获玉米雌穗，用浓度为75％(v/v)的酒精浸泡5min后剥取幼胚，挑选长度为0.6-1.2mm的透明幼胚备用。
2、筛选愈伤诱导培养基
将上述剥取的玉米幼胚接种到下述5种不同的愈伤诱导培养基上进行愈伤组织的诱导，于温度28℃的条件下暗培养10-14天，优选为14天，统计愈伤组织诱导率并观察愈伤组织形态，结果如表2所示。每种愈伤诱导培养基设三次重复，每个重复接种100个幼胚。所述5种不同的愈伤诱导培养基是在愈伤基础诱导培养基CIM(MS盐4.3g/L、N6维生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.2g/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1.5mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)的基础上，设计了不同种类和不同浓度激素的组合处理，具体信息如表1所示。
表1、5种不同的愈伤诱导培养基的具体信息表
表2、5种不同愈伤诱导培养基的愈伤组织诱导率和愈伤组织形态的实验结果
上述表1和表2的结果表明，常规的愈伤诱导培养基CIM中含有浓度为1.5mg/L的2,4-D，但培养基CIM诱导效率低，长势慢，胚性差，无法满足实验需求；愈伤诱导培养基CIM-A为在所述愈伤诱导培养基CIM基础上添加了浓度为2mg/L的麦草畏(Dicamba)，所述愈伤诱导培养基CIM-A可以显著提高愈伤组织诱导率，但愈伤长势仍比较慢，并且表面光滑突起较少，无法制备悬浮细胞系；愈伤诱导培养基CIM-B为在所述愈伤诱导培养基CIM-A基础上添加了浓度为2.2mg/L的毒莠定(Picloram)，所述愈伤诱导培养基CIM-B虽然不能显著提高愈伤组织诱导率，但是可以提高愈伤组织的诱导质量，诱导培养后逐渐形成表面突起的胚性愈伤组织；所述愈伤诱导培养基CIM-C为在所述愈伤诱导培养基CIM-B基础上添加了浓度为0.3mg/L激动素(KT)，所述愈伤诱导培养基CIM-C可以显著提高愈伤组织诱导率，诱导培养后得到较多可用于制备悬浮细胞系的胚性愈伤组织；所述愈伤诱导培养基CIM-D为在所述愈伤诱导培养基CIM-C基础上添加了0.02mg/L苄氨基嘌呤(BAP)，所述愈伤诱导培养基CIM-D的愈伤组织诱导率可高达97.66％，显著高于其他4个处理，且如图3所示，诱导培养后的愈伤表面突起明显，颜色鲜嫩，生长速度明显提高，可用于制备玉米悬浮细胞系。
根据筛选结果，选择所述愈伤诱导培养基CIM-D(MS盐4.3g/L、N6维生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.2g/L、蔗糖30g/L、Dicamba2mg/L、2,4-D 1.5mg/L、Picloram 2.2mg/L、KT 0.3mg/L、BAP 0.02mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)对玉米幼胚进行诱导培养已获得初生愈伤组织。
在本实施例的愈伤诱导培养基中，脯氨酸的浓度可以为0.1-5g/L，水解酪蛋白的浓度可以为0.1-5g/L，天冬氨酸的浓度可以为0.1-5g/L、蔗糖的浓度可以为5-100g/L，Dicamba的浓度可以为0.2-10mg/L，2,4-D的浓度可以为0.1-5mg/L，Picloram的浓度可以为0.2-10mg/L，KT的浓度可以为0.01-5mg/L，BAP的浓度可以为0-5mg/L；上述成分均可以在其浓度范围内进行任意组合，但以所述愈伤诱导培养基CIM-D(MS盐4.3g/L、N6维生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.2g/L、蔗糖30g/L、Dicamba 2mg/L、2,4-D 1.5mg/L、Picloram 2.2mg/L、KT 0.3mg/L、BAP 0.02mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)为优选。
3、制备玉米悬浮细胞系
玉米悬浮细胞系的起始：将获得的表面突起明显且色泽鲜黄的所述初生愈伤组织转移至装有75mL悬浮培养液SUS-1(MS盐4.3g/L、MS维生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖45g/L、Dicamba 1.5mg/L、2,4-D 1mg/L，pH5.8)的无菌三角瓶(150mL)中，每个三角瓶中接种5-8粒所述初生愈伤组织，在温度为28-30℃暗培养条件下，将密封的上述三角瓶置于转速为100-150r/min恒温摇床上震荡培养。
在本实施例上述悬浮培养液SUS-1中，MS盐还可以为N6盐(浓度为3.95g/L)，脯氨酸的浓度可以为0.1-5g/L，水解酪蛋白的浓度可以为0.1-5g/L，蔗糖的浓度可以为5-100g/L，Dicamba的浓度可以为0.2-10mg/L，2,4-D的浓度可以为0.1-5mg/L；上述成分均可以在其浓度范围内进行任意组合，但以所述悬浮培养液SUS-1(MS盐4.3g/L、MS维生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖45g/L、Dicamba 1.5mg/L、2,4-D 1mg/L，pH5.8)为优选。
玉米悬浮细胞系的获得：所述初生愈伤组织悬浮培养10-25天后进行第一次继代，优选为20天，继代时剔除褐化死亡的细胞组织，在原三角瓶中保留生长旺盛、质地坚硬、色泽鲜黄的新生细胞组织，且在保留一半原有悬浮培养液SUS-1的基础上，加入新的玉米悬浮培养液SUS-1至三角瓶75mL刻度处，在温度为28-30℃暗培养条件下，将密封的上述三角瓶置于转速为100-150r/min恒温摇床上震荡培养，以便获得大量的细胞组织；之后每周继代一次，每次继代均需剔除褐化死亡的细胞组织，保留新生细胞组织，且每次继代均保留一半原有悬浮培养液SUS-1，并加入新的悬浮培养液SUS-1至三角瓶75mL刻度处，在温度为28-30℃暗培养条件下，将所述三角瓶置于转速为100-150r/min恒温摇床上震荡培养。所述初生愈伤组织悬浮培养35-45天后，优选为40天，逐渐产生结构松散的多个悬浮细胞团(如图4所示)，将所述悬浮细胞团转移至装有75mL悬浮培养液SUS-2(MS盐4.3g/L、MS维生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖30g/L、Dicamba 1.5mg/L，pH5.8)新的无菌三角瓶(150mL)中，每个三角瓶中接种20-30粒所述悬浮细胞团，在温度为28-30℃暗培养条件下，将密封的上述三角瓶置于转速为100-150r/min恒温摇床上震荡培养5-7天后，多个所述悬浮细胞团即可形成分散良好、增值迅速的玉米悬浮细胞系(如图5所示)，即整个玉米悬浮细胞系的制备周期为40-50天。
