CN111657143B - 一种百香果脱毒快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种百香果脱毒快繁方法，涉及果木脱毒快繁技术领域；本发明所述脱毒快繁方法，包括外植体的初代培养、脱毒、恢复培养、病毒检测、增殖培养和生根培养。本发明以黄金果百香果和紫果型百香果为例进行脱毒快繁，选择病毒检测呈阴性的组培苗进行后续的增殖培养和生根培养，对黄金果百香果进行增殖培养时，培养30d增殖系数可达5.60，对紫果型百香果进行增殖培养时，培养30d增殖系数可达4.27，对经过所述增殖培养的增殖苗(丛生芽)进行20d的生根培养时，根长均能达到4～5cm，生根率均达到95％以上，且每株平均生根数量5～6条，根系均匀洁白、有韧性，更易于清洗和移栽。

Description

一种百香果脱毒快繁方法

技术领域

本发明属于果木脱毒快繁技术领域，具体涉及一种百香果脱毒快繁方法。

背景技术

百香果，又名鸡蛋果、西番莲，为西番莲科西番莲属的藤本植物，是热带、亚热带多年生常绿藤本浆果类果树。百香果的果肉具有香蕉、菠萝、草莓、柠檬、荔枝等百余种水果的浓郁香味，芳香怡人，富含多种维生素、必需氨基酸、类胡萝卜素等多种成分，具有美容养颜、抗衰老等功效，故有“果汁之王”的美誉，可生食、制汁。

由于百香果果实具有极高的营养价值，且其属多年生常绿攀缘性藤本水果，生长旺盛，从种植到收获一般几个月，投产早，高产稳产，果实耐运输，销路广，经济效益较高。因此，市场对百香果的需求量逐年上升。在我国台湾、福建、广东、海南等地均有栽培。目前在广西多地区也在推广百香果的种植，广西桂北地区依托独特的地理环境和气候条件，在桂林地区的龙胜县、资源县等地建成初具规模的百香果产业，为农民脱贫致富提供新途径。

拓展产业需要大量的种苗支持。百香果的繁殖方法包括实生繁殖和无性繁殖。实生繁殖简单易行，但是难以保持母株的优良性状。目前生产上常用的百香果种苗繁殖方式主要是扦插和嫁接。扦插繁殖的成活率高，嫁接繁殖以抗凋萎病的黄果种实生苗为砧木，能够使苗木有较高的抗性。但是，在无法确保扦插和嫁接枝条完全无毒的情况下，生产上时有出现当年种下的小苗无法抽梢上棚，这与种苗携带病毒有关。因此繁育无毒种苗对百香果产业十分重要。

而组培脱毒快繁是生产植物无病毒种苗的主要手段。对百香果不同品系的组培快繁研究已有报道，所报道增殖系数有高有低，生根效率也相对稳定；但与其种苗脱毒快繁相关的研究报道则较少，其中的一些关键技术环节尚待优化完善和提升。目前为止，百香果种苗组培脱毒快繁技术还无法为其脱毒种苗的产业化生产提供支撑，更无法真正应用到其种苗繁育的生产实践中。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种百香果脱毒快繁方法，脱毒率高，且还具有增殖系数高、生根率高等优点，为百香果脱毒苗的组培快繁生产提供技术和方法支撑。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种百香果脱毒快繁方法，包括以下步骤：(1)以百香果的幼嫩茎段作为外植体，对外植体消毒后接种于初代培养基上进行初代培养，得芽苗；所述初代培养基以MS为基本培养基，还包括：6-BA 1.0mg/L和IAA 0.1mg/L；

(2)将所述芽苗接种于脱毒培养基上进行5～7d的脱毒，转接于增殖培养基上进行恢复培养50～60d，截取顶部0.5～1cm部位作为第二外植体；所述脱毒培养基以MS为基本培养基，还包括抗毒剂0.0125～0.025g/L、蔗糖30g/L和琼脂3.5g/L；所述增殖培养基以MS为基本培养基，还包括：6-BA 1.0～2.0mg/L、IAA 0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂3.5g/L；

(3)将所述第二外植体接种于所述增殖培养基中进行继代增殖培养，得组培苗；对所述组培苗进行病毒检测，所述病毒检测的病毒种类包括东亚西番莲病毒、黄瓜花叶病毒、夜来香花叶病毒和西番莲木质化病毒；

(4)将病毒检测阴性的组培苗接种于所述增殖培养基上进行增殖培养，得增殖苗；

(5)将所述增殖苗接种于生根培养基上进行生根培养，得百香果脱毒苗；所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，还包括：NAA 0.3mg/L、蔗糖20.0g/L和卡拉胶4.0g/L。

