CN108739391A - 一种单倍体洋葱离体再生的方法及其专用外植体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种单倍体洋葱离体再生的方法及其专用外植体。该方法是以洋葱的未授粉子房为外植体，完成离体再生；所述未授粉子房的大小为2.5‑4.5mm。实验证明，采用本发明提供的方法可以快速获得洋葱单倍体，对自交系的选育进程和推广各种生态类型与用途的杂交种的种植，加快洋葱优良品种的选育，推动我国出口创汇型洋葱产业的可持续发展有着十分重要的意义。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种单倍体洋葱离体再生的方法及其专用外植体
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单倍体洋葱离体再生的方法及其专用外植体。
背景技术
洋葱是较早开展单倍体育种的作物之一。1989年，Muren等利用洋葱未授粉子房获得了单倍体，之后多个研究小组对不同植物通过未授粉子房培养获得相应的单倍体。洋葱与其它近缘种的杂种通过子房培养也获得了单倍体，如在拥有实葶葱胞质的CMSshallot和洋葱的杂种一代通过未授粉子房培养获得了单倍体；洋葱与野葱的杂种一代通过子房培养也获得了单倍体。
国外学者对洋葱未授粉子房培养技术体系的研究发现，不同基因型和地理源的洋葱的诱导率差异明显。国内洋葱育种起步晚，研究力量薄弱，投入少，加上洋葱生长周期长且无法加代育种等原因，目前国内尚缺乏利用洋葱未授粉子房获得单倍体的优良方法。为了加快自交系的选育进程和推广各种生态类型与用途的杂交种的种植，建立通过洋葱未授粉子房获得单倍体的方法至关重要。
发明内容
本发明的目的是获得单倍体洋葱。
本发明首先保护一种单倍体洋葱离体再生的方法，是以洋葱的未授粉子房为外植体，完成离体再生。
上述方法中，所述未授粉子房的大小可为2.5-4.5mm(如2.5-3.5mm、3.5-4.5mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或4.5mm)。
所述“以洋葱的未授粉子房为外植体，完成离体再生”的方法可包括如下步骤：
(1)将所述洋葱的未授粉子房接种于诱导培养基进行培养，获得幼芽；所述诱导培养基中含有1.5mg/L～2.5mg/L(如1.5mg/L～2.0mg/L、2.0mg/L～2.5mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L或2.5mg/L)的NAA、1.5mg/L～2.5mg/L(如1.5mg/L～2.0mg/L、2.0mg/L～2.5mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L或2.5mg/L)的6-BA和9-11g/L(如9-10g/L、10-11g/L、9g/L、10g/L或11g/L)的蔗糖；
(2)将步骤(1)获得的幼芽置于继代培养基进行培养，获得幼苗；所述继代培养基中含有1.5mg/L～2.5mg/L(如1.5mg/L～2.0mg/L、2.0mg/L～2.5mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L或2.5mg/L)的NAA和1.5mg/L～2.5mg/L(如1.5mg/L～2.0mg/L、2.0mg/L～2.5mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L或2.5mg/L)的6-BA；
(3)将步骤(2)获得的幼苗置于生根培养基进行培养，获得再生苗；再生苗即单倍体洋葱。
所述单倍体洋葱离体再生的方法还可包括步骤(4)：取步骤(3)获得的再生苗，炼苗。
所述炼苗的条件可为：16-20℃(如16-18℃、18-20℃、16℃、18℃或20℃)处理4-6d(如4d、5d或6d)。
所述单倍体洋葱离体再生的方法还可包括步骤(5)：完成步骤(4)后，将再生苗移至温室，培养。
所述步骤(5)中，将再生苗移至温室具体可为将再生苗移植到装有移植基质的营养钵，然后移至温室，培养。所述移植基质具体可由1体积份草炭土、1体积份大田土、1体积份厩肥和少量过筛炉灰渣组成。
上述任一所述单倍体洋葱离体再生的方法还可包括如下步骤(a)：将所述洋葱的未授粉子房进行消毒；在进行所述步骤(1)前先进行所述步骤(a)。
所述步骤(a)中，将洋葱的未授粉子房进行消毒采用的试剂依次可为乙醇和次氯酸钠。所述步骤(a)中，将洋葱的未授粉子房进行消毒的方法可为：先用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡40s-80s，蒸馏水洗涤；再用3％(m/v)的次氯酸钠水溶液浸泡8-12min，蒸馏水洗涤。