玉米悬浮细胞系的继代：将制备的所述玉米悬浮细胞系每周继代一次，每次继代时将每个三角瓶中的所述悬浮细胞系平均转移至三个分别装有75mL悬浮培养液SUS-2新的无菌三角瓶中，在温度为28-30℃暗培养条件下，将密封的所述三角瓶置于转速为100-150r/min恒温摇床上震荡培养，以便获得几何式扩增的玉米悬浮细胞系留存备用。
在本实施例的悬浮培养液SUS-2中，MS盐还可以为N6盐(浓度为3.95g/L)，脯氨酸的浓度可以为0.1-5g/L，水解酪蛋白的浓度可以为0.1-5g/L，蔗糖的浓度可以为5-100g/L，Dicamba的浓度可以为0.2-10mg/L；上述成分均可以在其浓度范围内进行任意组合，但以所述悬浮培养液SUS-2(MS盐4.3g/L、MS维生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖30g/L、Dicamba 1.5mg/L，pH5.8)为优选。
4、农杆菌介导的玉米悬浮细胞系遗传转化
预培养：将所述玉米悬浮细胞系中制备的所述悬浮细胞团接种到PRE培养基(MS盐4.3g/L、N6维生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.79g/L、蔗糖30g/L、2,4-D2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上，在温度为28-30℃暗培养条件下预培养4-7天备用，优选为5天。预培养后的所述玉米悬浮细胞团活力增强，有助于克服褐化死亡的趋势。
在本实施例上述PRE培养基中，脯氨酸的浓度可以为0.1-5g/L，水解酪蛋白的浓度可以为0.1-5g/L，天冬氨酸的浓度可以为0.1-5g/L，蔗糖的浓度可以为5-100g/L，2,4-D的浓度可以为0.1-5mg/L；上述成分均可以在其浓度范围内进行任意组合，但以所述PRE培养基(MS盐4.3g/L、N6维生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.79g/L、蔗糖30g/L、2,4-D 2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)为优选。
预处理：将预培养后的所述玉米悬浮细胞团分别进行6种不同的农杆菌侵染前预处理，分别为：预处理1(无预处理)、预处理2(42℃水浴锅热处理5分钟)、预处理3(60℃烘箱热处理5分钟)，每个预处理设3次重复，每次重复进行预处理的所述玉米悬浮细胞团的数量如表3所示，3种预处理后的所述玉米悬浮细胞团用于后续农杆菌侵染。用于后续农杆菌侵染的所述玉米悬浮细胞团具有较强的活性，即使在农杆菌侵染过程中产生防卫反应且有释放活性氧，仍然能恢复生长。
农杆菌菌液的制备：挑取含有DBN100001的农杆菌单菌落，用枪头在含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的固体YP培养板(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L、卡那霉素50mg/L、琼脂粉15g/L)上划线，在温度28℃黑暗条件下培养2-3天。刮取所述固体YP培养板上的菌斑，在新的固体YP培养板上再培养1天，刮取共计培养3-4天的菌落，悬浮在5mL液体INF侵染培养基(MS盐4.3g/L、N6维生素、Dicamba 1.5mg/L、脯氨酸0.5mg/L、蔗糖30g/L、肌醇0.1g/L、乙酰丁香酮(AS)50mg/L，pH5.4)中，将农杆菌菌液混匀，将其浓度调整为OD660＝0.5-0.6。
农杆菌侵染玉米悬浮细胞团：将上述3种预处理后的所述玉米悬浮细胞团分别浸泡于所述农杆菌菌液(20-30mL)中5-25min，优选25min；侵染结束后将农杆菌菌液吸出，然后将3种所述玉米悬浮细胞团分别转移至滤纸上，并在超净工作台中风干5-20min。
农杆菌与玉米悬浮细胞团共培养：将侵染风干后的3种所述玉米悬浮细胞团分别转移到共培养培养基(MS盐4.3g/L、N6维生素、脯氨酸0.5g/L、蔗糖30g/L、2,4-D 2mg/L、乙酰丁香酮50mg/L、山梨醇36g/L、植物凝胶3g/L，pH5.4)上，在温度20-28℃条件下暗培养至少2天，优选为5天。共培养5天后，用荧光显微镜分别观察共培养后的3种所述玉米悬浮细胞团中红色荧光蛋白DsRed的瞬时表达情况，实验结果如表3和图6所示。
表3、共培养后3种不同预处理的玉米悬浮细胞团中DsRed蛋白瞬时表达的实验结果
表3的实验结果表明：预处理3(即60℃烘箱热处理5分钟)的红色荧光蛋白DsRed的瞬时表达率显著高于其它2种预处理，瞬时表达率可高达75％左右，即农杆菌侵染效率最高。因此根据筛选结果，选择共培养后预处理3获得的玉米悬浮细胞团进行下述实验。
在本实施例上述共培养培养基中，脯氨酸的浓度可以为0.1-5g/L，蔗糖的浓度可以为5-100g/L，2,4-D的浓度可以为0.1-5mg/L，乙酰丁香酮的浓度可以为10-100g/L，山梨醇的浓度可以为5-60g/L；上述成分均可以在其浓度范围内进行任意组合，但以所述共培养培养基(MS盐4.3g/L、N6维生素、脯氨酸0.5g/L、蔗糖30g/L、2,4-D 2mg/L、乙酰丁香酮50mg/L、山梨醇36g/L、植物凝胶3g/L，pH5.4)为优选。
