CN103782910A

CN103782910A - 百合未受精子房离体培养的方法

Info

Publication number: CN103782910A
Application number: CN201410050529.4A
Authority: CN
Inventors: 袁素霞; 明军; 刘春�; 李佳; 徐雷锋
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-02-13
Filing date: 2014-02-13
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2034-02-13
Also published as: CN103782910B

Abstract

本发明百合未受精子房离体培养的方法，属于植物单倍体培养技术领域。本发明方法采用以开花前1天的花蕾为试材，灭菌后取其子房，将其横切成片，之后将子房切片接种在BDS诱导培养基上，诱导胚胎发生，获得了较高频率的成胚率，平均每个子房含有108～223个胚性胚珠。之后再将诱导的子房切片转接在BDS再生培养基上通过胚胎发生途径得到单倍体、二倍体、非整倍体等其它倍性的再生植株。本发明方法对加快百合育种、种质创新和遗传学基础研究具有重要意义。

Description

百合未受精子房离体培养的方法

技术领域

本发明属于植物单倍体培养技术领域，具体涉及通过百合未受精子房培养获得单倍体等新材料的一种组织培养方法。

背景技术

百合（Lilium）是重要的观赏和食用植物。现代观赏百合大部分为远缘杂交的后代，等位基因杂合，遗传背景复杂，使得许多重要性状如花色、抗病虫性等遗传异常复杂。因而，在常规杂交育种中，对重要育种目标性状的遗传缺乏可预测性，加之生育周期长达3年以上，难以高效定向的优化聚合优良遗传基因。而利用单倍体培养技术可以在短时间内获得等位基因纯和的个体，这样就大大简化了遗传背景，利于进行重要性状的遗传分析，以便于在杂交育种中提高目标性状遗传的可预测性，有目的性地进行杂交育种工作，缩短育种年限，对提高新品种选育效率具有重要作用。同时，隐性性状得以表达，丰富了育种资源。获得的单倍体还可应用于基因转化、诱变、突变体筛选等研究中，为种质资源创新提供了一种快捷有效的新途径。此外，获得的单倍体经过加倍所建立的双单倍体群体也是进行分子标记、遗传图谱构建、基因定位等研究的理想材料。因此，对百合单倍体培养技术进行研究，对加快百合的遗传学基础研究、提高百合的育种效率和育种水平具有重要意义。

