CN111837948B - 利用西瓜未授粉子房培养获得双单倍体植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于西瓜培育技术领域，公开了一种利用西瓜未授粉子房培养获得双单倍体植株的方法，包括以下步骤：将西瓜杂交种定植于田间，植株开花前1天对雌花套帽，开花当天采集植株未授粉子房存于冰盒；挑选出正常雌花的健壮子房，去掉果柄、花瓣和绒毛，冲洗，酒精浸泡未授粉子房，去皮，切片，次氯酸钠消毒，用无菌水冲洗；将薄片接种在诱导培养基上，热激诱导并培养得到再生材料，将再生材料接种在生根培养基上，得到组培苗；开瓶锻炼，多菌灵处理组培苗根系，将组培苗定植于营养钵中进行驯化移栽。本发明可不经过秋水仙碱等方法，直接加倍成二倍体，解决了通过未授粉子房培养获得西瓜双单倍体诱导率低，加倍困难，移栽成活率低的问题。

Description

利用西瓜未授粉子房培养获得双单倍体植株的方法

技术领域

本发明属于西瓜培育技术领域，涉及一种利用西瓜未授粉子房培养获得双单倍体植株的方法。

背景技术

西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.et Nakai)为一年生草本植物，雌雄同株，异花，有夏瓜、水瓜、寒瓜等别名，因果实清甜多汁、解渴消暑等特点成为夏季主要水果之一，也是世界十大水果之一。具有丰富的营养价值和广泛用途，除用作水果鲜食外，西瓜常被用作果汁、果酒、中药、园艺观赏、家畜饲料等，是一种用途广泛的农作物。

我国的西瓜育种从上世纪50年代，由最初的农家品种即常规品种，发展经历了常规品种到杂交1代品种。目前西瓜生产上98％以上的品种为杂交一代即F₁。F₁代品种的选育，首先需要合适的亲本即纯合自交系。目前，自交系的获得一般采用常规育种手段，通过人工连续自交、回交、复合杂交等获得纯合亲本，通常需要经过6代以上的连续自交，才能够获得稳定遗传的自交系，筛选所需时间较长，费时费力，大大限制了新品种的选育速度，已满足不了现代育种及市场的要求。而通过未授粉子房培养，可在1-2年获得纯合二倍体(DoubledHaploid Breeding，DH)，加快自交系的选育速度，进而加快新品种选育进程。

目前西瓜主要也是通过未授粉子房培养获得单倍体，国内外学者也进行了许多研究，但主要是诱导出胚状体和再生植株，经自然加倍或者秋水仙素加倍成纯合双单倍体，经过筛选可以直接作为亲本材料。而由于影响西瓜未授粉子房培养成功的因素众多，存在诱导体系不稳定、诱导率低，加倍困难等原因，至今未见在西瓜育种中应用的报道(如李迎迎.西瓜未授粉子房离体培养技术的研究[D].郑州：河南农业大学,2017)(如李玲,成娟,孙小武,等.西瓜未受精胚珠的离体培养[J].中国瓜菜,2014,27(增刊):34-37)(如荣文娟.西瓜未受精胚珠离体培养研究[D].北京：中国农业科学院,2015)。因此，需要以不同基因型的西瓜为试材，对西瓜未授粉子房不同影响因素、驯化移栽条件等进行研究，构建西瓜双单倍体培养技术体系，对加快西瓜未授粉子房培养在西瓜育种上的应用，具有重要的理论和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用西瓜未授粉子房培养获得双单倍体植株的方法，解决了通过未授粉子房培养获得西瓜双单倍体诱导率低，加倍困难，移栽成活率低的问题，并得到再生植株，达到在实际育种中应用的目的。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种利用西瓜未授粉子房培养获得双单倍体植株的方法，包括以下步骤：

步骤a：将西瓜杂交种定植于田间，植株开花前1天对雌花套帽，开花当天采集植株未授粉子房存于冰盒；

步骤b：挑选出正常雌花的健壮子房，去掉果柄、花瓣和绒毛，在流水下冲洗30min，在超净工作台上用75％的酒精浸泡未授粉子房30s，随后用清水冲洗3遍，放在滤纸上吸干水分，去皮，将子房切成厚度为0.5～1.0mm的薄片，用8.0％次氯酸钠消毒20min后，用无菌水冲洗4-5遍；