玉米悬浮细胞团的筛选：将共培养后预处理3获得的玉米悬浮细胞团依次转移到筛选培养基S1和筛选培养基S2上进行两次双丙氨磷耐受性筛选，其中筛选培养基S1(MS盐4.3g/L、MS维生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、Dicamba2.5mg/L、Picloram 2.2mg/L、植物凝胶3g/L、特美汀200mg/L、KT 0.2mg/L，pH5.8)中分别含有浓度为3mg/L和5mg/L的双丙氨磷，筛选培养基S2(MS盐4.3g/L、MS维生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、Dicamba 2.5mg/L、Picloram2.2mg/L、植物凝胶3g/L、特美汀200mg/L、KT 0.2mg/L，pH5.8)中分别含有浓度为5mg/L、10mg/L、50mg/L和100mg/L的双丙氨磷，8种处理的具体组合信息如表4所示，每个处理进行筛选的所述玉米悬浮细胞团的数量如表5所示。
表4、对玉米悬浮细胞团进行8种不同筛选处理的具体组合信息
筛选分两个阶段：将共培养后预处理3获得的玉米悬浮细胞团先转移到筛选培养基S1上，在温度28-30℃条件下暗培养7-10天，优选为10天；将经过筛选培养基S1筛选后的玉米悬浮细胞团再转移到筛选培养基S2上，在温度28-30℃条件下暗培养25-35天，优选为30天，两个阶段的筛选导致转化的细胞选择性生长。按照表4的筛选处理组合，筛选后获得8种玉米抗性愈伤组织。
玉米抗性愈伤组织再生成植物：将8种所述玉米抗性愈伤组织分别转移到再生培养基(N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、N6有机成分、水解酪蛋白0.5g/L、蔗糖30g/L、KT2.5mg/L、肌醇0.1g/L、植物凝胶3g/L、萘乙酸(NAA)0.25mg/L、BAP 0.5mg/L、特美汀200mg/L，pH5.8)上，在温度25-30℃光照培养(光/暗＝16:8)分化1个月；分化出来的8种小苗分别转移到生根培养基(MS盐2.15g/L、MS维生素、蔗糖15g/L、吲哚-3-乙酸(IAA)0.5mg/L、NAA1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上，温度25-30℃光照培养(光/暗＝16:8)至约10cm高，移至温室培养。在温室中，每天于28℃下培养16小时，再于20℃下培养8小时，可以获得8种转基因植株。
在上述再生培养基中N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐和N6有机成分的浓度均为1倍量。N6大量元素包括2.83g/L KNO3、0.463g/L(NH4)2SO4、0.166g/L CaCl2·2H2O、0.185g/LMgSO4·7H2O和0.4g/L KH2PO4；B5微量元素包括0.75mg/L KI、3.0mg/L H3BO3、10mg/LMnSO4·4H2O、2.0mg/L ZnSO4·7H2O、0.25mg/L Na2MoSO4·2H2O、0.025mg/L CoCl2·6H2O和0.025mg/L CuSO4·5H2O；MS铁盐包括37.3mg/L Na2-EDTA和27.8mg/L FeSO4·7H2O；N6有机成分包括2mg/L甘氨酸、0.5mg/L烟酸、1mg/L维生素B1和0.5mg/L维生素B6。
在本实施例上述再生培养基中，水解酪蛋白的浓度可以为0.1-5g/L，蔗糖的浓度可以为5-100g/L，KT的浓度可以为0.01-5mg/L，特美汀的浓度可以为20-500mg/L；上述成分均可以在其浓度范围内进行任意组合，但以所述再生培养基(N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、N6有机成分、水解酪蛋白0.5g/L、蔗糖30g/L、KT 2.5mg/L、肌醇0.1g/L、植物凝胶3g/L、萘乙酸(NAA)0.25mg/L、BAP 0.5mg/L、特美汀200mg/L，pH5.8)为优选。
第三实施例、用TaqMan验证转基因的玉米植株
分别取8种转基因玉米植株的叶片各约100mg作为样品，用Qiagen的DNeasy PlantMaxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测PAT基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。
检测PAT基因拷贝数的具体方法如下：
步骤11、分别取8种转基因玉米植株和野生型玉米植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；
步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；
步骤13、用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度；
步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μL；
步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：
以下引物和探针用来检测PAT基因：
引物1：CAGTTGAGATTAGGCCAGCTACAG如序列表中SEQ ID NO:7所示；
引物2：TTCACTGTAGACGTCTCAATGTAATGG如序列表中SEQ ID NO:8所示；
探针1：CAGCTGATATGGCCGCGGTTTGTG如序列表中SEQ ID NO:9所示；
PCR反应体系为：
所述50×引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μL，100μM浓度的探针50μL和1×TE缓冲液860μL，并且在4℃，贮藏在琥珀试管中。
PCR反应条件为：
利用SDS2.3软件(Applied Biosystems)分析数据。
