CN110226517A - 一种洋葱离体再生的方法及其使用的培养基 - Google Patents

一种洋葱离体再生的方法及其使用的培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种洋葱离体再生的方法及其使用的培养基。该方法依次包括如下步骤：将受精8‑12d洋葱花蕊的幼胚置于含4‑6mg/LPicloram的培养基进行培养，获得初级愈伤组织；将初级愈伤组织置于含4‑6mg/LPicloram、4‑6mg/L AgNO3和200‑400mg/L Timentin的培养基进行培养，获得胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织置于含1.5‑2.5mg/L激动素、4‑6mg/L AgNO3和200‑400mg/L Timentin的培养基进行培养，获得再生芽；将再生芽置于生根培养基进行培养，获得再生苗。实验证明，采用该方法获得的再生苗的分化率均为85％以上。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种洋葱离体再生的方法及其使用的培养基
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种洋葱离体再生的方法及其使用的培养基。
背景技术
洋葱离体再生体系建立的研究已经进行了很多年，其中利用鳞茎盘和茎尖作为外植体进行离体再生，出愈率和分化率均可以达到80％以上。但是，这两种离体再生方法并不适用于洋葱的遗传转化体系。利用洋葱幼胚离体再生体系进行遗传转化，转化效率高且转基因植株稳定。但以洋葱幼胚作为外植体，现有方法进行离体再生，分化率仅为40％左右。由此可见，建立简单稳定的洋葱幼胚离体再生体系对洋葱的遗传转化体系的建立具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是建立分化率较高的洋葱幼胚离体再生体系。
本发明首先保护一种洋葱离体再生的方法，是以受精的洋葱花蕊中的幼胚为外植体，完成离体再生。
上述方法中，所述受精的洋葱花蕊可为受精8-12d的洋葱花蕊(如受精8-10d的洋葱花蕊、受精10-12d的洋葱花蕊、受精8d的洋葱花蕊、受精10d的洋葱花蕊或受精12d的洋葱花蕊)。
上述方法中，所述洋葱离体再生的方法可包括如下步骤：
(1)将所述外植体置于含4-6mg/LPicloram的培养基(如含4-5mg/LPicloram的培养基、含5-6mg/LPicloram的培养基、含4mg/LPicloram的培养基、含5mg/LPicloram的培养基或含6mg/LPicloram的培养基)进行培养，获得初级愈伤组织；
(2)完成步骤(1)后，将所述初级愈伤组织置于含4-6mg/LPicloram、4-6mg/LAgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基(如“含4-5mg/LPicloram、4-5mg/L AgNO3和200-300mg/L Timentin的培养基”、“含5-6mg/LPicloram、5-6mg/L AgNO3和300-400mg/LTimentin的培养基”、“含4mg/LPicloram、4mg/L AgNO3和200mg/L Timentin的培养基”、“含5mg/LPicloram、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的培养基”或“含6mg/LPicloram、6mg/LAgNO3和400mg/L Timentin的培养基”)进行培养，获得胚性愈伤组织；
(3)完成步骤(2)后，将所述胚性愈伤组织置于含1.5-2.5mg/L激动素、4-6mg/LAgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基(如“含1.5-2.0mg/L激动素、4-5mg/L AgNO3和200-300mg/L Timentin的培养基”、“含2.0-2.5mg/L激动素、5-6mg/L AgNO3和300-400mg/LTimentin的培养基”、“含1.5mg/L激动素、4mg/L AgNO3和200mg/L Timentin的培养基”、“含1.5mg/L激动素、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的培养基”、“含2.5mg/L激动素、5mg/LAgNO3和300mg/L Timentin的培养基”或“含2.5mg/L激动素、6mg/L AgNO3和400mg/LTimentin的培养基”)进行培养，获得再生芽；
(4)完成步骤(3)后，将所述再生芽置于生根培养基进行培养，获得再生苗。