所述步骤(1)中，诱导培养基可为含有1.5mg/L～2.5mg/L(如1.5mg/L～2.0mg/L、2.0mg/L～2.5mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L或2.5mg/L)的NAA、1.5mg/L～2.5mg/L(如1.5mg/L～2.0mg/L、2.0mg/L～2.5mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L或2.5mg/L)的6-BA、9-11g/L(如9-10g/L、10-11g/L、9g/L、10g/L或11g/L)的蔗糖和6-8g/L(如6-7g/L、7-8g/L、6g/L、7g/L或8g/L)的琼脂的BDS培养基。所述诱导培养基的pH值可为5.7-5.9(如5.7、5.8或5.9)。
所述步骤(2)中，继代培养基可为含有1.5mg/L～2.5mg/L(如1.5mg/L～2.0mg/L、2.0mg/L～2.5mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L或2.5mg/L)的NAA和1.5mg/L～2.5mg/L(如1.5mg/L～2.0mg/L、2.0mg/L～2.5mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L或2.5mg/L)的6-BA的MS固体培养基。
所述步骤(3)中，生根培养基可为MS固体培养基。
所述步骤(1)中，培养的条件可为：24℃～26℃(如24℃～25℃、25℃～26℃、24℃、25℃或26℃)，光暗交替培养20～30d(如20～25d、25～30d、20d、25d或30d)。
所述步骤(2)中，培养的条件可为：24℃～26℃(如24℃～25℃、25℃～26℃、24℃、25℃或26℃)，光暗交替培养25-35d(如25-30d、30-35d、25d、30d或35d)。
所述步骤(3)中，培养的条件可为：24℃～26℃(如24℃～25℃、25℃～26℃、24℃、25℃或26℃)，光暗交替培养15-25d(如15-20d、20-25d、15d、20d或25d)。
上述任一所述的方法中，所述洋葱具体可为邯郸紫星自交系的杂交后代。
上述任一所述光暗交替培养即光照培养和暗培养交替进行。光照培养的时间可为16h，暗培养的时间可为8h。光照培养时的光照强度具体可为50μmol/m2s。
本发明还保护一种用于单倍体洋葱离体再生的试剂盒，其含有上述任一所述诱导培养基和/或上述任一所述继代培养基和/或上述任一所述生根培养基。
实验证明，采用本发明提供的方法可以快速获得洋葱单倍体，对自交系的选育进程和推广各种生态类型与用途的杂交种的种植，加快洋葱优良品种的选育，推动我国出口创汇型洋葱产业的可持续发展有着十分重要的意义。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为单倍体洋葱离体再生过程。
图2为单倍体洋葱的染色体倍性鉴定；其中A为单倍体洋葱的染色体，B为二倍体洋葱的染色体，C为二倍体洋葱的DNA含量分布图，D为单倍体洋葱的DNA含量分布图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
诱导培养基：含10g/L蔗糖、2.0mg/L NAA、2.0mg/L 6-BA、7g/L琼脂的BDS培养基。诱导培养基的pH值为5.8，需112℃高压灭菌25min。
继代培养基：含2.0mg/L NAA和2.0mg/L 6-BA的MS固体培养基。
光暗交替培养即光照培养和暗培养交替进行，光照培养的时间为16h，暗培养的时间为8h；光照培养时的光照强度为50μmol/m2s。
实施例1、单倍体洋葱离体再生
本实施例中，未开放花蕾即未授粉子房。
营养钵规格为5×5cm。移植基质由1体积份草炭土、1体积份大田土、1体积份厩肥和少量过筛炉灰渣组成。
供试洋葱为邯郸紫星自交系的后代(北京京研益农种业有限责任公司的产品)。
单倍体洋葱离体再生的步骤如下：
1、供试洋葱开花散粉前5-6d，用镊子从总苞被开裂的花序(花序直径为1.5-2.0cm，每个花序上大约100-150个花蕾)上取未开放花蕾(直径为2-5mm)，然后根据直径大小分为三个等级：S级花蕾(未开放花蕾直径为2(含2)-2.5mm(不含2.5))、M级花蕾(未开放花蕾直径为2.5(含2.5)-4.5mm(含4.5))和L级花蕾(未开放花蕾直径大于4.5mm)。
未开放花蕾分等级详见图1中A(从上至下依次为L级花蕾、M级花蕾和S级花蕾)。
2、完成步骤1后，分别三个等级的花蕾进行消毒。消毒过程为：先用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡1min，无菌水冲洗3次；再用3％(m/v)的次氯酸钠水溶液浸泡10min，无菌水冲洗4次。
3、完成步骤2后，将花蕾接种至装有诱导培养基的培养皿，25±1℃光暗交替培养25d(期间每隔7d更换一次诱导培养基)，得到幼芽(图1中B-D)。
4、完成步骤3后，将幼芽转移至装有继代培养基的锥形瓶，25±1℃光暗交替培养30d，得到幼苗(图1中E)。
5、完成步骤4后，将幼苗转移至装有生根培养基(即MS固体培养基)的锥形瓶，25±1℃光暗交替培养15-25d(见图1中F)，得到再生苗。