步骤c：将薄片接种在诱导培养基上，37℃黑暗热激诱导3天，之后在25℃诱导培养得到再生材料，将再生材料接种在生根培养基上培养10天，得到组培苗。

步骤d：开瓶锻炼6天，用0.1％多菌灵处理组培苗根系2min，将组培苗定植于营养钵中进行驯化移栽。

优选地，所述西瓜杂交种为‘郑抗10号’或‘中科6号’或‘野生128×HQ-2’。

优选地，在步骤a中开花当天采集植株第5或第6节位的未授粉子房存于冰盒。

优选地，在步骤b中将子房切成厚度为0.7～1.0mm的薄片。

优选地，所述诱导培养基为MS培养基+0.03mg·L^-1噻苯隆TDZ+2.0mg·L^-1激动素KT+30mg·L^-1AgNO₃+30g·L^-1蔗糖+6g·L^-1琼脂。

优选地，所述生根培养基为MS培养基+0.5mg·L^-1IBA+30g·L^-1蔗糖+6g·L^-1琼脂。

优选地，所述营养钵中基质为质量比为2：1的草炭和沙土。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明通过对西瓜未授粉子房影响因素的研究，获得了通过西瓜未授粉子房培养双单倍体的技术体系，该体系可不经过秋水仙碱等方法，直接加倍成二倍体(纯合双单倍体再生率为87.5％)，解决了通过未授粉子房培养获得西瓜双单倍体诱导率低，加倍困难，移栽成活率低的问题，并得到再生植株，达到在实际育种中应用的目的；通过表型鉴定即可区分材料倍性和纯合性，不需要再耗费过多时间、费用来检测倍性和纯合性；本发明方法可适用于部分不同的基因型，不同基因型间胚诱导率为6.67％-23.33％，对基因型影响西瓜未授粉子房培养出胚率有一定指导意义。

附图说明

图1为不同消毒种类及时间对西瓜未授粉子房胚珠膨大的影响。

图2为不同消毒种类及时间对西瓜未授粉子房胚珠膨大的表型影响，其中a、c：20.0％次氯酸钠消毒；b、d：8.0％次氯酸钠消毒20min；e：8.0％次氯酸钠消毒25min；f：氯化汞消毒。

图3为不同切片厚度对西瓜未授粉子房胚珠膨大的影响。

图4为不同切片厚度对西瓜未授粉子房胚珠膨大的表型影响，其中a：0.7-1.0mm；b：0.5-0.7mm；c：切片厚度1-1.5mm；d：3种切片厚度在同一培养基。

图5为不同热激处理温度及时间对对西瓜未授粉子房胚珠膨大的影响。

图6为TDZ对西瓜未授粉子房膨大及出胚的影响。

图7为KT对西瓜未授粉子房胚珠膨大及出胚的影响。

图8为AgNO₃对西瓜未授粉子房胚珠膨大及出胚的影响。

图9为不同基因型对西瓜未授粉子房胚珠膨大及出胚的影响。

图10为不同IBA浓度及培养天数对组培苗生根的影响。

图11为再生植株根尖染色体鉴定结果。

图12为再生植株流式细胞仪倍性检测结果。

图13为单倍体和二倍体叶片大小比较。

图14为单倍体和二倍体花蕾和花瓣大小比较。

图15为单倍体和二倍体田间图片。

图16为8对特异性引物SSR检测结果。

图17为‘野生128×HQ-2’和再生植株果实外观比较。

图18为‘野生128×HQ-2’和再生植株种子形状大小色泽比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

本发明采用Office和OriginPro 9.1进行数据统计及作图。

胚珠膨大率＝每皿膨大数大于等于5的片数/接种总片数×100％。

出胚率＝出胚数量/接种总片数×100％。

实施例一

1.1试验材料

以‘郑抗10号’、‘中科6号’和‘野生128×HQ-2’3个杂交种为试验材料，‘野生128×HQ-2’为野生材料和自交系材料杂交。上述3个杂交种种子来自中国农业科学院郑州果树研究所，材料特性详见表1。

表1材料特性

材料名称	材料特性
		郑抗10号	花皮椭圆果、中熟、大红瓤、大果型
中科6号	花皮圆果、早熟、红瓤、中果型
		野生128×HQ-2	浅绿皮圆果、晚熟、中大果型

1.2试验方法及结果

将杂交种分别于2016、2017、2018年春季定植于中国农业科学院新乡实验基地内，正常田间栽培管理，开花前1天下午对雌花进行套帽，早上8点左右采集雌花，并用冰盒带回。在实验室对材料进行挑选，留当天开放正常雌花，去除两性花，挑选正常雌花的健壮子房，备用。弃掉弱小及畸形子房。

1.2.1消毒种类及消毒时间对西瓜未授粉子房胚珠膨大的影响

外植体的带菌状况通常包括细菌、霉菌和病毒。组织培养成败关键步骤是外植体的消毒处理，对外植体采取有效的消毒处理措施是组织培养中基础而关键的一步，严重影响外植体材料在无菌环境条件下的再生和生长。