优选的，步骤(1)所述消毒包括：利用质量百分含量为1％的洗洁精水溶液浸泡所述外植体10min，取出后流水冲洗，无菌环境中，用体积百分含量为70％的乙醇水溶液浸泡60s，取出后置于质量百分含量为0.1％的氯化汞水溶液中浸泡8min，无菌水清洗3～5次。

优选的，外植体经过所述消毒后，还包括将所述外植体裁剪成含有1或2个腋芽的茎段。

优选的，步骤(1)所述初代培养、步骤(2)所述脱毒和恢复培养、步骤(3)所述继代增殖培养、步骤(4)所述增殖培养和步骤(5)所述生根培养的温度均为28±3℃，光照时间均为12h/d，光照强度均为40μmol·m^-2·s^-1。

优选的，步骤(2)所述抗毒剂的有效成分包括乙酸铜和盐酸吗啉胍，所述乙酸铜占所述抗毒剂质量的4％，所述盐酸吗啉胍占所述抗毒剂质量的16％。

优选的，步骤(2)所述的脱毒培养，当脱毒培养基中含有的抗毒剂为0.025g/L时，处理时间为5d，为0.0125g/L时，处理时间为7d。

优选的，步骤(3)所述病毒检测包括利用SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示的引物对检测东亚西番莲病毒，利用SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示的引物对检测黄瓜花叶病毒，利用SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6所示的引物对检测夜来香花叶病毒，利用SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8所示的引物对检测西番莲木质化病毒。

优选的，所述病毒检测的PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃～58℃梯度退火30s，72℃延伸30s，循环40次；72℃延伸10min。

优选的，步骤(4)进行所述增殖培养，当培养的为黄金百香果时，所述增殖培养基的配方为MS、6-BA 1.0mg/L、IAA 0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂3.5g/L；

当培养的为紫果型百香果时，所述增殖培养基的配方为MS、6-BA 2.0mg/L、IAA0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂3.5g/L。

优选的，在步骤(5)得到百香果脱毒苗后，还包括炼苗和移栽；所述移栽用基质为黄壤土和腐殖土的混合基质，所述混合基质中，黄壤土和腐殖土的体积比为1：2。

本发明提供了一种百香果脱毒快繁方法，从外植体的初代培养、脱毒、恢复培养、病毒检测、增殖培养和生根培养着手，探究其各个阶段适宜的培养基配方，完善并优化其组培快繁技术，以期为百香果的产业的发展奠定物质基础和技术支撑。本发明在前期增殖培养工作时发现，如果不进行脱毒培养，许多培养材料叶片蜷曲脱落，新生成的腋芽只有小突起而基本不生长，具有明显病毒病的特征，严重影响其快繁。因此，在增殖培养前对材料进行脱毒，得到脱毒材料是百香果增殖培养的基础。本发明实施例中以黄金果百香果和紫果型百香果为例进行脱毒快繁，选择病毒检测呈阴性的组培苗进行后续的增殖培养和生根培养，对黄金果百香果进行增殖培养时，培养30d增殖系数可达5.60，对紫果型百香果进行增殖培养时，培养30d增殖系数可达4.27，对经过所述增殖培养的增殖苗(丛生芽)进行20d的生根培养时，根长均能达到4～5cm，生根率均达到95％以上，且每株平均生根数量5～6条，根系均匀洁白、有韧性，更易于清洗和移栽。

附图说明

图1为初代培养20d后的芽苗图；

图2为百香果的病毒苗，其中A为感染黄瓜花叶病毒的植株，B为感染了西番莲木质化病毒的植株；

图3为黄金果百香果增殖培养表现，其中A、B、C、D、E、F、G、H和I分别代表处理1、处理2、处理3、处理4、处理5、处理6、处理7、处理8和处理9的增殖图；

图4为紫果型百香果增殖培养表现，其中A、B、C、D、E、F、G、H和I分别代表处理1、处理2、处理3、处理4、处理5、处理6、处理7、处理8和处理9的增殖图；

图5为百香果生根图；

图6为百香果脱毒苗移栽成活图。

具体实施方式

本发明提供了一种百香果脱毒快繁方法，包括以下步骤：(1)以百香果的幼嫩茎段作为外植体，对外植体消毒后接种于初代培养基上进行初代培养，得芽苗；所述初代培养基以MS为基本培养基，还包括：6-BA 1.0mg/L和IAA 0.1mg/L；