实验结果表明：如图7所示，PAT基因能够整合到所检测的玉米植株的染色体组中，即获得稳定表达的转基因阳性植株；如表5所示，筛选处理1和5、筛选处理2和6、筛选处理3和7与筛选处理4和8均呈现相同的规律，即在筛选培养基S2中双丙氨磷浓度不变的情况下，筛选培养基S1中双丙氨磷浓度(3mg/L和5mg/L)对阳性率和转化效率没有显著影响，其中筛选处理1和筛选处理5的阳性率和转化效率分别仅为5％和0.3％左右，说明浓度为5mg/L双丙氨磷的筛选培养基S2无法有效筛选出抗性愈伤组织进而获得阳性植株；筛选处理1至4和筛选处理5至8的阳性率和转化效率均呈现逐渐递增的趋势，说明在筛选培养基S1中双丙氨磷浓度不变的情况下，阳性率和转化效率随着筛选培养基S2中双丙氨磷浓度的提高(5mg/L、10mg/L、50mg/L和100mg/L)而提高；当筛选培养基S2中双丙氨磷浓度达到100mg/L时，阳性率可达90％左右，转化效率可达30％左右。因此，整体上筛选培养基S1中双丙氨磷浓度对阳性率和转化效率没有显著影响，而筛选培养基S2中双丙氨磷的浓度对阳性率和转化效率具有显著影响。
表5、8种不同筛选处理的玉米悬浮细胞团获得的转基因植株的相关实验结果
在表5中，筛选处理细胞团数为共培养后预处理3获得的用于筛选处理的玉米悬浮细胞团的数量，抗性愈伤总数为经两个阶段的筛选处理后获得的红色荧光体积比不少于50％的抗性愈伤数量，出苗数为抗性愈伤组织再生获得的植株的数量，阳性植株数为经Taqman检测后获得的基因组中整合有T-DNA区的转基因植株数量，Taqman单拷贝数为经Taqman检测后获得的基因组中整合有1个拷贝数目T-DNA区的转基因植株数量；成苗率、阳性率、单拷贝率和转化效率的计算公式如下所示：
成苗率＝出苗数/抗性愈伤总数×100％
阳性率＝阳性植株数/出苗数×100％
单拷贝率＝Taqman单拷贝数/阳性植株数×100％
转化效率＝阳性植株数/筛选处理细胞团数×100％
在第二实施例和第三实施例的筛选培养基S1中，脯氨酸的浓度可以为0.1-5g/L，蔗糖的浓度可以为5-100g/L，Dicamba的浓度可以为0.2-10mg/L，Picloram的浓度可以为0.2-10mg/L，特美汀的浓度可以为20-500mg/L，KT的浓度可以为0.01-5mg/L，双丙氨膦的浓度可以为3-5mg/L；上述成分均可以在其浓度范围内进行任意组合，但以含有浓度为3mg/L或5mg/L的双丙氨磷的所述筛选培养基S1(MS盐4.3g/L、MS维生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、Dicamba 2.5mg/L、Picloram 2.2mg/L、植物凝胶3g/L、特美汀200mg/L、KT 0.2mg/L，pH5.8)为优选。
在第二实施例和第三实施例的筛选培养基S2中，脯氨酸的浓度可以为0.1-5g/L，蔗糖的浓度可以为5-100g/L，Dicamba的浓度可以为0.2-10mg/L，Picloram的浓度可以为0.2-10mg/L，特美汀的浓度可以为20-500mg/L，KT的浓度可以为0.01-5mg/L，双丙氨膦的浓度可以为50-100mg/L；上述成分均可以在其浓度范围内进行任意组合，但以含有浓度为100mg/L的双丙氨磷的所述筛选培养基S2(MS盐4.3g/L、MS维生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、Dicamba 2.5mg/L、Picloram 2.2mg/L、植物凝胶3g/L、特美汀200mg/L、KT 0.2mg/L，pH5.8)为优选。
综上所述，本发明转化玉米的方法在实验室条件下即可大量繁殖悬浮细胞系，从而使得玉米遗传转化不受季节性的影响，满足周年稳定转化的需求；且可由玉米幼胚快速获得悬浮细胞系，实验周期由6个月缩短至40-50天，操作简单方便，重复性好；同时本发明首次由玉米幼胚快速获得悬浮细胞系，再利用农杆菌侵染转化玉米悬浮细胞系，再生成苗；转化效率可以达到30％左右，转基因阳性率可达90％左右，其中单拷贝率约50％；由于显著降低了对玉米外植体(幼胚)供应的压力，进而大大减小了培养外植体所需的人力和物力消耗。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (64)

1.一种诱导玉米愈伤组织的方法，其特征在于，包括将玉米幼胚接种于愈伤组织诱导培养基以诱导初生愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基包含麦草畏、毒莠定和激动素。
2.根据权利要求1所述诱导玉米愈伤组织的方法，其特征在于，所述麦草畏的浓度为0.2-10mg/L，所述毒莠定的浓度为0.2-10mg/L，所述激动素的浓度为0.01-5mg/L。
3.根据权利要求2所述诱导玉米愈伤组织的方法，其特征在于，所述麦草畏的浓度为2mg/L，所述毒莠定的浓度为2.2mg/L，所述激动素的浓度为0.3mg/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述诱导玉米愈伤组织的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基还包含苄氨基嘌呤。
5.根据权利要求4所述诱导玉米愈伤组织的方法，其特征在于，所述苄氨基嘌呤的浓度为0.01-5mg/L。
6.根据权利要求5所述诱导玉米愈伤组织的方法，其特征在于，所述苄氨基嘌呤的浓度为0.02mg/L。
7.根据权利要求1-6任一项所述诱导玉米愈伤组织的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基包含大量盐、微量盐、有机质、脯氨酸、水解酪蛋白、天冬氨酸、蔗糖和2,4-D。
8.根据权利要求7所述诱导玉米愈伤组织的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基包含MS盐、N6维生素、脯氨酸0.1-5g/L、水解酪蛋白0.1-5g/L、天冬氨酸0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、2,4-D 0.1-5mg/L、麦草畏0.2-10mg/L、毒莠定0.2-10mg/L、激动素0.01-5mg/L和苄氨基嘌呤0-5mg/L。
9.根据权利要求8所述诱导玉米愈伤组织的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基包含MS盐、N6维生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.2g/L、蔗糖30g/L、2,4-D 1.5mg/L、麦草畏2mg/L、毒莠定2.2mg/L和激动素0.3mg/L。