6、将步骤5得到的根系发达、生长健壮的再生苗拿出培养室，打开封口膜，于18℃室温下低温炼苗5d；然后洗净根系上附着的琼脂，移植到装有移植基质的营养钵(图1中G)，浇足水后置于温室培养30d，得到单倍体洋葱。
将步骤6获得的单倍体洋葱移栽到冷床中，植株能很好地适应外界环境条件，生长势强。
上述再生单倍体洋葱过程中，分别统计三个等级的花蕾接种花蕾数、未污染花蕾数、成苗数、成苗率等。统计结果见表1。结果表明，M级花蕾的成苗率最高，是通过未授粉子房离体培养再生单倍体洋葱的最佳时期。
表1
实施例2、单倍体洋葱的染色体倍性鉴定
一、鉴定单倍体洋葱的染色体数目
1、随机取单倍体洋葱根尖1cm，置于浓度为0.002mol/L的8-羟基喹啉水溶液静置处理4h，然后加入卡诺固定液(由3体积份酒精和1体积份冰醋酸组成)，4℃固定过夜。
2、完成步骤1后，将单倍体洋葱根尖置于离心管，加入1-2mL解离液(由1体积份浓盐酸和1体积份95％(v/v)乙醇水溶液组成)，加热煮沸30s。
3、完成步骤2后，弃解离液，蒸馏水洗涤2-3次，然后吸干单倍体洋葱根尖上的水分。
4、完成步骤3后，加入1-2mL醋酸洋红，静置15min。
5、完成步骤4后，弃醋酸洋红，取根尖，常规制片。
6、完成步骤5后，在显微镜下观察单倍体洋葱的染色体数目。
实验结果见图2中A。结果表明，单倍体洋葱的染色体数目为8条。
按照上述步骤，将“单倍体洋葱”替换为正常二倍体洋葱植株，其它步骤均不变。
实验结果见图2中B。结果表明，正常二倍体洋葱植株染色体数目为16条。
二、鉴定单倍体洋葱的叶片细胞DNA含量
采用流式细胞仪分别测定单倍体洋葱和正常二倍体洋葱植株叶片细胞DNA含量的分布。
正常二倍体洋葱叶片细胞DNA含量的分布图见图2中C。单倍体洋葱的叶片细胞DNA含量的分布图见图2中D。结果表明，正常二倍体洋葱在相对荧光强度约为100的位置出现一个单峰，单倍体洋葱在相对荧光强度约为50的位置出现一个单峰，后者约为前者的二分之一，表明后者的DNA相对含量减少了一倍。由此鉴定单倍体洋葱为单倍体。

Claims (10)

1.一种单倍体洋葱离体再生的方法，是以洋葱的未授粉子房为外植体，完成离体再生。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述未授粉子房的大小为2.5-4.5mm。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述“以洋葱的未授粉子房为外植体，完成离体再生”的方法包括如下步骤：
(1)将洋葱的未授粉子房接种于诱导培养基进行培养，获得幼芽；所述诱导培养基中含有1.5mg/L～2.5mg/L的NAA、1.5mg/L～2.5mg/L的6-BA和9-11g/L的蔗糖；
(2)将步骤(1)获得的幼芽置于继代培养基进行培养，获得幼苗；所述继代培养基中含有1.5mg/L～2.5mg/L的NAA和1.5mg/L～2.5mg/L的6-BA；
(3)将步骤(2)获得的幼苗置于生根培养基进行培养，获得再生苗；再生苗即单倍体洋葱。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述单倍体洋葱离体再生的方法还包括步骤(4)：取步骤(3)获得的再生苗，炼苗。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述炼苗的条件为：16-20℃处理4-6d。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述单倍体洋葱离体再生的方法还包括步骤(5)：完成步骤(4)后，将再生苗移至温室，培养。
7.如权利要求3至6任一所述的方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，诱导培养基为含有1.5mg/L～2.5mg/L的NAA、1.5mg/L～2.5mg/L的6-BA、9-11g/L的蔗糖和6-8g/L的琼脂的BDS培养基；诱导培养基的pH值为5.7-5.9；
所述步骤(2)中，继代培养基为含有1.5mg/L～2.5mg/L的NAA和1.5mg/L～2.5mg/L的6-BA的MS固体培养基；
所述步骤(3)中，生根培养基为MS固体培养基。
8.如权利要求3至7任一所述的方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，培养的条件为：24℃～26℃，光暗交替培养20～30d；
所述步骤(2)中，培养的条件为：24℃～26℃，光暗交替培养25-35d；
所述步骤(3)中，培养的条件为：24℃～26℃，光暗交替培养15-25d。
9.如权利要求1至8任一所述的方法，其特征在于：所述洋葱为邯郸紫星自交系的杂交后代。
10.一种用于单倍体洋葱离体再生的试剂盒，含有权利要求3或7中所述诱导培养基和/或所述继代培养基和/或所述生根培养基。
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