未受精子房或胚珠离体培养是人工诱导雌核发育形成单倍体和双单倍体的技术之一。此技术尤其适用于雄性不育的植物，以及通过雄核发育难以获得单倍体的植物。来源于雌配子的单倍体最早在曼陀罗（Datura stramonium）中被发现（Blakeslee AF,Belling J,Farnham ME and Bergner AD.A haploid mutant in the Jimson weed,‘Datura stramonium’.Science,1922,55:646-647.）。这种自发的单倍体随后在其它植物（烟草、水稻、玉米、大麦和芸薹属作物）中也被发现，但是自发频率很低（Palmer CE and Keller WA.Overview of haploid.In:Biotechnology in agriculture and forestry,Vol.56.Nagata T,Lorz H and Widtholm JM(eds).Springer,Berlin Heidelberg,2005,pp3-10.）。因此，各国的研究学者对体外诱导雌核单倍体植株产生的方法进行了研究，于1976年首次利用大麦未授粉子房培养出单倍体植株（San Noeum LH.Haploides d’hordeum vulgare L.par culture in vitro non fecondes.Ann Amelior Plant,1976,26:751-754.）。之后未授粉子房或胚珠离体培养相继在约30个物种（如：大麦、小麦、水稻、玉米、洋葱、黄瓜、南瓜、甜菜、向日葵等）上获得了成功（Bohanec B.Doubled haploids in gynogenesis.In:Advances in Haploid Production in Higher Plants.Touraev A,Forster BP and Moha S(eds).Springer,United Kingdom,2009,pp35-46.）。目前，这项技术已在洋葱和甜菜的育种中得以应用。而在百合中，未授粉子房或胚珠离体培养的研究相对甚少。谷祝平和郑国锠（1983）在‘大卫百合’中以1.2～1.8cm长的花蕾为试材进行未授粉子房离体培养主要通过愈伤途径获得了单倍体植株，MS培养基的愈伤诱导率高于N6培养基，当2,4-D和6-BA均为4mg·L^-1时，MS愈伤诱导率最高为47.76%。Prakash和Giles（Prakash J and Giles KL.Production of doubled haploids in oriental lilies.In:Genetic Manipulation in Plant Breeding.De Gruyter W and Co(eds).Berlin-New York,1986,pp335-337.）以1/2MS培养基为基础培养基并以2.0cm长的花蕾为试材利用子房切片培养在东方百合‘Leraza’中通过胚胎途径获得了少量雌核再生植株。Ramsay等（Ramsay JL,Galitz DS and Lee CW.Basal medium and sucrose concentration influence regeneration of Easter Lily in ovary culture.HortScience,2003,38:404-409.）以3～5cm花蕾长的铁炮百合‘Ace’为试材，采用切片培养通过愈伤途径获得了再生植株，此研究还表明MS培养基愈伤诱导率高于B5培养基，培养基中适合的蔗糖浓度是5%。赵珺（赵珺.百合未授粉子房离体培养及胚胎学研究.沈阳农业大学硕士论文，2007.）以OT品种‘黄巨人’的单核小孢子发育时期对应的子房为试材，采用MS诱导培养基通过愈伤途径获得了较低频率的单倍体（5.26%）和非整倍体（7.89%）。上述研究结果表明，到目前为止百合未授粉子房离体培养仅在少数几个基因型中获得成功，尤其是缺乏性状优良基因型培养成功的报道；大多数是采用MS培养基作为诱导培养基；在试验中三种基因型所选用的花蕾长度不一致；大多数是通过愈伤途径获得再生植株，其中单倍体频率低。此外，通过愈伤途径获得的二倍体再生植株，其有可能起源于体细胞，上述研究工作都缺乏对二倍体起源进行鉴定。

发明内容

针对上述技术现状，本发明提供较为完善的百合未受精子房培养技术体系，以提高胚胎诱导率，通过胚胎诱导途径获得再生植株，对加快百合育种、种质创新和遗传学基础研究具有重要意义。

本发明具体技术方案：百合未受精子房离体培养的方法包括如下步骤：

（1）选取合适的花蕾，灭菌；

（2）取出子房，将其横切成片；

（3）将子房切片接种在含有诱导培养基的三角瓶或培养皿中培养20～25d，诱导胚珠内胚胎形成；

（4）将含有诱导膨大胚珠的子房片转接在植株再生培养基中，诱导胚胎萌发进行植株再生；

（5）将再生植株转接到生根培养中进行生根15～20d，获得根系健壮的无菌组培苗；

所述的合适花蕾为开花前1天的花蕾，

所述诱导培养基：BDS+2,4-D2mg/L+6-BA2mg/L+蔗糖100g.L^-1+琼脂6g.L^-1，pH6.0；植株再生培养基为BDS+蔗糖50g.L^-1+琼脂6g.L^-1，pH6.0；生根培养基为1/2MS++IBA0.1mg.L^-1+NAA0.1mg.L^-1+蔗糖60g.L^-1+琼脂6g.L^-1，pH6.0。

所述培养条件：光照1600lx、14h白天/10h黑夜，（25±1）℃条件下进行培养。

所述再生培养时间为80～100d。

所述灭菌采取如下顺序步骤：将百合花蕾，置于无菌瓶中，先用75%的酒精表面灭菌30s，之后用10%NaClO消毒10min，然后无菌水冲洗3次，每次3分钟。

所述切片厚度为1～2mm。

所述方法还包括再生植株的倍性鉴定步骤。

所述倍性鉴定方法采用根尖染色体计数法：切取3～8mm根尖置于0.7mmol^-1放线菌酮中25℃预处理8～9h，然后放入卡诺氏固定液中固定24h，用蒸馏水洗净后，用1mol·L^-1HCl在60℃水浴条件下解离10min，蒸馏水漂洗2-3次，然后用卡宝品红染色制作压片，于显微镜下进行染色体观察，选取分散良好的中期分裂细胞进行显微拍照，每份材料观察30个处于有丝分裂中期的细胞，统计染色体数目，确定染色体倍性水平。