本发明以‘郑抗10号’和‘中科6号’为试材，取未授粉的子房，去掉果柄、花瓣和绒毛，在流水下冲洗30min，在超净工作台上用75％的酒精浸泡子房30s，随后用清水冲洗3遍，放在滤纸上吸干水分。然后去皮，切片。分别次氯酸钠(NaClO)和氯化汞(HgCl₂)消毒，详细处理见下表2。消毒后用无菌水冲洗4-5遍。将薄片分别接种于1号诱导培养基(MS培养基+0.03mg·L^-1噻苯隆TDZ+2.0mg·L^-1激动素KT+20mg·L^-1AgNO₃+30g·L^-1蔗糖+6g·L^-1琼脂)和3号诱导培养基(MS培养基+0.03mg·L^-1噻苯隆TDZ+20mg·L^-1AgNO₃+30g·L^-1蔗糖+6g·L^-1琼脂)上，37℃黑暗热激诱导3天，之后在25℃条件下培养得到再生材料。每皿10片，每个处理5皿，重复3次，统计西瓜未授粉子房胚珠膨大率。结果如图1和图2所示。

表2不同消毒方法及消毒时间

供试2个西瓜品种，在2种诱导培养基上，9个处理上均无污染情况发生。由图1-a看出，‘郑抗10号’在1号诱导培养基上，NaClO浓度为8.0％，消毒22.5min胚珠膨大率高于消毒20min，高出5.34％，但两者间无显著差异；消毒22.5min胚珠膨大率也高于消毒25min，高出8.7％，但两者间差异不显著。NaClO浓度为8.0％而消毒不同时间，整体胚珠膨大率显著高于NaClO浓度为20.0％和0.1％HgCl2的6个处理，且达到差异显著水平。由图1-b得出，‘郑抗10号’在3号诱导培养基上，8.0％NaClO分别消毒20min、22.5min和25min的胚珠膨大率有所不同，但3个处理间差异不显著，且3个处理的胚珠膨大率显著高于其它6个处理。‘郑抗10号’在2种诱导培养基上，胚珠膨大率由高到低顺序均为：8.0％NaClO消毒22.5min>8.0％NaClO消毒20min>8.0％NaClO消毒25min>20.0％NaClO消毒10min>20.0％NaClO消毒12min>20.0％NaClO消毒14min，表明同一品种在不同培养基上消毒处理的结果具有相似性，且NaClO浓度为8.0％时，消毒效果较20.0％好。

由图1-c、1-d得出，‘中科6号’在1号和3号诱导培养基上，胚珠膨大率同‘郑抗10号’在这两个培养基上相比，相同处理下，‘中科2号’的胚珠膨大率均较‘郑抗10号’低，但两者在不同处理中，整体趋势相同。

供试2个品种，接种在2个不同诱导培养基上，用0.1％HgCl₂分别消毒不同时间，胚珠膨大率均为0。由此得出0.1％HgCl₂不适合西瓜未授粉子房的消毒。

从次氯酸钠不同浓度不同消毒时间的胚珠膨大率情况看出，NaClO浓度较低(8.0％)时较20.0％胚珠膨大率高，因此，NaClO最适浓度为8.0％；8.0％NaClO消毒22.5min的胚珠膨大率较高，但和20min时无显著差异，和消毒25min时相比，较高差异不显著。由图1整体看出，消毒25min胚珠膨大率在下降。不同处理的表型影响如图2所示。

1.2.2不同切片厚度对西瓜未授粉子房胚珠膨大的影响

关于子房片厚度对西瓜未授粉子房培养的影响研究较少，根据植物的不同，一般试验中所用子房片厚度也不同。

本发明以‘郑抗10号’和‘中科6号’为试材，将子房分别切成0.5-0.7mm、0.7-1.0mm、1.0-1.5mm薄片，用8.0％次氯酸钠消毒20min后，用无菌水冲洗4-5遍。按不同切片厚度分别接种在1号诱导培养基和3号诱导培养基上。其他过程同1.2.1。每皿10片，每个处理5皿，重复3次，统计西瓜未授粉子房胚珠膨大率。结果如图3和图4所示。

由图3可看出，‘郑抗10号’在1号、3号诱导培养基上和‘中科6号’在1号诱导培养基上，胚珠膨大率均表现为相同趋势，均为切片厚度0.7-1.0mm时胚珠膨大率均显著大于切片厚度0.5-0.7mm和1-1.5mm 2个处理；‘中科6号’在3号诱导培养基上，切片厚度为0.7-1.0mm时的胚珠膨大率显著大于切片厚度1-1.5mm，但与切片厚度为0.5-0.7mm的处理间差异不显著。由图3整体看出，胚珠膨大率由高到低顺序为：0.7-1.0mm>0.5-0.7mm>1-1.5mm。因此，子房切片厚度为0.7-1.0mm时为最佳子房切片厚度。不同切片厚度的表型影响如图4所示。