上述方法中，所述含4-6mg/LPicloram的培养基可为含4-6mg/LPicloram的MS固体培养基(如含4-5mg/LPicloram的MS固体培养基、含5-6mg/LPicloram的MS固体培养基、含4mg/LPicloram的MS固体培养基、含5mg/LPicloram的MS固体培养基或含6mg/LPicloram的MS固体培养基)。所述含4-6mg/LPicloram、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基可为含4-6mg/LPicloram、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的MS固体培养基(如“含4-5mg/LPicloram、4-5mg/L AgNO3和200-300mg/L Timentin的MS固体培养基”、“含5-6mg/LPicloram、5-6mg/L AgNO3和300-400mg/L Timentin的MS固体培养基”、“含4mg/LPicloram、4mg/L AgNO3和200mg/L Timentin的MS固体培养基”、“含5mg/LPicloram、5mg/LAgNO3和300mg/L Timentin的MS固体培养基”或“含6mg/LPicloram、6mg/L AgNO3和400mg/LTimentin的MS固体培养基”)。所述含1.5-2.5mg/L激动素、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/LTimentin的培养基可为含1.5-2.5mg/L激动素、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的MS固体培养基(如“含1.5-2.0mg/L激动素、4-5mg/L AgNO3和200-300mg/L Timentin的MS固体培养基”、“含2.0-2.5mg/L激动素、5-6mg/L AgNO3和300-400mg/L Timentin的MS固体培养基”、“含1.5mg/L激动素、4mg/L AgNO3和200mg/L Timentin的MS固体培养基”、“含1.5mg/L激动素、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的MS固体培养基”、“含2.5mg/L激动素、5mg/LAgNO3和300mg/L Timentin的MS固体培养基”或“含2.5mg/L激动素、6mg/L AgNO3和400mg/LTimentin的MS固体培养基”)。所述生根培养基可为1/2MS固体培养基。
上述方法中，所述含4-6mg/LPicloram的MS固体培养基具体可为含5mg/LPicloram的MS固体培养基。所述含4-6mg/LPicloram、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的MS固体培养基具体可为含5mg/LPicloram、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的MS固体培养基。所述含1.5-2.5mg/L激动素、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的MS固体培养基具体可为含1.5mg/L激动素、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的MS固体培养基。
上述方法中，所述步骤(1)中，所述培养的条件为：23℃～27℃(如23℃～25℃、25℃～27℃、23℃、25℃或27℃)，暗培养4～8d(如4～6d、6～8d、4d、6d或8d)。所述步骤(2)中，所述培养的条件为：23℃～27℃(如23℃～25℃、25℃～27℃、23℃、25℃或27℃)，光暗交替培养3-4周(如3周或4周)。所述步骤(3)中，所述培养的条件为：23℃～27℃(如23℃～25℃、25℃～27℃、23℃、25℃或27℃)，光暗交替培养2-3周(如2周或3周)。所述步骤(4)中，所述培养的条件为：23℃～27℃(如23℃～25℃、25℃～27℃、23℃、25℃或27℃)，光暗交替培养2-3周(如2周或3周)。
本发明还保护用于洋葱离体再生的试剂盒，可包括“含4-6mg/LPicloram的培养基(如含4-5mg/LPicloram的培养基、含5-6mg/LPicloram的培养基、含4mg/LPicloram的培养基、含5mg/LPicloram的培养基或含6mg/LPicloram的培养基)”、“含4-6mg/LPicloram、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基(如“含4-5mg/LPicloram、4-5mg/L AgNO3和200-300mg/L Timentin的培养基”、“含5-6mg/LPicloram、5-6mg/L AgNO3和300-400mg/LTimentin的培养基”、“含4mg/LPicloram、4mg/L AgNO3和200mg/L Timentin的培养基”、“含5mg/LPicloram、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的培养基”或“含6mg/LPicloram、6mg/LAgNO3和400mg/L Timentin的培养基”)”和“含1.5-2.5mg/L激动素、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基(如“含1.5-2.0mg/L激动素、4-5mg/L AgNO3和200-300mg/LTimentin的MS固体培养基”、“含2.0-2.5mg/L激动素、5-6mg/L AgNO3和300-400mg/LTimentin的MS固体培养基”、“含1.5mg/L激动素、4mg/L AgNO3和200mg/L Timentin的MS固体培养基”、“含1.5mg/L激动素、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的MS固体培养基”、“含2.5mg/L激动素、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的MS固体培养基”或“含2.5mg/L激动素、6mg/L AgNO3和400mg/L Timentin的MS固体培养基”)”中的至少一种。