所述显微镜的型号为Olympus CX31。

本发明方法是以开花前1天的花蕾为最佳外植体进行取样，采用BDS培养基进行诱导培养（图1），相对以小花蕾为外植体、以MS培养基为诱导培养基的方法，获得了较高频率的胚胎诱导率，平均每个子房含有108～223个胚性胚珠。将切片子房诱导20～25d后转入植株再生培养基中进行诱导胚胎萌发再生成植株，避免了愈伤途径发生，从而也避免了体细胞植株的再生。通过胚胎发生途径在其中5个供试材料上获得了再生植株（图2）。经染色体计数法进行倍性鉴定，在二倍体母体材料上获得的再生植株群体是由单倍体、二倍体和非整倍体组成，在三倍体母体材料上获得的再生植株群体均是由非整倍体组成。（图3）。

本发明的有益效果：

（1）BDS培养基优于CBM和MS，在7个供试基因型上，BDS培养基诱导的胚性胚珠数均显著高于MS（表1）；而且，在CBM和MS培养基上的胚珠较易出现褐化和玻璃化现象。MS培养基中含有较高浓度的铵态氮、硝态氮和钙离子，尤其是铵态氮，高氮和高钙浓度可能不利于百合未受精胚珠培养和雌核单倍体胚胎诱导；而BDS培养基中除特有的脯氨酸外，还含有较高浓度的肌醇，这两种成分也许在一定程度上促进了百合雌核单倍体胚胎诱导。

（2）开花前1d为最佳取样时间。子房的取样时期与未授粉子房培养胚珠的发育状况和胚胎发生密切相关。花蕾长度最小的子房其胚珠长势较差，但随着花蕾长度的增加，其胚珠的长势变好。不同花蕾长度其子房培养的胚胎诱导率差异显著。综合所有供试基因型的胚胎诱导率，开花前1d是进行百合未授粉子房离体培养的最佳取样时期（见表2）。

（3）诱导培养20～25后，在显微镜下采用胚珠透明技术可以观察到膨大的胚珠内的胚胎（图1中C）。转接在植株再生培养基中通过诱导胚胎萌发再生成植株，而不是通过诱导愈伤组织再生成植株。这样获得的再生植株是真正的雌核植株。

附图说明

图1百合未受精子房离体培养中胚胎诱导发生,

其中A.切片子房诱导培养0d，B.切片子房诱导培养20d，C.含有胚胎的胚珠,

图2‘Sorbonne’未受精子房离体培养植株再生过程,

其中A.胚胎萌发穿破胚珠，B.胚胎萌发成小幼苗，C.幼苗长出幼根，D.长成小植株，

图3‘Sorbonne’和‘Conca’dor’未授精子房离体培养再生植株的倍性情况,

其中,Sorbonne’二倍体母体植株的再生植株的倍性,A、2n=10(非整倍体)，B、2n=12(单倍体)，C、2n=14(非整倍体)，D、2n=24(二倍体)，

‘Conca’dor’三倍体母体植株的再生植株倍性,E、2n=17(非整倍体)，F、2n=19(非整倍体)，G、2n=21(非整倍体)，H、2n=24(非整倍体)。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的技术方案做进一步详细描述。

BDS培养基组：诱导培养基：BDS+2,4-D2mg/L+6-BA2mg/L+蔗糖100g.L^-1+琼脂6g.L^-1，pH6.0；植株再生培养基为BDS+蔗糖50g.L^-1+琼脂6g.L^-1，pH6.0；生根培养基为1/2MS++IBA0.1mg.L^-1+NAA0.1mg.L^-1+蔗糖60g.L^-1+琼脂6g.L^-1，pH6.0。