1.2.3不同取材部位对西瓜未授粉子房胚珠膨大及出胚的影响

不同取材部位和不同生长环境对离体雌核培养单倍体和双单倍体影响比较相似，主要还是因为影响了未受精胚珠的发育状态。

本发明以‘郑抗10号’、‘中科6号’和‘野生128×HQ-2’3个不同基因型材料为试材，取第2、3节位雌花和4、5、6节位雌花，子房切片后分别接种在1号诱导培养基和3号诱导培养基上。其他过程同1.2.1。每皿10片，每个处理5皿，重复3次，统计西瓜未授粉子房胚珠膨大率及胚状体出胚率。结果如表3和表4所示。

表3不同品种不同取材部位在1号诱导培养基上的胚珠膨大率和出胚率情况

表4不同品种不同取材部位在3号诱导培养基上的胚珠膨大和出胚情况

由表3和表4得出，‘郑抗10号’在1号诱导培养基上，第2、3、4节位和5、6节位雌花胚珠膨大率相同，但第2、3、4节位未授粉子房培养出胚率为0，而5、6节位出胚率为23.33％；在3号诱导培养基上，第2、3、4节位和5、6节位雌花胚珠膨大率稍有不同，5、6节位雌花胚珠膨大率比2、3、4节位高1.23％，2、3、4节位雌花出胚率为0，5、6节位雌花出胚率为6.67％。郑抗10号’在取5、6节位雌花时，胚珠膨大率及出胚率均较高。

‘中科6号’在1号诱导培养基上第2、3、4节位和5、6节位雌花胚珠膨大率相同，均为55.33％，在3号诱导培养基上基本均为34.00％，在2种不同诱导培养基上，不同节位雌花胚珠膨大率无差异。但在胚诱导率上，第5、6节位雌花可以诱导出胚状体，最高可达到13.33％。但第2、3、4节位雌花均无胚状体发生。

‘野生128×HQ-2’在1号诱导培养基上，第2、3、4节位和5、6节位雌花胚珠膨大率基本相同分别为59.33％和60.00％，仅相差0.67％；在3号诱导培养基上，第2、3、4节位雌花胚珠膨大率比5、6节位高出3.33％。在1号和3号诱导培养基上，第2、3、4节位雌花出胚率均为0，5、6节位雌花出胚率分别为13.33％和23.33％。

3个品种在不同诱导培养基上，不同节位雌花胚珠膨大率差异较小，最高为60.00％，最低为32.00％。3个品种在1号诱导培养基上的胚珠膨大率均较3号高，5、6节位雌花均有胚状体发生，而取2、3、4节位雌花去除‘野生128×HQ-2’胚诱导率为6.67％，其它均无胚状体发生。因此，5、6节位雌花为最佳取材部位，即取材时取后期雌花。

1.2.4热激条件对西瓜未授粉子房胚珠膨大的影响

热激处理利于启动雌核发育，可以有效地改变外植体细胞的生理状态从而达到培养目的。同一作物不同品种，未授粉子房培养诱导效果较佳时，所需热激温度基本相同，但培养天数略有变化。

本发明热激温度设置25℃、35℃、37℃、39℃4个处理。其它过程如1.2.1。每皿10片，每个处理5皿，重复3次，统计培养第2、3和4天统计西瓜未授粉子房胚珠膨大率。结果如图5所示。

由图5-a看出，‘郑抗10号’在1号诱导培养基上，热激处理第二天时，培养温度为37℃的胚珠膨大率显著高于常温对照及39℃热激处理，但与35℃热激处理之间无显著差异，常温处理胚珠膨大率最低，仅为25.3％。热激处理第三天胚珠膨大率与第二天相比，胚珠膨大率整体均有提高，并且两天的趋势相同，均为37℃热激处理的胚珠膨大率最高，但与35℃相比，差异不显著；并且35℃的胚珠膨大率和39℃相比，差异也不显著，和常温25℃相比时差异显著。热激处理第四天胚珠膨大率较前两天有所提高，37℃热激处理的胚珠膨大率仍为最高，达到77.33％，整体趋势同第三天。因此，‘郑抗10号’在1号诱导培养基上，最适培养温度为37℃，培养时间为3天和4天。

