CN102239802B

CN102239802B - 西瓜单倍体的生产方法及其专用培养基

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Publication number: CN102239802B
Application number: CN 201010178184
Authority: CN
Inventors: 王建设; 杨颖�; 裴晓利; 沈文娟; 宋晓华
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2010-05-14
Filing date: 2010-05-14
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2030-05-14
Also published as: CN102239802A

Abstract

本发明公开了一种西瓜单倍体的生产方法及其专用培养基。本发明提供的专用培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：细胞分裂素、生长素、碳源和凝胶剂；所述胚状体诱导培养基中细胞分裂素的终浓度是0.1-2mg/L，所述生长素的终浓度是0.1-1.5mg/L；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。实验证明：从上述专用培养基中的11个子房切片中共找到了3个体积膨大的胚状体可形成丛生芽R₁、R₂和R₃。利用流式细胞仪检测分析可知所有来源于R₂胚的再生植株的DNA相对含量在100附近，表明来源于R₂胚的所有再生植株的倍性为单倍体。证明了利用未授粉胚珠离体培养获得西瓜单倍体的方法是可行的。

Description

西瓜单倍体的生产方法及其专用培养基

技术领域

本发明涉及西瓜单倍体的生产方法及其专用培养基。

背景技术

单倍体是指具有配子染色体组成的孢子体。植物单倍体对植物遗传育种有重要意义，其主要用途如下：①通过单倍体培养和染色体加倍可快速获得纯合系。在植物的育种过程中，传统的多代自交、回交法一般需5-6年或更长的时间才能获得相对纯合的自交系，而用单倍体技术仅需要5-6个月的时间就可以获得纯合的材料，从而大大加速了选育的进程，缩短了育种的年限，较快地获得优良品种。②诱变单倍体可迅速发现隐性突变。单倍体培养获得的纯合植株，有利和不利的隐性突变基因都可以得到表达，进行离体诱变和抗性突变体筛选，可使选择效率大大提高。③单倍体技术还可用于固定亲本性状，使原来亲本更稳定均一。④理论研究。单倍体与二倍体杂交得到的非整倍体有助于解决测定连锁群、二倍体的染色体组成分和基因剂量的作用等一些问题。

西瓜是葫芦科的重要瓜类作物之一。长期以来，西瓜花药培养研究倍受关注。薛光荣等(1982)对“琼酥”和“周至红”2个西瓜品种进行了花药培养，获得了单倍体植株，但其愈伤组织的诱导率仅为0.5％，育种难以利用。薛光荣等(薛光荣，余文炎等.1983.西瓜花药离体培养获得花粉植株.植物生理学通讯，NO.4.40-42)通过花药培养获得的花粉植株经过加倍得到了一个高产、抗病的西瓜优良品种。袁万良等(袁万良，付润民，雷保林，曹小玲.1995.西瓜花培试验初报.陕西农业科学，1：29-30.)改良培养基，解决了愈伤组织褐变死亡的问题，不仅将愈伤组织诱导率从0.5％提高到94.4，并且快速诱导出了绿色组织。魏瑛等(魏瑛，张俊莲，陈年来等.西瓜花药愈伤组织的诱导，甘肃农业大学学报，1998)在“西农8号”和“京欣1号”2个西瓜品种上，花药愈伤诱导率达到57.7-62.9％。缑艳霞(缑艳霞2006西瓜花药离体培养技术研究，[硕士论文].杭州：浙江大学)以3个品种“拿比特”、“春光”和“喜都”为材料，发现诱导培养基蔗糖60g/L、4℃下处理72h低温预处理或30℃高温预培养72h后置于25℃常温黑暗培养有助于提高西瓜花药愈伤组织的诱导率，诱导愈伤组织质地良好，但最终还是没有获得再生植株。研究还发现活性炭对西瓜花药愈伤组织的形成有抑制作用。李娟(李娟，张丽，李焕秀，宫国义，张海英，郭绍贵，许勇.2008.西瓜花药培养技术研究中国瓜菜，4：8-10)在西瓜品种261上，先高温(35℃)后常温(26-30℃)的变温培养，在诱导培养基MS+KT1.5mg/L+6-BA2.0mg/L+NAA1.5mg/L上愈伤诱导率最高达58.63％，将愈伤转移愈伤增殖培养基MS+三十烷醇2.0mg/L+6-BA0.5mg/L上，培养5天出现深绿色点状组织，培养10天，愈伤生长迅速，分生旺盛，产生大量绿色组织，出现丛生芽。当丛生芽长至2cm左右时转至Ms+0.5mg/L IBA上生根。当成功诱导出根的时将其转入1/2MS+0.2mg/LIBA+1.0mg/LIAA上，获得了植株，但未鉴定倍性，结果不明确。