10.根据权利要求8所述诱导玉米愈伤组织的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基包含MS盐、N6维生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.2g/L、蔗糖30g/L、2,4-D 1.5mg/L、麦草畏2mg/L、毒莠定2.2mg/L、激动素0.3mg/L和苄氨基嘌呤0.02mg/L。
11.一种获得玉米悬浮细胞系的方法，其特征在于，包括将权利要求1-10任一项所述诱导玉米愈伤组织的方法获得的所述初生愈伤组织通过悬浮培养液进行悬浮培养以获得玉米悬浮细胞系。
12.根据权利要求11所述获得玉米悬浮细胞系的方法，其特征在于，包括：
权利要求1-10任一项所述诱导玉米愈伤组织的方法获得的所述初生愈伤组织通过第一悬浮培养液进行悬浮培养和继代以获得悬浮细胞团；
所述悬浮细胞团通过第二悬浮培养液进行悬浮培养以获得悬浮细胞系。
13.根据权利要求12所述获得玉米悬浮细胞系的方法，其特征在于，包括：
权利要求1-10任一项所述诱导玉米愈伤组织的方法获得的所述初生愈伤组织通过第一悬浮培养液进行悬浮培养10-25天，然后继代2-3次以获得悬浮细胞团；
所述悬浮细胞团通过第二悬浮培养液进行悬浮培养5-7天以获得悬浮细胞系。
14.根据权利要求12或13所述获得玉米悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述第一悬浮培养液包含MS盐或N6盐、MS维生素、脯氨酸0.1-5g/L、水解酪蛋白0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、麦草畏0.2-10mg/L和2,4-D 0.1-5mg/L。
15.根据权利要求14所述获得玉米悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述第一悬浮培养液包含MS盐、MS维生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖45g/L、麦草畏1.5mg/L和2,4-D 1mg/L。
16.根据权利要求12-15任一项所述获得玉米悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述第二悬浮培养液包含MS盐或N6盐、MS维生素、脯氨酸0.1-5g/L、水解酪蛋白0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L和麦草畏0.2-10mg/L。
17.根据权利要求16所述获得玉米悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述第二悬浮培养液包含MS盐、MS维生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖30g/L和麦草畏1.5mg/L。
18.一种大量扩增玉米悬浮细胞系的方法，其特征在于，包括采用权利要求11-17任一项所述获得玉米悬浮细胞系的方法获得的所述玉米悬浮细胞系通过悬浮培养液进行继代以扩增玉米悬浮细胞系。
19.根据权利要求18所述大量扩增玉米悬浮细胞系的方法，其特征在于，包括采用权利要求11-17任一项所述获得玉米悬浮细胞系的方法获得的所述玉米悬浮细胞系通过第二悬浮培养液进行继代以扩增玉米悬浮细胞系。
20.根据权利要求19所述大量扩增玉米悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述第二悬浮培养液包含MS盐或N6盐、MS维生素、脯氨酸0.1-5g/L、水解酪蛋白0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L和麦草畏0.2-10mg/L。
21.根据权利要求20所述大量扩增玉米悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述第二悬浮培养液包含MS盐、MS维生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖30g/L和麦草畏1.5mg/L。
22.一种节省玉米外植体的方法，其特征在于，包括权利要求1-10任一项所述诱导玉米愈伤组织的方法获得的所述初生愈伤组织，采用权利要求11-17任一项所述获得玉米悬浮细胞系的方法以获得玉米悬浮细胞系，将所述玉米悬浮细胞系通过悬浮培养液进行继代以扩增玉米悬浮细胞系。
23.一种提高农杆菌侵染效率的方法，其特征在于，包括农杆菌侵染预处理后的玉米悬浮细胞团，所述玉米悬浮细胞团来自采用权利要求11-17任一项所述获得玉米悬浮细胞系的方法获得的所述玉米悬浮细胞系，所述预处理包括热激处理。
24.根据权利要求23所述提高农杆菌侵染效率的方法，其特征在于，所述热激处理的时间为不超过8分钟。
25.根据权利要求23或24所述提高农杆菌侵染效率的方法，其特征在于，所述热激处理的温度为30-60℃。
26.根据权利要求25所述提高农杆菌侵染效率的方法，其特征在于，所述热激处理的温度为42℃或60℃。
27.根据权利要求26所述提高农杆菌侵染效率的方法，其特征在于，所述热激处理为温度60℃烘箱热激处理5分钟。
28.根据权利要求23-27任一项所述提高农杆菌侵染效率的方法，其特征在于，所述预处理还包括超声波处理。
29.根据权利要求23-28任一项所述提高农杆菌侵染效率的方法，其特征在于，包括：
玉米悬浮细胞团经过预培养以获得预培养后的玉米悬浮细胞团；
所述预培养后的玉米悬浮细胞团经过预处理以获得预处理后的玉米悬浮细胞团；
农杆菌侵染所述预处理后的玉米悬浮细胞团；
侵染后的玉米悬浮细胞团与所述农杆菌共培养以获得共培养后的玉米悬浮细胞团。
30.一种有效筛选玉米抗性愈伤组织的方法，其特征在于，包括将权利要求29所述提高农杆菌侵染效率的方法获得的所述共培养后的玉米悬浮细胞团在含有选择剂的筛选培养基上培养并选择抗性愈伤组织。