CBM培养基组：诱导培养基：CBM+2,4-D2mg/L+6-BA2mg/L+蔗糖100g.L^-1+琼脂6g.L^-1，pH6.0。

MS培养基组：诱导培养基：MS+2,4-D2mg/L+6-BA2mg/L+蔗糖100g.L^-1+琼脂6g.L^-1，pH6.0。

实施例1不同时期的花蕾，不同基因型，不同培养基的离体培养对比：

百合未受精子房离体培养方法，包括如下步骤：

（1）选取花蕾，在无菌条件下置于无菌瓶中，先用75%的酒精表面灭菌30s，之后用10%NaClO消毒10min，然后无菌水冲洗3次，每次3分钟；

（2）在超净工作台里，将无菌花蕾剥开取出子房，将其子房横切成1～2mm厚度的切片；

（3）将子房切片接种在含有不同诱导培养基的三角瓶或培养皿中，置于光照1600lx、14h/10 h（白天/黑夜），（25±1）℃条件下进行培养20～25d，诱导胚珠内胚胎形成；

（4）在显微镜下利用胚珠透明技术对含有胚胎的胚珠（胚性胚珠）数量进行统计；见表1、表2。

部分采用的胚珠透明技术为：将膨大的胚珠取下，用卡诺氏固定液固定24h后再用4%戊二醛固定2h，经15%、30%、50%、70%、85%、95%酒精梯度脱水，每级20min，100%酒精两次，每次30min。脱水后，用无水酒精和冬青油体积比（1﹕1）浸泡1h后转入冬青油中分别浸泡6h、12h、24h。待胚珠变成透明后置于体式显微镜（Olympus SZ）下观察胚珠内胚胎的有无。

表1不同诱导培养基中百合未授粉子房离体培养的胚胎发生频率

注：邓肯氏多重比较测验；同一列数据后不同小写字母表示差异达到显著水平（P<0.05）。

表2不同基因型不同花蕾长度成胚率比较

表1试验结果表明,在所有供试基因型上，BDS培养基诱导的胚性胚珠数均最多，均显著高于MS培养基；在其中3个基因型（‘Siberia’、‘Conca'dor’、‘Yellow Ween’）上，BDS培养基诱导的胚性胚珠数与CBM差异不显著，但在其余4个基因型上，BDS培养基的胚性胚珠诱导率显著高于CBM。综合所有供试基因型来看，在三种诱导培养基中，BDS培养表现最佳。

从表2可以看出，‘Yellow Ween’、‘Robina’和‘Ceb Dazzle’三种基因型材料在开花前1d的子房培养中，胚性胚珠数均显著高于其它取样时期；在‘Siberia’和Lilium regale中，胚性胚珠数与已开花3d的子房差异不显著，但均显著高于其它取样时期；在其余的2个基因型上，花前1d的子房也表现出较高的胚性胚珠数。综合评价，开花前1d是进行百合未授粉子房离体培养的最佳取样时期。

实施例2各培养阶段性状

（1）于温室中取开花前1d的花蕾（约10cm），在无菌条件下置于无菌瓶中，先用75%的酒精表面灭菌30s，之后用10%NaClO消毒10min，然后用无菌水冲洗3次，每次3分钟；

（2）将灭菌好的花蕾剥开，取出子房，用手术刀将其横切成1～2mm厚度的切片，将切片横放在诱导培养基上进行诱导培养（图1中A），诱导培养基为：BDS+2,4-D2mg/L+6-BA2 mg/L+蔗糖100g.L^-1+琼脂6g.L^-1，pH6.0。培养条件为：光照1600lx、14h/10h（白天/黑夜），（25±1）℃。培养20～25d。

（3）诱导培养20～25d后，胚珠膨大，切片的子房也膨大（图1中B），在显微镜下利用胚珠透明技术可以观察到膨大的胚珠内的胚胎（图1中C）。含有胚胎的胚珠为胚性胚珠，平均每个子房含有116个胚性胚珠。此时，将其含有膨大胚珠的切片子房转接在植株再生培养基中诱导胚胎萌发再生成小植株（植株再生过程见图2），植株再生培养基：BDS+蔗糖50g.L^-1+琼脂6g.L^-1，pH6.0。培养条件为：光照1600lx、14h/10h（白天/黑夜），（25±1）℃。每25d继代一次，再生培养80～100d后即可通过胚胎发生途径获得再生小植株。