由图5-b得出，‘郑抗10号’在3号诱导培养基上，热激处理第二天时，35℃、37℃和39℃3个热激处理胚珠膨大率均显著高于常温(25℃)对照，37℃胚珠膨大率最高，3个热激处理间无显著差异。热激处理第三天时，37℃热激处理胚珠膨大率显著高于其它3个处理，35℃和39℃2个热激处理间无显著差异，均显著高于25℃对照。热激处理第四天胚珠膨大率同热激处理第三天趋势，且两天相比，无显著差异。因此，郑抗10号在3号诱导培养基上，最适培养温度为37℃，培养时间为3天和4天。

由图5-c得出，‘中科6号’在1号诱导培养基上，热激处理第二天时，3个热激处理胚珠膨大率均显著高于常温对照，37℃胚珠膨大率最高，且3个热激处理间无显著差异；热激处理第三、四天时，趋势同第二天，整体，胚珠膨大率为顺序为热激处理第四天>第三天>第二天，处理4天与处理3天相比，稍有增高，但无显著差异。因此，‘中科6号’在1号诱导培养基上，最适培养温度为37℃，培养时间为3天和4天。

由图5-d得出，‘中科6号’在3号诱导培养基上，热激处理第二天时，培养温度为37℃的胚珠膨大率显著高于常温对照及39℃热激处理，但与35℃热激处理之间差异不显著；热激处理第三、四天时，37℃胚珠膨大率均最高，显著高于其它3个处理，且第四天时达到最大值48.67％，同在培养基1上趋势相同，处理4天与处理3天相比，稍有增高，但无显著差异。因此，‘中科6号’在3号诱导培养基上，最适培养温度为37℃，培养时间为3天和4天。

综合得出，最适热激培养温度为37℃。对37℃热激处理培养不同天数做差异分析，热激培养3天和4天间无显著差异，说明在37℃培养3天时，基本已达到最佳诱导效果，因此，确定最佳热激处理温度为37℃，最佳培养天数为3天。

1.2.5不同添加物质对西瓜未授粉子房胚珠膨大及出胚的影响

TDZ、NAA、2,4-D，6-BA等植物生长调节剂在单倍体培养中有很多报道，几乎是促进胚状体发育的。

AgNO₃作为乙烯抑制剂，已成功用于植物组织培养中。许多研究表明添加低浓度AgNO₃可以促进胚状体的发生。例如，2009年刁卫平等证明10mg·L^-1AgNO₃可以缩短黄瓜未授粉子房培养过程中出胚时间，并且增加胚的产出量，在诱导培养基中添加AgNO₃可以使胚快速转绿。2013年，Jian-wu Li等的研究也表明添加5.0-10.0mg·L^-1AgNO₃促进胚状体的发生。Plapung等研究发现添加5.0mg·L^-1AgNO₃促进胚状体发生。

本发明以‘郑抗10号’为试验材料，分别研究在诱导培养基中添加物TDZ、AgNO₃、KT对西瓜未授粉子房胚珠膨大及出胚率的影响。AgNO₃设置5(0、10、20、30、40mg·L^-1)个处理；TDZ设置5(0、0.01、0.02、0.03、0.04mg·L^-1)个处理；KT设置4(0、1、2、3mg·L^-1)个处理。其它过程如1.2.1。每皿10片，每个处理5皿，重复3次，统计西瓜未授粉子房胚珠膨大率及胚状体出胚率。结果如图6-图8所示。

由图6-a得出，当TDZ添加浓度为0.03mg·L^-1时，胚珠膨大率高于其它4个处理，其中，与TDZ添加浓度为0.04mg·L^-1胚珠膨大率差异不显著，与其它3个处理间达差异显著水平，而未添加TDZ处理，和TDZ浓度分别为0.01mg·L^-1和0.02mg·L^-1 3个处理间胚珠膨大率无显著差异。由图6-b看出，当TDZ添加浓度为0.03mg·L^-1时，出胚率为6.67％，其它处理出胚率均为0，显著高于其它4个处理，达差异显著水平。综合得出，培养基中TDZ添加浓度为0.03mg·L^-1为最适浓度。

由图7-a得出，诱导培养基中添加KT处理的胚珠膨大率显著高于未添加KT处理，在添加1.0mg·L^-1、2.0mg·L^-1和3.0mg·L^-1不同浓度KT的3个处理间无显著差异，最高胚珠膨大率为56.00％。由图7-b得出，KT浓度为2.0mg·L^-1时，出胚率显著高于其它3各处理，其它3个处理间无显著差异，当KT添加浓度为1.0mg·L^-1无胚状体发生，当KT浓度为2.0mg·L^-1时，最高出胚率为13.33％。因此，结合胚珠膨大率和出胚情况，不添加KT和KT添加浓度为2.0mg·L^-1时，均达到较好的诱导效果。