31.根据权利要求30所述有效筛选玉米抗性愈伤组织的方法，其特征在于，所述选择剂为抗生素、除草剂或糖类。
32.根据权利要求31所述有效筛选玉米抗性愈伤组织的方法，其特征在于，包括：将权利要求30所述提高农杆菌侵染效率的方法获得的所述共培养后的玉米悬浮细胞团在含有双丙氨膦的第一筛选培养基上培养后，再在含有双丙氨膦的第二筛选培养基上进行培养，选择抗性愈伤组织。
33.根据权利要求32所述有效筛选玉米抗性愈伤组织的方法，其特征在于，所述第二筛选培养基中双丙氨膦的浓度为50-100mg/L。
34.根据权利要求33所述有效筛选玉米抗性愈伤组织的方法，其特征在于，所述第二筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、麦草畏0.2-10mg/L、毒莠定0.2-10mg/L、特美汀20-500mg/L、激动素0.01-5mg/L和双丙氨膦50-100mg/L。
35.根据权利要求34所述有效筛选玉米抗性愈伤组织的方法，其特征在于，所述第二筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麦草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激动素0.2mg/L和双丙氨膦100mg/L。
36.根据权利要求32-35任一项所述有效筛选玉米抗性愈伤组织的方法，其特征在于，所述第一筛选培养基中双丙氨膦的浓度为3-5mg/L。
37.根据权利要求36所述有效筛选玉米抗性愈伤组织的方法，其特征在于，所述第一筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、麦草畏0.2-10mg/L、毒莠定0.2-10mg/L、特美汀20-500mg/L、激动素0.01-5mg/L和双丙氨膦3-5mg/L。
38.根据权利要求37所述有效筛选玉米抗性愈伤组织的方法，其特征在于，所述第一筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麦草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激动素0.2mg/L和双丙氨膦3mg/L。
39.根据权利要求38所述有效筛选玉米抗性愈伤组织的方法，其特征在于，所述第一筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麦草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激动素0.2mg/L和双丙氨膦5mg/L。
40.一种转化玉米的方法，其特征在于，包括：
权利要求1-10任一项所述诱导玉米愈伤组织的方法获得的所述初生愈伤组织，采用权利要求11-17任一项所述获得玉米悬浮细胞系的方法以获得玉米悬浮细胞系；
农杆菌侵染所述玉米悬浮细胞系中的玉米悬浮细胞团。
41.根据权利要求40所述转化玉米的方法，其特征在于，所述农杆菌侵染所述玉米悬浮细胞系中的玉米悬浮细胞团具体为农杆菌侵染预处理后的所述玉米悬浮细胞系中的玉米悬浮细胞团，所述预处理包括热激处理。
42.根据权利要求41所述提高农杆菌侵染效率的方法，其特征在于，所述热激处理的时间为不超过8分钟。
43.根据权利要求41或42所述提高农杆菌侵染效率的方法，其特征在于，所述热激处理的温度为30-60℃。
44.根据权利要求43所述转化玉米的方法，其特征在于，所述热激处理的温度为42℃或60℃。
45.根据权利要求44所述转化玉米的方法，其特征在于，所述热激处理为温度60℃烘箱热激处理5分钟。
46.根据权利要求41-45所述转化玉米的方法，其特征在于，所述预处理还包括超声波处理。
47.根据权利要求40-46任一项所述转化玉米的方法，其特征在于，包括：
所述玉米悬浮细胞系中的玉米悬浮细胞团经过预培养以获得预培养后的玉米悬浮细胞团；
所述预培养后的玉米悬浮细胞团经过预处理以获得预处理后的玉米悬浮细胞团；
农杆菌侵染所述预处理后的玉米悬浮细胞团；
侵染后的玉米悬浮细胞团与所述农杆菌共培养以获得共培养后的玉米悬浮细胞团。
48.一种生产稳定转化的玉米植物的方法，其特征在于，包括：
权利要求1-10任一项所述诱导玉米愈伤组织的方法获得的所述初生愈伤组织，采用权利要求11-17任一项所述获得玉米悬浮细胞系的方法以获得玉米悬浮细胞系；
农杆菌侵染所述玉米悬浮细胞系中的玉米悬浮细胞团；
侵染后的玉米悬浮细胞团与所述农杆菌共培养；
在含有选择剂的培养基上培养并选择抗性愈伤组织；
所述抗性愈伤组织再生为玉米植物。
49.根据权利要求48所述生产稳定转化的玉米植物的方法，其特征在于，所述农杆菌侵染所述玉米悬浮细胞系中的玉米悬浮细胞团具体为农杆菌侵染预处理后的所述玉米悬浮细胞系中的玉米悬浮细胞团，所述预处理包括热激处理。
50.根据权利要求49所述提高农杆菌侵染效率的方法，其特征在于，所述热激处理的时间为不超过8分钟。
51.根据权利要求49或50所述提高农杆菌侵染效率的方法，其特征在于，所述热激处理的温度为30-60℃。
52.根据权利要求51所述生产稳定转化的玉米植物的方法，其特征在于，所述热激处理的温度为42℃或60℃。
53.根据权利要求52所述生产稳定转化的玉米植物的方法，其特征在于，所述热激处理为温度60℃烘箱热激处理5分钟。
54.根据权利要求49-53任一项所述生产稳定转化的玉米植物的方法，其特征在于，所述预处理还包括超声波处理。
55.根据权利要求48-54任一项所述生产稳定转化的玉米植物的方法，其特征在于，包括：
所述玉米悬浮细胞系中的玉米悬浮细胞团经过预培养以获得预培养后的玉米悬浮细胞团；
所述预培养后的玉米悬浮细胞团经过预处理以获得预处理后的玉米悬浮细胞团；
农杆菌侵染所述预处理后的玉米悬浮细胞团。
56.根据权利要求48-55任一项所述生产稳定转化的玉米植物的方法，其特征在于，所述选择剂为抗生素、除草剂或糖类。
57.根据权利要求56所述生产稳定转化的玉米植物的方法，其特征在于，所述在含有选择剂的培养基上培养并选择抗性愈伤组织具体为将共培养后的玉米悬浮细胞团在含有双丙氨膦的第一筛选培养基上培养后，再在含有双丙氨膦的第二筛选培养基上进行培养，选择抗性愈伤组织。