所述用于洋葱离体再生的试剂盒具体可由“含4-6mg/LPicloram的培养基”、“含4-6mg/LPicloram、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基”和“含1.5-2.5mg/L激动素、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基”组成。
上述任一所述的试剂盒中，所述含4-6mg/LPicloram的培养基可为含4-6mg/LPicloram的MS固体培养基(如含4-5mg/LPicloram的MS固体培养基、含5-6mg/LPicloram的MS固体培养基、含4mg/LPicloram的MS固体培养基、含5mg/LPicloram的MS固体培养基或含6mg/LPicloram的MS固体培养基)。所述含4-6mg/LPicloram、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/LTimentin的培养基可为含4-6mg/LPicloram、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的MS固体培养基(如“含4-5mg/LPicloram、4-5mg/L AgNO3和200-300mg/L Timentin的MS固体培养基”、“含5-6mg/LPicloram、5-6mg/L AgNO3和300-400mg/L Timentin的MS固体培养基”、“含4mg/LPicloram、4mg/L AgNO3和200mg/L Timentin的MS固体培养基”、“含5mg/LPicloram、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的MS固体培养基”或“含6mg/LPicloram、6mg/L AgNO3和400mg/L Timentin的MS固体培养基”)。所述含1.5-2.5mg/L激动素、4-6mg/LAgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基可为含1.5-2.5mg/L激动素、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的MS固体培养基(如“含1.5-2.0mg/L激动素、4-5mg/L AgNO3和200-300mg/L Timentin的MS固体培养基”、“含2.0-2.5mg/L激动素、5-6mg/L AgNO3和300-400mg/L Timentin的MS固体培养基”、“含1.5mg/L激动素、4mg/L AgNO3和200mg/LTimentin的MS固体培养基”、“含1.5mg/L激动素、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的MS固体培养基”、“含2.5mg/L激动素、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的MS固体培养基”或“含2.5mg/L激动素、6mg/L AgNO3和400mg/L Timentin的MS固体培养基”)。
上述任一所述试剂盒还可包括生根培养基。
上述任一所述试剂具体可由“含4-6mg/LPicloram的培养基”、“含4-6mg/LPicloram、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基”、“含1.5-2.5mg/L激动素、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基”和生根培养基组成。
所述生根培养基具体可为1/2MS固体培养基。
实验证明，采用本发明提供的洋葱离体再生方法对洋葱幼胚进行离体再生，再生苗的分化率均为85％以上。而以洋葱幼胚作为外植体，现有方法进行离体再生，分化率仅为40％左右。因此，本发明建立了简单稳定的洋葱幼胚离体再生体系，对洋葱的遗传转化体系的建立具有重要的意义。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为胚性愈伤组织在培养基上的生长状态。
图2为再生芽在培养基上的生长状态。
图3为再生苗在培养基上的生长状态。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
光暗交替培养(即光照培养和暗培养交替)条件为：25℃。光照培养时的光照强度为1800-2000Lx。光暗交替培养的周期具体为：16h光照培养/8h黑暗培养。
下述实施例中，分化率＝再生苗数/接种无菌洋葱幼胚总数×100％。
洋葱品种中生赤玉为北京京研益农种业有限公司的产品。在下文中，洋葱品种中生赤玉简称洋葱。
MS固体培养基：将4.43g MS粉末和30g蔗糖溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.8；然后加入3.5g植物凝胶，121℃高压灭菌20min。