由图8-a看出，当AgNO₃的添加浓度为30.0mg·L^-1时，胚珠膨大率最高，达到33.33％，与添加10.0mg·L^-1AgNO₃胚珠膨大率之间无显著差异，与添加浓度为20.0mg·L^-1和40mg·L^-1时胚珠膨大率差异不显著，但显著高于未添加AgNO₃处理，高出11.2％。由图8-b看出，AgNO₃的添加浓度为30.0mg·L^-1时，胚诱导率达到6.7％，其它4个处理出胚率均为0，达到差异显著水平。因此，最适AgNO₃的添加浓度为30.0mg·L^-1，不同于技术人员对添加低浓度AgNO₃(小于10mg·L^-1)可以促进胚状体的发生的认知，这可能和不同作物对AgNO₃的响应机制不同。不同离体培养过程中，NO₃ ^-1可以影响某些激素物质的代谢，从而影响了胚状体的发生。

综上，诱导培养基组分优选MS培养基+0.03mg·L^-1噻苯隆TDZ+2.0mg·L^-1激动素KT+30mg·L^-1AgNO₃+30g·L^-1蔗糖+6g·L^-1琼脂。

1.2.6不同基因型对西瓜未授粉子房胚珠膨大及出胚的影响

供体植株的基因型是影响离体雌核培养成功的最重要因素之一。

本发明以‘郑抗10号’、‘中科6号’和‘野生128×HQ-2’3个不同基因型材料为试材，分别接种在1号诱导培养基和3号诱导培养基上。其它过程如1.2.1，统计西瓜未授粉子房胚珠膨大率及胚状体出胚率。结果如图9所示。

由图9-a得出，3个供试品种，在1号和3号诱导培养基上，胚珠膨大率由高到低顺序基本为：‘野生128×HQ-2’＞‘中科6号’≥‘郑抗10号’，但3个品种间均无显著差异。图9-b得出，在1号诱导培养基上，‘郑抗10号’出胚率高于‘野生128×HQ-2’和‘中科6号’，但三者间无显著差异；在3号诱导培养基上，‘野生128×HQ-2’出胚率最高为23.3％，显著高于其它2个品种。因此，在同一培养基条件下，不同品种胚珠膨大率和出胚率有差异，但因培养基的不同，差异不同；在不同培养基条件下，同一品种胚珠膨大率和出胚率也有差异。由图9得出，不同品种间在1号诱导培养基上胚珠膨大率和出胚率均相似，无显著差异。

1.2.7不同IBA添加浓度及培养天数对组培苗生根的影响

以1.2.1再生材料为试验材料，将再生材料接种在生根培养基(MS培养基+30g·L^-1蔗糖+6g·L^-1琼脂)，研究在生根培养基中添加不同浓度IBA(0.1、0.3、0.5、0.7mg·L^-1)及培养天数对再生植株生根的影响，分别在第7天和第10天统计生根数目。结果如图10所示。

由图10-a得出，在第7天时，IBA浓度为0.5mg·L^-1，生根数最多，为9.7根，其它处理生根数目均较少，最少的是添加0.1mg·L^-1IBA，生根数目为0。由图10-b得出，在第10天时，IBA浓度为0.5mg·L^-1时，生根数最多，为13.5根，不同处理生根数目趋势同第7天，由多到少顺序为：0.5mg·L^-1>0.7mg·L^-1>0.3mg·L^-1>0.1mg·L^-1。因此，最佳IBA添加浓度为0.5mg·L^-1，最佳培养时间10天。

1.2.8倍性检测

1.2.8.1根尖染色体鉴定

(1)取材：当再生植株根长至1-2cm时取根尖进行预处理，选取正常二倍体植株根尖作为对照。

(2)预处理：用无菌水浸泡根尖放置4℃预处理24h。

(3)固定：预处理后用无菌水冲洗，再用固定液固定12h-24h。

(4)解离：将固定后的根尖用无菌水漂洗多次，然后将其投入到预热好的l mg·L^-1的HCl溶液中，60℃水浴解离9min左右。

(5)洗净：将解离后的根尖放入无菌水中冲洗干净。

(6)染色：将漂洗干净的根尖放在改良品红溶液中染色15min，使根尖细胞中的染色体着色。

(7)制片和镜检。将染色后的根尖，置于洁净载玻片上，滴45％醋酸溶液，盖上盖玻片。压好片后，显微镜下拍照，并统计染色体数。

再生植株根尖染色体鉴定结果如图11所示，其中图11-a为供体植株染色体鉴定结果，染色体条数为22条；图11-b为再生二倍体植株，染色体条数为22条；图11-c为再生单倍体植株，染色体条数为11条。