58.根据权利要求57所述生产稳定转化的玉米植物的方法，其特征在于，所述第二筛选培养基中双丙氨膦的浓度为50-100mg/L。
59.根据权利要求58所述生产稳定转化的玉米植物的方法，其特征在于，所述第二筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、麦草畏0.2-10mg/L、毒莠定0.2-10mg/L、特美汀20-500mg/L、激动素0.01-5mg/L和双丙氨膦50-100mg/L。
60.根据权利要求59所述生产稳定转化的玉米植物的方法，其特征在于，所述第二筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麦草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激动素0.2mg/L和双丙氨膦100mg/L。
61.根据权利要求57-60任一项所述生产稳定转化的玉米植物的方法，其特征在于，所述第一筛选培养基中双丙氨膦的浓度为3-5mg/L。
62.根据权利要求61所述生产稳定转化的玉米植物的方法，其特征在于，所述第一筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸0.1-5g/L、蔗糖5-100g/L、麦草畏0.2-10mg/L、毒莠定0.2-10mg/L、特美汀20-500mg/L、激动素0.01-5mg/L和双丙氨膦3-5mg/L。
63.根据权利要求62所述生产稳定转化的玉米植物的方法，其特征在于，所述第一筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麦草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激动素0.2mg/L和双丙氨膦3mg/L。
64.根据权利要求62所述生产稳定转化的玉米植物的方法，其特征在于，所述第一筛选培养基包括MS盐、MS维生素、脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、麦草畏2.5mg/L、毒莠定2.2mg/L、特美汀200mg/L、激动素0.2mg/L和双丙氨膦5mg/L。
CN201610889121.5A 2016-10-12 2016-10-12 转化玉米的方法 Pending CN106520661A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610889121.5A CN106520661A (zh) 2016-10-12 2016-10-12 转化玉米的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610889121.5A CN106520661A (zh) 2016-10-12 2016-10-12 转化玉米的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106520661A true CN106520661A (zh) 2017-03-22

Family

ID=58331442

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610889121.5A Pending CN106520661A (zh) 2016-10-12 2016-10-12 转化玉米的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106520661A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113881698A (zh) * 2021-10-29 2022-01-04 上海市农业科学院 一种利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤组织的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995006128A2 (en) * 1993-08-25 1995-03-02 Dekalb Genetics Corporation Fertile, transgenic maize plants and methods for their production
WO2007030510A2 (en) * 2005-09-08 2007-03-15 Chromatin Inc. Plants modified with mini-chromosomes
CN102172217A (zh) * 2011-01-24 2011-09-07 吉林大学 玉米体细胞胚胎的诱导方法
CN103194485A (zh) * 2013-04-17 2013-07-10 北京金冠丰生物技术有限公司 利用玉米胚芽鞘节诱导的愈伤组织转化外源基因的方法
CN103409460A (zh) * 2013-08-21 2013-11-27 北京大北农科技集团股份有限公司 转化玉米的方法
CN104745622A (zh) * 2013-12-27 2015-07-01 中国种子集团有限公司 一种玉米骨干自交系的高效转基因方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995006128A2 (en) * 1993-08-25 1995-03-02 Dekalb Genetics Corporation Fertile, transgenic maize plants and methods for their production
WO2007030510A2 (en) * 2005-09-08 2007-03-15 Chromatin Inc. Plants modified with mini-chromosomes
CN102172217A (zh) * 2011-01-24 2011-09-07 吉林大学 玉米体细胞胚胎的诱导方法