在西瓜上，Sari et al(Sari.N，Abak.K，Pitrat.M，et al.1994.Induction ofparthenogenetic haploid embryos after pollination by irradiated pollen in watermelon.HortScience，29：1189-1190.)研究了4个品种辐射花粉诱导单倍体技术(γ射线，辐射剂量200或300Gy，剂量率0.85Gy/min)，接种了26个果实、13844粒种子，诱导了761个胚。在诱导的胚中，球形胚占72.8％、心形胚占0.7％，其它26.5％为坏死(17.1％)或软化(9.2％)的心形胚。在品种间百粒种子胚诱导率、百胚植株诱导率和千粒种子植株诱导率存在显著地差异。百粒种子胚诱导率的变异幅度为4.0％-14.2％，平均为5.5％；百胚植株诱导率的变异幅度为1.4％-3.5％，平均为2.2％；千粒种子植株诱导率的变异幅度为0.6％-3.1％，平均为1.2％。果实发育期对百粒种子胚诱导率、百胚植株诱导率和千粒种子植株诱导率也有显著地影响。尽管5个星期百粒种子胚诱导率最高(8.3％)，2-4个星的期变异幅度为3.7％-7.1％，但5个星期的百胚植株诱导率却最低(0.5％)，2-4个星的期变异幅度为2.4％-3.4％；5个星期的千粒种子植株诱导率也最低(0.4％)，2-4个星的期变异幅度为1.1％-1.8％。

辐射花粉诱导单倍体方法操做烦琐，费时费力，效率较低，且再生频率较低。为了解决瓜类花药培养以及辐射花粉授粉获得单倍体诱导率低的问题，研究者尝试展开瓜类未受精子房离体培养研究，以建立高效的单倍体技术。在西葫芦(陈学军，邢国明，陈竹军.西葫芦未授粉胚珠离体培养与植株再生.浙江农业学报，2000，12(3)：165-167)、甜瓜(韩丽华.2004.厚皮甜瓜未受精胚珠离体培养技术[硕士论文].石家庄：河北农业大学)和黄瓜(杜胜利.2001.利用生物技术创造黄瓜育种新材料方法研究.天津科技，2：627)均已获得了单倍体，其中在黄瓜上已达到育种应用水平。但迄今为止，西瓜离体雌核发育诱导单倍体研究未见公开报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胚状体诱导培养基，可应用于西瓜未授粉的子房培养形成胚状体。

本发明提供的胚状体诱导培养基，是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：细胞分裂素、生长素、碳源和凝胶剂；

所述胚状体诱导培养基中细胞分裂素的终浓度是0.1-2mg/L，所述生长素的终浓度是0.1-1.5mg/L；

所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。

表1.MS基本培养液的溶质

进一步，上述胚状体诱导培养基中细胞分裂素和生长素的终浓度分别是如下1)或2)或3)：

1)细胞分裂素为0.1-1.5mg/L，生长素为0.1-1mg/L；

2)细胞分裂素为1.5-2mg/L，生长素为1-1.5mg/L；

3)细胞分裂素为1.5mg/L，生长素为1mg/L。

上述细胞分裂素具体可以是6-BA，上述生长素具体可以是2，4-D。

上述碳源优选是蔗糖，所述蔗糖在所述胚状体诱导培养基的终浓度是30g/L；所述凝胶剂优选是琼脂，所述琼脂在所述胚状体诱导培养基的终浓度是8g/L。

本发明的另一目的在于提供植物单倍体的生产方法。

本发明提供的植物单倍体的生产方法，包括如下的步骤：

1)将植物未授粉的子房置于任一上述的胚状体诱导培养基中培养，得到胚状体；

2)将步骤1)得到的胚状体置于丛生芽伸长培养基培养，得到丛生芽；

3)将步骤2)得到的丛生芽置于生根培养基中培养，得到单倍体的再生植株。

上述丛生芽伸长培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：6-BA、NAA、碳源和凝胶剂；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；所述丛生芽伸长培养基中6-BA和NAA的终浓度是如下1)或2)：

1)6-BA的终浓度是0.1-0.3mg/L，所述NAA的终浓度是0.01-0.1mg/L；

2)6-BA的终浓度是0.2mg/L，所述NAA的终浓度是0.05mg/L。

上述碳源优选是蔗糖，所述蔗糖在所述丛生芽伸长培养基的终浓度是30g/L；上述凝胶剂优选是琼脂，所述琼脂在所述丛生芽伸长培养基的终浓度是8g/L。

上述生根培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：IBA、碳源和凝胶剂；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；所述生根培养基中IBA的终浓度是0.25-1mg/L。