1.2.8.2流式细胞仪检测

(1)取待测再生植株和供体植株，新鲜嫩叶片0.5cm²，置于培养皿中。

(2)取400μL裂解液加在叶片。

(3)用刀片将叶片切碎。

(4)向切碎的植物叶片中加入染液1600μL，染色1min。

(5)裂解萃取1min。

(6)将液体用30um滤网过滤至样品管中，上机检测。

再生植株流式细胞仪倍性检测结果如图12所示，其中图12-a为对照二倍体植株检测结果，峰值基本在100；图12-b、12-c为再生单倍体植株检测结果，峰值基本在50；图12-d为再生单倍体和二倍体嵌合体植株检测结果，峰值基本在50和100；图12-e为再生二倍体植株检测结果，峰值基本在100；图12-f为对照四倍体植株检测结果，峰值基本在200。

1.2.8.3直接观察法比较单倍体植株和二倍体植株叶片大小、花蕾、花瓣大小等，并分别统计。单倍体和二倍体叶片大小比较如图13所示，单倍体和二倍体花蕾和花瓣大小比较如图14所示。

从图13-a,b,c明显看到，单倍体整体较小，缺刻较浅。从图14-a,b,c,d可以看到，单倍体和二倍体花蕾和花瓣明显不同，单倍体的花蕾和花瓣(图14-b,c)与二倍体(14-a,d)相比减小；单倍体植株无花粉，二倍体植株有花粉。

单倍体和二倍体主要性状数据见表5。可以得出，单倍体和二倍体之间在叶片长宽、茎粗细、叶柄粗细长短和花瓣大小上均有差异。可以明显区别出单倍体植株和二倍体植株。单倍体和二倍体田间图片如图15所示。

表5单倍体和二倍体农艺性状比较

农艺性状	二倍体	单倍体
			叶长(cm)	14.7**	6.2
叶宽(cm)	14.5**	5.6
			茎粗(mm)	5.6*	3.1
叶柄长(cm)	7.4**	2.3
			叶柄粗(mm)	3.3*	1.8
花瓣长(mm)	16.3**	7.4
			花瓣宽(mm)	12.3**	6.2

注：图中“*”表示在0.05水平上差异显著性；图中“**”表示在0.01水平上差异显著性。

通过3种检测方法得出，采用田间表型鉴定即可完全区分出单倍体和二倍体，此种方法方便、快捷，准确。

1.2.9纯合性检测

取新鲜嫩叶，液氮迅速冷冻。保存于-80℃超低温冰箱。提取DNA时用冷冻研磨仪研成粉末(约50-100mg)，使用CTAB法提取DNA。DNA样品-20℃保存。

PCR过程如下：

成分	体积
		稀释的DNA、cDNA模板	1μL
正向引物(10μM)	0.5μL
		反向引物(10μM)	0.5μL
2×PCR mix	5μL
		ddH<sub>2</sub>O	3μL
总体积	10μL

8％聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色。

银染的基本步骤是：

(1)水洗。

(2)渗透：0.5gAgNO₃，500ml蒸馏水摇床8min。

(3)渗透液倒掉，蒸馏水水洗。

(4)蒸馏水倒掉。

(5)显色：8gNaOH，500ml蒸馏水，4ml甲醛摇床至条带显色。

(6)倒掉显色液加终止液3gNa₂CO₃，500mL蒸馏水。

(7)记录并照相。

从110对核心引物中筛选出8对有特异性的引物，如表6所示，分别位于不同的染色体上。SSR检测结果如图16所示。再生二倍体植株和亲本之一条带一致，为纯合二倍体。

表6 8对特异性引物

试验共得到再生植株64份，其中单倍体4株，单倍体和二倍体的嵌合体1株，四倍体1株，二倍体58株，二倍体经检测有56株为纯合材料，因此，纯合双单倍体再生率为87.5％。纯合性检测结果也可通过田间检测，直观、准确，耗资低。

1.2.10开瓶时间对移栽成活的影响

组培苗生长在玻璃瓶内，生长环境是处于恒温恒湿状态，湿度高，光照弱，叶、茎上的角质层很薄，表皮组织不发达，气孔调节能力弱，保水能力差，主要依赖培养基提供养分、水分等，根系不发达，所以移栽前需将组培瓶苗从培养室内转移到温室内，进行移栽前的驯化。首先要进行开瓶炼苗，使组培苗逐渐适应外界环境，使组培苗茎叶保护组织和气孔功能恢复，并提高根系活力，增强根系吸收能力。