1/2MS固体培养基：将2.22g MS粉末和30g蔗糖溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.8；然后加入3.5g植物凝胶，121℃高压灭菌20min。
MS粉末为Phyto Technology Laboratories公司的产品，货号为M519。
实施例1、洋葱离体再生的方法的建立
一、外植体的筛选
1、无菌洋葱花蕊的获得
(1)取洋葱花蕊(受精5d的洋葱花蕊、受精8d的洋葱花蕊、受精12d的洋葱花蕊或受精15天的洋葱花蕊)，4℃静置过夜。
(2)完成步骤(1)后，取所述洋葱花蕊，加入75％(v/v)乙醇水溶液表面消毒2min，用灭菌水冲洗3遍。
(3)完成步骤(2)后，取所述洋葱花蕊，加入10％(v/v)次氯酸钠水溶液和两滴Tween20，混匀，消毒20min(期间每隔5min混匀一次)；然后在无菌超净台中用无菌水冲洗5遍，得到无菌洋葱花蕊。
2、初级愈伤组织的获得
(1)取步骤1获得的无菌洋葱花蕊，用无菌杂交镊子划破种皮，取出半透明的幼胚。
(2)完成步骤(1)后，将所述幼胚接种至含5mg/L毒莠定(Picloram)的MS固体培养基，25℃暗培养6d，得到初级愈伤组织。
3、胚性愈伤组织的获得
将步骤2获得的初级愈伤组织转移至含5mg/LPicloram、5mg/L AgNO3和300mg/L特美汀(Timentin)的MS固体培养基，光暗交替培养3-4周(期间每隔10-14d继代一次)，得到胚性愈伤组织。
胚性愈伤组织在培养基上的生长状态见图1。
4、再生芽的获得
将步骤3获得的胚性愈伤组织转移至含1.5mg/L激动素(kinetin)、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的MS固体培养基，光暗交替培养2-3周(期间每隔10-14d继代一次)，得到再生芽。
再生芽在培养基上的生长状态见图2。
5、再生苗的获得和移栽
(1)将步骤4获得的再生芽转移至1/2MS固体培养基，光暗交替培养两周，得到再生苗。统计分化率。
再生苗在培养基上的生长状态见图3。
(2)完成步骤(1)后，将再生苗转移至温室，打开瓶口驯化3天。
(3)完成步骤(2)后，将再生苗从三角瓶中取出，洗去根上附着的1/2MS固体培养基，然后移栽至营养土中，温室培养。移栽后的3d内保持土壤湿润，之后按实生苗正常管理。
统计结果见表1。结果表明，进行洋葱离体再生时，以受精8d的洋葱花蕊或受精12d的洋葱花蕊为外植体的分化率较高。
表1
洋葱花蕊 分化率
受精5d的洋葱花蕊 0％
受精8d的洋葱花蕊 92％
受精12d的洋葱花蕊 85％
受精15d的洋葱花蕊 66％
二、培养幼胚获得初级愈伤组织的最佳培养基的筛选
1、无菌洋葱花蕊的获得
(1)取受精12d的洋葱花蕊，4℃静置过夜。
(2)同步骤一1中(2)。
(3)同步骤一1中(3)。
2、初级愈伤组织的获得
(1)同步骤一2中(1)。
(2)完成步骤(1)后，将所述幼胚接种至培养基1、培养基2、培养基3、培养基4或培养基5(表2中第1-2列所示)，25℃暗培养6d，得到初级愈伤组织。
3、胚性愈伤组织的获得
同步骤一中3。
4、再生芽的获得
同步骤一中4。
5、再生苗的获得和移栽
同步骤一中5。
统计结果见表2中第3列。结果表明，采用培养基2、培养基3或培养基4培养幼胚进行洋葱离体再生的分化率较高。进行洋葱离体再生时，培养幼胚获得初级愈伤组织的最佳培养基为培养基3。
表2
培养基 培养基的具体配方 分化率
培养基1 含3mg/L Picloram的MS固体培养基 72％
培养基2 含4mg/L Picloram的MS固体培养基 87％
培养基3 含5mg/L Picloram的MS固体培养基 91％
培养基4 含6mg/L Picloram的MS固体培养基 89％
培养基5 含7mg/L Picloram的MS固体培养基 84％
三、培养初级愈伤组织获得胚性愈伤组织的最佳培养基的筛选
1、无菌洋葱花蕊的获得
(1)取受精12d的洋葱花蕊，4℃静置过夜。
(2)同步骤一1中(2)。
(3)同步骤一1中(3)。
2、初级愈伤组织的获得
同步骤一中2。
3、胚性愈伤组织的获得
将步骤2获得的初级愈伤组织转移至培养基1、培养基2、培养基3、培养基4、培养基5、培养基6、培养基7或培养基8(表3中第1-2列所示)，光暗交替培养3-4周(期间每隔10-14d继代一次)，得到胚性愈伤组织。
4、再生芽的获得
同步骤一中4。
5、再生苗的获得和移栽
同步骤一中5。
统计结果见表3中第3列。结果表明，采用培养基2、培养基3或培养基4培养初级愈伤组织进行洋葱离体再生的分化率较高。进行洋葱离体再生时，培养初级愈伤组织获得胚性愈伤组织的最佳培养基为培养基3。
表3
四、培养胚性愈伤组织获得再生芽的最佳培养基的筛选
1、无菌洋葱花蕊的获得
(1)取受精12d的洋葱花蕊，4℃静置过夜。
(2)同步骤一1中(2)。
(3)同步骤一1中(3)。
2、初级愈伤组织的获得
同步骤一中2。
3、胚性愈伤组织的获得
同步骤一中3。
4、再生芽的获得
将步骤3获得的胚性愈伤组织转移至培养基1、培养基2、培养基3、培养基4、培养基5、培养基6、培养基7或培养基8(表4中第1-2列所示)，光暗交替培养2-3周(期间每隔10-14d继代一次)，得到再生芽。
5、再生苗的获得和移栽
同步骤一中5。
统计结果见表4中第3列。结果表明，采用培养基2、培养基3、培养基4或培养基5培养胚性愈伤组织进行洋葱离体再生的分化率较高。进行洋葱离体再生时，培养胚性愈伤组织获得再生芽的最佳培养基为培养基3。