进一步，上述生根培养基中IBA的终浓度是0.5mg/L；所述碳源优选是蔗糖，所述蔗糖在所述生根培养基的终浓度是30g/L；所述凝胶剂优选是琼脂，所述琼脂在所述生根培养基的终浓度是8g/L。

上述植物可以是双子叶植物或单子叶植物，优选是葫芦科作物，更优选是西瓜(如京欣1号)。

实验证明：从上述胚状体诱导培养基中的11个子房切片中共找到了4个撑破珠被、体积膨大的胚状体。其中1个难以再生，最终没有得到再生植株；其它3个形成丛生芽R₁、R₂和R₃。采用本发明提供的植物单倍体的生产方法，利用流式细胞仪检测分析可知所有来源于R₂胚的再生植株的DNA相对含量在100附近，表明来源于R₂胚的所有再生植株的倍性为单倍体。证明了利用未授粉胚珠离体培养获得西瓜单倍体的方法是可行的，在西瓜花药与小孢子离体培养没有取得重大突破情况下，这无疑为西瓜单倍体育种开辟了一条新途径。

附图说明

图1为胚状体诱导形成照片。

图2为胚状体萌发形成丛生芽的照片。

图3为丛生芽伸长的照片。

图4为伸长的丛生芽生根的照片。

图5为流式细胞仪鉴定再生植株倍性图。

图6为SSR引物对亲本、F1及再生植株的扩增结果。

图7为获得单倍体植株的流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、单倍体植株的生产及其鉴定

一、单倍体植株的生产

操作过程如图7的流程图所示。

1.取样：取西瓜(京欣1号，北京京研益农科技发展中心)的开花前一天的未授粉子房。

2.表面消毒(在无菌操做台内)：

(1)用70％的酒精擦拭子房表面；

(2)用10％的NaClO溶液灭菌10分钟；

(3)无菌水冲洗3-4次；

(4)用无菌的镊子固定子房，用无菌的手术刀将子房横切成片，厚度0.5-1.0mm，准备接种。

3.胚状体诱导与萌发：

将步骤2得到的子房切片接种于胚状体诱导培养基，在25℃暗培养4天，然后在25℃下光照培养，培养条件：温度25℃；光强，光暗交替培养时间16h/8h)

其中，胚状体诱导培养基，是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：细胞分裂素(6-BA)、生长素(2，4-D)、蔗糖和琼脂；所述胚状体诱导培养基中6-BA的终浓度是1.5mg/L，所述2，4-D的终浓度是1mg/L；蔗糖30g/L，琼脂8g/L，所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。

培养结果的观察：含胚珠的胎座组织迅速生长，个别胚珠体积逐渐膨大，珠被颜色由接种时的淡黄色逐渐变为深绿色，说明在离体条件下西瓜雌核发育已经启动。接种后15天左右，胎座组织逐渐失绿、褐化，直至死亡；个别体积明显膨大的胚珠，其珠被组织可能经过木栓化过程而逐渐失绿、黄化，其生长发育似乎处于停滞状态，但随着培养时间的推移，黄化的珠被组织逐渐破裂，这是可能由于胚囊细胞不断生长发育而形成胚状体，随着胚状体体积的日益增大，最终撑破已黄化的珠被。露出珠被的胚状体的颜色由黄逐渐变绿，最终形成发育状态不同胚状体，结果如图1所示。从11个子房切片中共找到了4个撑破珠被、体积膨大的胚状体。其中1个难以再生，最终没有得到再生植株；其它3个形成丛生芽，结果如图2所示，分别将它们命名为R₁、R₂和R₃。

4.丛生芽伸长

为了促进丛生芽伸长，分别将步骤3中的R₁、R₂和R₃3个胚状体再生的丛生芽切割成小块，再转入到丛生芽伸长培养基，得到伸长的丛生芽。15天后再生植株株高长到2cm左右，结果如图3所示。

其中，丛生芽伸长培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的培养基：6-BA、NAA、蔗糖和琼脂；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；所述丛生芽伸长培养基中6-BA的终浓度是0.2mg/L，NAA的终浓度是0.05mg/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L。

5.根系诱导

将步骤4得到的伸长的丛生芽转入生根培养基促进生根，7d后长出主根，最终形成完整的再生植株，结果如图4所示。

其中，生根培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的培养基：IBA；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；所述生根培养基中IBA的终浓度是0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L。