(2)将所述芽苗接种于脱毒培养基上进行5～7d的脱毒，转接于增殖培养基上进行恢复培养50～60d，截取顶部0.5～1cm部位作为第二外植体；所述脱毒培养基以MS为基本培养基，还包括抗毒剂0.0125～0.025g/L、蔗糖30g/L和琼脂3.5g/L；所述增殖培养基以MS为基本培养基，还包括：6-BA 1.0～2.0mg/L、IAA 0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂3.5g/L；

(3)将所述第二外植体接种于所述增殖培养基中进行继代增殖培养，得组培苗；对所述组培苗进行病毒检测，所述病毒检测的病毒种类包括东亚西番莲病毒、黄瓜花叶病毒、夜来香花叶病毒和西番莲木质化病毒；

(4)将病毒检测阴性的组培苗接种于所述增殖培养基上进行增殖培养，得增殖苗；

(5)将所述增殖苗接种于生根培养基上进行生根培养，得百香果脱毒苗；所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，还包括：NAA 0.3mg/L、蔗糖20.0g/L和卡拉胶4.0g/L。

本发明以百香果的幼嫩茎段作为外植体，对外植体消毒后接种于初代培养基上进行初代培养，得芽苗；所述初代培养基以MS为基本培养基，还包括：6-BA 1.0mg/L和IAA0.1mg/L。本发明所述幼嫩茎段优选为顶芽之下第3到第6腋芽所在茎节，对所述茎节进行消毒，所述消毒优选包括：利用质量百分含量为1％的洗洁精水溶液浸泡所述外植体10min，取出后流水冲洗，无菌环境中，用体积百分含量为70％的乙醇水溶液浸泡60s，取出后置于质量百分含量为0.1％的氯化汞水溶液中浸泡8min，无菌水清洗3～5次。在本发明中，外植体部位的选择对消毒结果影响很大，太老的茎段茎秆中空，消毒后污染率和死亡率都比较高；太嫩的顶芽及其下端1～2芽部位，升汞消毒后容易褐化死亡，本发明所述外植体的所在茎节，多数呈半纤维化状态，不如顶芽过于嫩弱，也尚未长老出现中空，在适宜的升汞灭菌时间下，消毒存活率较高。本发明所述外植体经过所述消毒后，优选还包括将所述外植体裁剪成含有1或2个腋芽的茎段，进行后续的培养。本发明所述初代培养的温度优选为28±3℃，光照时间优选为12h/d，光照强度优选为40μmol·m^-2·s^-1。本发明在所述条件下进行初代培养，20d后成活率为48.89％。

得芽苗后，本发明将所述芽苗接种于脱毒培养基上进行5～7d的脱毒，转接于增殖培养基上进行恢复培养50～60d，截取顶部0.5～1cm部位作为第二外植体；所述脱毒培养基以MS为基本培养基，还包括抗毒剂0.0125～0.025g/L、蔗糖30g/L和琼脂3.5g/L；所述增殖培养基以MS为基本培养基，还包括：6-BA 1.0～2.0mg/L、IAA 0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂3.5g/L。本发明将所述芽苗接种于脱毒培养基上进行5～7d的脱毒，所述脱毒培养基中包括0.0125～0.025g/L的抗毒剂，所述抗毒剂优选为山东省绿士农药有限公司生产的“绿士杀毒风”(简称KBD-A)，为可湿性粉剂，其有效成分为乙酸铜和盐酸吗啉胍、含量分别为4％和16％。在本发明中，当所述抗毒剂的浓度不同时，其对于芽苗的影响也不相同，当所述KBD-A的浓度为0.025g/L时，需脱毒5d；当所述KBD-A的浓度为0.0125g/L时，需脱毒7d。经过所述脱毒后，可显著降低室外采集外植体时所携带的病毒，从而为获得脱毒苗提供了基础。

本发明将脱毒后的芽苗转接于增殖培养基上进行恢复培养50～60d，截取顶部0.5～1cm部位作为第二外植体。本发明所述恢复培养可解除脱毒对芽苗的不利影响，从而促进芽苗的增殖和继代。植物体内病毒的分布是不均匀的，越靠近顶端区域，病毒的感染深度越低，截取顶部0.5～1cm部位作为第二外植体进一步减少外植体携带病毒的可能性。本发明所述增殖培养基针对不同品种的百香果时，培养基的配比略有不同，当应用于黄金百香果时，所述增殖培养基的配方优选为MS、6-BA 1.0mg/L、IAA 0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂3.5g/L；当应用于紫果型百香果时，所述增殖培养基的配方优选为MS、6-BA 2.0mg/L、IAA 0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂3.5g/L。本发明所述脱毒和恢复培养的温度优选为28±3℃，光照时间优选为12h/d，光照强度优选为40μmol·m^-2·s^-1。