本发明将组培苗分别开瓶适应性锻炼0、3、6、9天，将组培苗定植于营养钵中进行驯化移栽。每组试验5株，重复3次。分别于移栽后20天统计成活率。结果如表7所示。

表7开瓶时间对再生植株移栽成活的影响

开瓶时间(天)	成活数(株)	成活率(％)
			0	1	6.7b
3	7	43.3ab
			6	13	86.7a
9	5	33.3ab

由表7看出，西瓜组培苗直接开瓶定植的成活率低，15株苗子仅成活1株。随着开瓶时间的延长，成活率逐渐上升，在6天时达到最高，为86.7％，但开瓶时间延长到9天时，成活率下降，仅为33.3％。表明西瓜组培苗开瓶锻炼6天较适于驯化移栽。

1.2.11洗苗及杀菌消毒处理对移栽成活的影响

本发明将已开瓶锻炼好的组培苗用自来水冲洗根部残余培养基，分别以清水对照，0.5％和0.1％多菌灵溶液浸泡根系不同时间，详细处理见表8。每组试验5株，重复3次。分别于移栽后20天统计成活率。结果如表9所示。

表8杀菌消毒处理方法

表9洗苗及杀菌消毒处理对再生植株移栽成活的影响

处理编号	成活数(株)	成活率(％)
			1	4	26.7c
2	14	93.3a
			3	8	53.3abc
4	13	86.7ab
			5	6	40.0bc

由表9得出，处理2和处理4的移栽成活率较高，处理2为最高93.3％，15株苗子成活14株。自来水清洗，未经过杀菌处理，成活率最低，仅为26.7％。0.1％多菌灵处理整体较0.5％多菌灵处理好。

1.2.12不同营养土配比对移栽成活的影响

移栽基质不但影响组培瓶苗成活和生长，而且是制约组培快繁育苗的关键技术之一。不同基质其理化性质不一样，对组培苗移栽成活和生长影响显著。

本发明将已开瓶锻炼好的组培苗，清洗干净，分别以表草炭、沙土、草炭：沙土＝1:1和草炭：沙土＝2：1为介质，移栽到7cm*7cm营养钵内。每组试验5株，重复3次。分别于移栽后20天统计成活率。结果如表10所示。

表10不同营养土配比对组培苗移栽成活的影响

基质配比	成活数(株)	成活率(％)
			草炭	9	60.0b
沙土	8	53.3b
			草炭：沙土(1：1)	12	80.0a
草炭：沙土(2：1)	14	93.3a

由表10看出，草炭：沙土＝2：1时，移栽成活率最高为93.3％。仅用沙土，移栽成活率为53.3％，仅用草炭，移栽成活率为60.0％，两者相差不大；草炭：沙土＝1：1时，移栽成活率为80.0％。基质配比透气性和保水性均较高，有合适的疏松度，又有一定的保水能力，因此移栽成活率高。而单一一种基质由于基质过于疏松其保水性差而使幼苗容易失水死亡，或者由于基质过于板结影响根系呼吸，导致幼苗生长不良。

1.2.13再生植株果实、种子观察

对获得的供体材料‘野生128×HQ-2’和再生植株在果实、种子形状大小色泽等方面进行比较，如图17、图18及表11所示。

表11再生植株和供体材料性状比较

从图17、图18及表11看出，再生植株与供体材料相比，其果型指数较小，平均单瓜重较大，种子也较大，且种皮颜色鲜艳。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (2)

1.一种利用西瓜未授粉子房培养获得双单倍体植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤a：将西瓜杂交种定植于田间，植株开花前1天对雌花套帽，开花当天采集植株第5或第6节位的未授粉子房存于冰盒；所述西瓜杂交种为‘郑抗10号’或‘中科6号’；

步骤b：挑选出正常雌花的健壮子房，去掉果柄、花瓣和绒毛，在流水下冲洗30min，在超净工作台上用75%的酒精浸泡未授粉子房30s，随后用清水冲洗3遍，放在滤纸上吸干水分，去皮，将子房切成厚度为0.5~1.0mm的薄片，用8.0%次氯酸钠消毒20min后，用无菌水冲洗4-5遍；

步骤c：将薄片接种在诱导培养基上，37℃黑暗热激诱导3天，之后在25℃诱导培养得到再生材料，将再生材料接种在生根培养基上培养10天，得到组培苗；所述诱导培养基为MS培养基 +0.03 mg•L^-1噻苯隆TDZ+2.0 mg•L^-1激动素KT+30 mg•L^-1AgNO₃+ 30g•L^-1蔗糖 +6g•L^-1琼脂；所述生根培养基为MS培养基+0.5 mg•L^-1IBA+30g•L^-1蔗糖+6g•L^-1琼脂；

步骤d：开瓶锻炼6天，用0.1%多菌灵处理组培苗根系2min，将组培苗定植于营养钵中进行驯化移栽，得再生植株；所述营养钵中基质为质量比为2：1的草炭和沙土。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤b中将子房切成厚度为0.7~1.0mm的薄片。

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