表4

Claims (10)

1.一种洋葱离体再生的方法，是以受精的洋葱花蕊中的幼胚为外植体，完成离体再生。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述受精的洋葱花蕊为受精8-12d的洋葱花蕊。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述洋葱离体再生的方法包括如下步骤：
(1)将所述外植体置于含4-6mg/LPicloram的培养基进行培养，获得初级愈伤组织；
(2)完成步骤(1)后，将所述初级愈伤组织置于含4-6mg/LPicloram、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基进行培养，获得胚性愈伤组织；
(3)完成步骤(2)后，将所述胚性愈伤组织置于含1.5-2.5mg/L激动素、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基进行培养，获得再生芽；
(4)完成步骤(3)后，将所述再生芽置于生根培养基进行培养，获得再生苗。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述含4-6mg/LPicloram的培养基为含4-6mg/LPicloram的MS固体培养基；
所述含4-6mg/LPicloram、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基为含4-6mg/LPicloram、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的MS固体培养基；
所述含1.5-2.5mg/L激动素、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基为含1.5-2.5mg/L激动素、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的MS固体培养基；
所述生根培养基为1/2 MS固体培养基。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述含4-6mg/LPicloram的MS固体培养基为含5mg/LPicloram的MS固体培养基；
所述含4-6mg/LPicloram、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的MS固体培养基为含5mg/LPicloram、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的MS固体培养基；
所述含1.5-2.5mg/L激动素、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的MS固体培养基为含1.5mg/L激动素、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的MS固体培养基。
6.如权利要求3至5任一所述的方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，所述培养的条件为：23℃～27℃，暗培养4～8d；
所述步骤(2)中，所述培养的条件为：23℃～27℃，光暗交替培养3-4周；
所述步骤(3)中，所述培养的条件为：23℃～27℃，光暗交替培养2-3周；
所述步骤(4)中，所述培养的条件为：23℃～27℃，光暗交替培养2-3周。
7.用于洋葱离体再生的试剂盒，包括“含4-6mg/LPicloram的培养基”、“含4-6mg/LPicloram、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基”和“含1.5-2.5mg/L激动素、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基”中的至少一种。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：
所述含4-6mg/LPicloram的培养基为含4-6mg/LPicloram的MS固体培养基；
所述含4-6mg/LPicloram、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基为含4-6mg/LPicloram、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的MS固体培养基；
所述含1.5-2.5mg/L激动素、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的培养基为含1.5-2.5mg/L激动素、4-6mg/L AgNO3和200-400mg/L Timentin的MS固体培养基。
9.如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括生根培养基。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述生根培养基为1/2 MS固体培养基。
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