得第二外植体后，本发明将所述第二外植体接种于所述增殖培养基中进行继代增殖培养，得组培苗；对所述组培苗进行病毒检测，所述病毒检测的病毒种类包括东亚西番莲病毒、黄瓜花叶病毒、夜来香花叶病毒和西番莲木质化病毒。本发明所述继代增殖培养的时间优选为30d，将得到培养材料进行病毒检测，以未经过脱病毒培养的材料为阳性对照。

本发明进行所述病毒检测时，优选的提取所述组培苗的叶片总RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA，通过特异性扩增中国地区已报道的东亚西番莲病毒(East AsianPassiflora virus，EAPV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus，TeMV)、西番莲木质化病毒(Passiion fruit woodiness virus，PWV)等百香果病毒的病毒外壳蛋白序列，来检测病毒的有无。本发明扩增所述百香果病毒的引物对优选如表1所示。

表1百香果4种病毒RT-PCR检测引物序列信息

本发明利用上述引物分别检测4种病毒，所述检测用的扩增体系以25μL计，优选包括：cDNA模板1μL，上下游引物各1μL，2×Tap PCR MastreMixⅡ12.5μL，ddH₂O 9.5μL。本发明所述扩增的程序优选包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃～58℃梯度退火30s，72℃延伸30s，循环40次；72℃延伸10min。本发明在所述扩增完成后优选进行1％的琼脂糖凝胶电泳，根据目的序列的出现与否，判断病毒的有无；并回收出现的阳性目的片段，克隆转化并进行测序验证。

本发明将病毒检测阴性的组培苗接种于所述增殖培养基上进行增殖培养，得增殖苗(或称从生苗和芽苗)。本发明所述增殖培养的温度优选为28±3℃，光照时间优选为12h/d，光照强度优选为40μmol·m^-2·s^-1。本发明所述增殖培养的时间优选为30d，利用本发明所述增殖培养，每30d继代一次，黄金百香果和紫果型百香果的增殖系数分别为5.60/30d和4.27/30d。

得增殖苗后，本发明将所述增殖苗接种于生根培养基上进行生根培养，得百香果脱毒苗；所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，还包括：NAA 0.3mg/L、蔗糖20.0g/L和卡拉胶4.0g/L。本发明优选将所述增殖苗从基部剪下转入生根培养基中进行生根培养，所述生根培养的时间优选为20d。本发明所述生根培养的温度优选为28±3℃，光照时间优选为12h/d，光照强度优选为40μmol·m^-2·s^-1。在本发明中，经过20d的生根培养，根长可达4～5cm，生根率都能达到95％以上。本发明所述生根培养基中以卡拉胶作为固体支撑物，可使根系均匀洁白、有韧性，更易于清洗和移栽。

本发明在得到百香果脱毒苗后，优选还包括炼苗和移栽。本发明所述炼苗优选为将所述百香果脱毒苗置于70％遮阴度的大棚中炼苗5～7d，炼苗结束后，取出生根苗并洗净根部培养基，移栽于已消毒的移栽基质中，在温室大棚培养14d后，成活率在90％以上。本发明所述移栽基质优选为黄壤土和腐殖土的混合基质，所述混合基质中黄壤土和腐殖土的体积比优选为1：2。

下面结合实施例对本发明提供的百香果脱毒快繁方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

外植体消毒、接种及初代培养

以紫果型百香果和黄金百香果嫩茎作为外植体，将外植体置于质量浓度为1％的洗洁精水溶液中浸泡10min，取出后用流水冲洗干净，再置于超净工作台上用体积浓度为70％的乙醇浸泡60s，取出后置于质量浓度为0.1％的HgCl₂中浸泡灭菌，灭菌时间选取6、7、8和9min 4个水平，最后用无菌水清洗3～5次。将经过消毒处理的百香果外植体裁剪成含有1或2个腋芽的茎段，将茎段接种到MS+6-BA 1.0mg·L^-1+IAA 0.1mg·L^-1培养基中培养，每个处理30瓶，每瓶接种外植体1个，重复3次，每隔1周观测记录材料的生长状况并剔除污染材料。试验培养温度为28±3℃、光照时间为12h/d、光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

光照培养20d后对外植体成活率进行统计，结果如表2所示，随着升汞灭菌时间的延长，其成活率先上升后下降，升汞处理8min时成活率最高，为48.89％。当百香果初生芽苗高度为2～3cm时，将作为下一步进行茎尖脱毒或增殖培养的无菌材料(图1)。