CN103194485A (zh) * 2013-04-17 2013-07-10 北京金冠丰生物技术有限公司 利用玉米胚芽鞘节诱导的愈伤组织转化外源基因的方法
CN103409460A (zh) * 2013-08-21 2013-11-27 北京大北农科技集团股份有限公司 转化玉米的方法
CN104745622A (zh) * 2013-12-27 2015-07-01 中国种子集团有限公司 一种玉米骨干自交系的高效转基因方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DHILLON, N. K.等: "ANALYSIS OF MAIZE INBRED LINES FOR THEIR RESPONSE TO SOMATIC EMBRYOGENESIS", 《JOURNAL OF CELL AND TISSUE RESEARCH》 *
WILLIAM J. GORDON-KAMM等: "Transformation of Maize Cells and Regeneration of Fertile Transgenic Plants", 《THE PLANT CELL》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113881698A (zh) * 2021-10-29 2022-01-04 上海市农业科学院 一种利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤组织的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104114708B (zh) 改进使用土壤杆菌属转化的方法
Yang et al. Efficient embryogenic suspension culturing and rapid transformation of a range of elite genotypes of sweet potato (Ipomoea batatas [L.] Lam.)
US5792927A (en) Genetically transformed rose plants and methods for their production
EP1765057A1 (en) Method for agrobacterium transformation for dihaploid corn plants
CN103525864B (zh) 转化大豆的方法
CN108588120A (zh) 一种玉米农杆菌转化受体的制备方法及农杆菌介导的玉米转化方法
CN104531656B (zh) 一种来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因及其应用
CN103993038B (zh) 一种利用pmi筛选标记将外源基因导入闭颖授粉籼稻的方法
CN103409460A (zh) 转化玉米的方法
CN108588002B (zh) 获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织和遗传转化的方法
CN106520661A (zh) 转化玉米的方法
CN109136259A (zh) 一种西瓜高效遗传转化及转基因植株鉴定方法
US20040210959A1 (en) A Novel Method for Production of Transformed Dihaploid Corn Plants
CN101717786B (zh) 一种快速获得大豆转基因愈伤组织的转化方法
CN103789325A (zh) 棉花细胞壁伸展蛋白基因GbEXPATR及应用
CN104805093B (zh) 水稻基因OsLOL3在延缓植物叶片衰老和提高植物耐旱性中的应用
Das et al. Agrobacterium-mediated genetic transformation of lentil (Lens culinaris Medik.) with chitinase gene followed by in vitro flower and pod formation
CN103993039B (zh) 一种利用pmi筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法
CN102124947B (zh) 一种高频诱导大豆丛生芽的高效转基因方法
CN106244595B (zh) 杉木植物磺肽素clpsk1基因及其应用
CN101831429B (zh) 水稻胚乳特异表达基因的启动子及表达模式鉴定
CN101265480B (zh) 克服根癌农杆菌介导小麦幼胚褐化的转化方法及其专用培养基
CN103740635A (zh) 转化水稻的方法
CN104745621B (zh) 利用农杆菌获得中国主栽转基因小麦的方法及其专用培养基
CN105132430B (zh) 玉米营养器官特异性启动子及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200810

Address after: 100193 No. 2, West Old Summer Palace Road, Beijing, Haidian District, Institute of atomic energy, Chinese Academy of Agricultural Sciences, building 49

Applicant after: BEIJING DABEINONG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: Floor 14, No.27, Zhongguancun Street, Haidian District, Beijing 100080

Applicant before: BEIJING DABEINONG TECHNOLOGY GROUP Co.,Ltd.

Applicant before: BEIJING DABEINONG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.