二、再生植株的鉴定

1.再生植株的倍性鉴定

由于细胞核G1期的DNA含量反应一个细胞的倍性，因此常用DNA含量来估计细胞的倍性。流式细胞术(Flow Cytometry)是通过测定叶片单个细胞核内DNA含量，根据DNA含量的曲线图来推断细胞的倍性，从而快速鉴别植株的染色体倍性水平。流式细胞测定法特别是在离体培养过程中，试管中的芽或小植株很小和很嫩时，该方法仅用1cm²的样品就很容易鉴定其材料倍性，而且准确率高。其特点是制样简单，测试速度快，灵敏度、分辨率及准确性较高，所以流式细胞测定法特别适合于样品较多的倍性检测分析。

来源于3个胚状体R₁、R₂和R₃的再生植株随机各取5株，利用美国BD公司生产的BD FACSCalibur流式细胞仪对植株倍性进行鉴定。具体方法为：取大于1cm²的植株叶片，在55mm的小塑料培养皿中用锋利的剃须刀片切碎叶片，加入400ul的提取液(15mol/lTris-HCl(pH7.5)，80mol/lKCl，20mol/lNaCl，20mol/lEDTA-Na₂，15mol/l巯基乙醇，0.05％的Triton X-100。)放置1分钟，再用50um的微孔尼龙网过滤，滤液收集在上机测试用的标准试管中，然后于1000/min离心8分钟，弃去上清液，再加入1ml的PI(碘化丙啶)染色液，在黑暗低温处染色20分钟，在整个操作过程中，试管均应放在冰盒里(离心时除外)，之后就可上机检测。

结果如图5(图中A是对照西瓜的DNA相对含量(二倍体)；B是来自R₁胚的再生植株的DNA相对含量；C是来自R₂胚的再生植株的DNA相对含量；D来自R₃胚的再生植株的DNA相对含量)所示。从图5看出，二倍体对照的DNA相对含量在200附近，所有来源于R₁和R₃胚的再生植株的DNA相对含量也在200附近，表明来源于R₁和R₃胚的再生植株均为二倍体；所有来源于R₂胚的再生植株的DNA相对含量均如图5C所示在100附近，表明来源于R₂胚的再生植株的倍性为单倍体。

2.再生植株SSR标记的遗传分析(P₁：父本；P₂：母本；F₁：京欣1号)

在进行SSR标记分析之前，预期结果是：如果SSR引物扩增的带型与亲本之一的一致，再生植株应该是单倍体或双单倍体；如果SSR引物扩增的带型与F₁的一致，再生植株应该是珠被组织增生形成的二倍体。

利用160对SSR引物对供试杂交组合P₂/P₁的两个亲本P₁与P₂进行多态性分析，结果找到3对在亲本P₁与P₂间具有多态性的引物SSR₅₈、SSR₁₀₆和SSR₁₂₅。利用这3对引物对P₁、P₂、F₁以及倍性鉴定的15个再生植株的DNA进行PCR扩增，结果如图6和表2所示。

表2.SSR引物扩增结果的标记基因型

注：父本、母本、杂合体带型分别用a，b，h表示。

从图6和表2看出，对R₂胚的5个再生植株，3个引物扩增的带型与亲本之一的一致，这证实了倍性鉴定结果，因为倍性鉴定结果证明来源于R₂胚的5个再生植株为单倍体。

3个SSR引物对R₁和R₃胚诱导的再生植株扩增的带型与我们预期的完全不同。

对R₃胚的5个再生植株，引物SSR₅₈扩增的带型与亲本之一的一致，而引物SSR₁₀₆和SSR₁₂₅扩增的带型与F₁的一致。尤其是对R₁胚诱导的再生植株，3个引物扩增的带型不完全一致。

引物SSR₅₈在R₁1和R₁4上扩增的带型与P₂的一致，而在R₁2、R₁3和R₁5上扩增的带型与F₁的一致；引物SSR₁₀₆和SSR₁₂₅在R₁2、R₁3、R₁5上扩增的带型与亲本P₁的一致，而在R₁1、R₁4上扩增的带型与F₁的一致。而且对同一植株不同引物扩增的带型也不完全一致，有的引物扩增的带型与亲本之一的一致，而有的引物扩增的带型与F₁的一致。