此部分采用的胚珠透明技术为：将膨大的胚珠取下，用卡诺氏固定液固定24h后再用4%戊二醛固定2h，经15%、30%、50%、70%、85%、95%酒精梯度脱水，每级20min，100%酒精两次，每次30min。脱水后，用无水酒精和冬青油体积比（1﹕1）浸泡1h后转入冬青油中分别浸泡6h、12h、24h。待胚珠变成透明后置于体式显微镜（Olympus SZ）下观察胚珠内胚的生长状况。

（4）将再生小植株转接在生根培养基中培养15～20d，获得根系健壮的植株，生根培养基为1/2MS++IBA0.1mg.L^-1+NAA0.1mg.L^-1+蔗糖60g.L^-1+琼脂6g.L^-1，pH6.0。取其幼嫩根尖进行染色体计数，进行倍性鉴定。倍性鉴定方法：切取3～8mm根尖置于0.7mmol^-1放线菌酮中25℃预处理8～9h，然后放入卡诺氏固定液中固定24h，用蒸馏水洗净后，用1mol·L^-1HCl在60℃水浴条件下解离10min，蒸馏水漂洗2-3次，然后用卡宝品红染色制作压片，于Olympus CX31显微镜下进行染色体观察，选取分散良好的中期分裂细胞进行显微拍照，每份材料观察30个处于有丝分裂中期的细胞，统计染色体数目，确定染色体倍性水平。

（5）通过倍性鉴定，再生植株分别为单倍体、二倍体和非整倍体（图3）。

经染色体计数法进行倍性鉴定，在二倍体母体材料上获得的再生植株群体是由单倍体、二倍体和非整倍体组成，在三倍体母体材料上获得的再生植株群体均是由非整倍体组成。

本发明方法采用以开花前1天的花蕾为试材，灭菌后取其子房，将其横切成厚度为1～2mm的切片，之后将子房切片接种在BDS诱导培养基上，诱导胚胎发生，获得了较高频率的成胚率，平均每个子房含有108～223个胚性胚珠。之后再将诱导的子房切片转接在BDS再生培养基上诱导胚胎萌发，通过胚胎发生途径得到单倍体、二倍体、非整倍体等其它倍性的再生植株。利用此方法，已经在5个供试基因型上获得了大量再生植株。采用根尖染色体计数法对 ‘Sorbonne’和‘Conca’dor’未受精子房培养的部分再生植株进行了倍性鉴定，在二倍体基因型‘Sorbonne’上获得的再生植株中，单倍体比例为67%，其余为非整倍体和二倍体。在三倍体基因型‘Conca’dor’上获得的再生植株均为非整倍体。

Claims

1.百合未受精子房离体培养的方法，包括如下步骤：

（1）选取合适的花蕾，灭菌；

（2）取出子房，将其横切成片；

所述的合适花蕾为开花前1天的花蕾，

2.根据权利要求1所述的方法，所述诱导、生根的培养条件为：光照1600lx、14h白天/10h黑夜，（25±1）℃条件下进行培养。

3.根据权利要求1所述的方法，所述步骤（4）的再生培养时间为80～100d。

4.根据权利要求1所述的方法，所述切片厚度为1～2mm。

5.根据权利要求1所述的方法，所述灭菌采取如下顺序步骤：将百合花蕾，置于无菌瓶中，先用75%的酒精表面灭菌30s，之后用10%NaClO消毒10min，然后无菌水冲洗3次，每次3分钟。

6.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括再生植株的倍性鉴定步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，所述倍性鉴定方法采用根尖染色体计数法：切取3～8mm根尖置于0.7mmol^-1放线菌酮中25℃预处理8～9h，然后放入卡诺氏固定液中固定24h，用蒸馏水洗净后，用1mol·L^-1HCl在60℃水浴条件下解离10min，蒸馏水漂洗2-3次，然后用卡宝品红染色制作压片，于显微镜下进行染色体观察，选取分散良好的中期分裂细胞进行显微拍照，每份材料观察30个处于有丝分裂中期的细胞，统计染色体数目，确定染色体倍性水平。

8.根据权利要求7所述的方法，所述显微镜的型号为Olympus CX31。