结合SSR标记分析与倍性鉴定结果，认R₁和R₃胚诱导的再生植株可能为双单倍体。在离体培养过程，由胚囊单倍体细胞形成的R₁和R₃胚状体可能发生自然加倍而形成双单倍体，因为存在SSR引物对R₁和R₃胚诱导的再生植株扩增的带型与亲本之一的一致的情况。然而，同时存在SSR引物对R₁和R₃胚诱导的再生植株扩增的带型却与F₁的一致的情况，后一种情况可能是由于在胚囊单倍体细胞形成之前发生不等交换形成2n配子所造成的。但至今不清楚的是为什么源于同一个胚的再生植株SSR标记遗传分析结果同时存在上述两种结果。因此，R₁和R₃胚诱导的再生植株是否是双单倍体还有待于通过对其自交后代进行SSR标记和形态标记性状的遗传分析来确定。

尽管如此，初步研究结果证明了利用未授粉胚珠离体培养获得西瓜单倍体的方法是可行的，在西瓜花药与小孢子离体培养没有取得重大突破情况下，这无疑为西瓜单倍体育种开辟了一条新途径。

Claims

1.植物单倍体的生产方法，包括如下的步骤：

1）将植物未授粉的子房置于胚状体诱导培养基中培养，得到胚状体；

2）将步骤1）得到的胚状体置于丛生芽伸长培养基培养，得到丛生芽；

3）将步骤2）得到的丛生芽置于生根培养基中培养，得到单倍体的再生植株；

所述胚状体诱导培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：细胞分裂素6-BA、生长素2,4-D、碳源和凝胶剂，其中，所述胚状体诱导培养基中细胞分裂素6-BA的终浓度是0.1-2mg/L，所述生长素2,4-D的终浓度是0.1-1.5mg/L；

所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如下：NH₄NO₃1.650 g·L^-1、KNO₃1.900 g·L^-1、CaCl₂. 2H₂O 0.440g·L^-1、MgSO₄. 7H₂O 0.370g·L^-1、KH₂PO₄0.170g·L^-1、KI 0.83 mg·L^-1、H₃BO₃6.2 mg·L^-1、MnSO₄.4H₂O 22.3 mg·L^-1、ZnSO₄.7H₂O 8.6 mg·L^-1、Na₂MoO₄.2H₂O 0.25 mg·L^-1、CuSO₄.5H₂O 0.025 mg·L^-1、CoCl₂.6H₂O 0.025 mg·L^-1、肌醇 100 mg·L^-1、Vb5 0.5mg·L^-1、Vb6 0.5mg·L^-1、Vb1 0.1 mg·L^-1、甘氨酸 2mg·L^-1；

所述植物为西瓜。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述6-BA的终浓度是1.5mg/L，所述2,4-D的终浓度是1mg/L。

3、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述碳源是蔗糖，所述蔗糖在所述胚状体诱导培养基的终浓度是30g/L；所述凝胶剂是琼脂，所述琼脂在所述胚状体诱导培养基的终浓度是8 g/L。

4、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述丛生芽伸长培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：6-BA、NAA、碳源和凝胶剂；所述丛生芽伸长培养基中， 6-BA的终浓度是0.1-0.3 mg/L，所述NAA的终浓度是0.01-0.1 mg/L；

所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如下：NH₄NO₃1.650 g·L^-1、KNO₃1.900 g·L^-1、CaCl₂. 2H₂O 0.440g·L^-1、MgSO₄. 7H₂O 0.370g·L^-1、KH₂PO₄0.170g·L^-1、KI 0.83 mg·L^-1、H₃BO₃6.2 mg·L^-1、MnSO₄.4H₂O 22.3 mg·L^-1、ZnSO₄.7H₂O 8.6 mg·L^-1、Na₂MoO₄.2H₂O 0.25 mg·L^-1、CuSO₄.5H₂O 0.025 mg·L^-1、CoCl₂.6H₂O 0.025 mg·L^-1、肌醇 100 mg·L^-1、Vb5 0.5mg·L^-1、Vb6 0.5mg·L^-1、Vb1 0.1 mg·L^-1、甘氨酸 2mg·L^-1。

5、如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述6-BA的终浓度是0.2 mg/L，所述NAA的终浓度是0.05 mg/L。

6、如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述碳源是蔗糖，所述蔗糖在所述丛生芽伸长培养基的终浓度是30g/L；所述凝胶剂是琼脂，所述琼脂在所述丛生芽伸长培养基的终浓度是8 g/L。

7、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述生根培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：IBA、碳源和凝胶剂；所述生根培养基中IBA的终浓度是0.25-1 mg/L；

8、如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述生根培养基中IBA的终浓度是0.5 mg/L；所述碳源是蔗糖，所述蔗糖在所述生根培养基的终浓度是30g/L；所述凝胶剂是琼脂，所述琼脂在所述生根培养基的终浓度是8 g/L。