表2不同杀菌时间对外植体成活率的影响

处理号	升汞灭菌时间(min)	存活率
			1	6	34.44b
2	7	41.11b
			3	8	48.89a
4	9	37.78b

注：同一列不同的小写字母表示0.05水平差异显著。

实施例2

步骤1)外植体消毒、接种及初代培养

以紫果型百香果和黄金百香果嫩茎作为外植体，将外植体置于质量浓度为1％的洗洁精水溶液中浸泡10min，取出后用流水冲洗干净，再置于超净工作台上用体积浓度为70％的乙醇浸泡60s，取出后置于质量浓度为0.1％的HgCl₂中浸泡8min，最后用无菌水清洗3～5次。将经过消毒处理的百香果外植体裁剪成含有1或2个腋芽的茎段，将茎段接种到MS+6-BA 1.0mg·L^-1+IAA 0.1 mg·L^-1培养基中培养。试验培养温度为28±3℃、光照时间为12h/d、光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

步骤2)百香果脱病毒培养

配制含有KBD-A(山东省绿士农药有限公司生产的“绿士杀毒风”)终浓度分别为0.05g/L，0.025g/L，0.0125g/L，0.005g/L的培养基，经高压灭菌后，作为百香果脱毒培养基使用。

将百香果芽苗剪成含有两个腋芽、长2～3cm、包含叶片的外植体，接种于MS+KBD-A0.005～0.05g·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1(pH 5.8)培养基中进行脱病毒培养。结果如表3所示，KBD-A 0.05g·L^-1处理的培养材料，在脱病毒培养第3d开始黄化、第5d出现死亡；KBD-A 0.025g·L^-1处理的培养材料，在在脱病毒培养第5d开始黄化、第7d出现死亡；KBD-A 0.0125g·L^-1处理的培养材料，在在脱病毒培养第7d出现黄化。将KBD-A 0.025g·L^-1处理5d、KBD-A 0.0125g·L^-1和KBD-A 0.005g·L^-1处理7d的材料，转接到正常的继代增殖培养基中进行恢复培养，40d后材料恢复生长。将恢复生长的小苗顶芽端1cm部分剪下(其余丢弃)，再接种于增殖培养基中进行增殖培养，30后可长成5～7cm的芽苗，用于病毒检测和下一轮增殖培养。病毒检测结果表明(表3)，KBD-A 0.025g/L处理5d和KBD-A 0.0125g/L处理7d，恢复生长后取小苗顶芽端0.5～1.0cm为材料进行增殖培养，可得到脱病毒的组培快繁材料，脱毒效率为100％；而KBD-A 0.005g·L^-1处理7d的材料经过恢复培养，其脱毒效率为70％，达不到理想效果，紫果型百香果和黄金百香果的脱病毒方法和脱毒效果基本相同。

表3百香果的脱病毒培养及其效果

实施例3

步骤1)同实施例2；

步骤2):将百香果芽苗剪成含有两个腋芽、长2～3cm、包含叶片的外植体，接种于MS+KBD-A 0.025g·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1(pH 5.8)培养基中脱病毒培养5d或MS+KBD-A 0.0125g·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1(pH 5.8)培养基中脱病毒培养7d。培养过后，转接到步骤4)继代增殖培养基中进行恢复培养，40d后材料恢复生长。将恢复生长的小苗顶芽端1cm部分剪下(其余丢弃)，再接种于步骤4)增殖培养基中进行增殖培养，30后可长成5～7cm的芽苗，用于病毒检测和下一轮增殖培养。

步骤3)百香果病毒检测

提取百香果脱毒苗(以未脱毒苗为阳性对照)叶片总RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA。通过特异性扩增中国地区已报道的东亚西番莲病毒(East Asian Passifloravirus，EAPV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、夜来香花叶病毒(Telosmamosaic virus，TeMV)、西番莲木质化病毒(Passiion fruit woodiness virus，PWV)等百香果病毒的病毒外壳蛋白序列，来检测病毒的有无。扩增体系(25μL)：cDNA模板1μL，上下游引物各1μL，2×Tap PCR MastreMix Ⅱ12.5μL，ddH₂O 9.5μL；扩增程序：94℃预变性5min，(94℃变性30s，55℃～58℃梯度退火30s，72℃延伸30s)循环40次，72℃延伸10min。扩增完成后进行1％的琼脂糖凝胶电泳，根据目的序列的出现与否判断是否侵染病毒。PCR扩增引物见表1，其中阳性对照如图2所示，其中图2中A为感染黄瓜花叶病毒的植株，图2中B为感染了西番莲木质化病毒的植株。

实施例4

步骤1)和步骤2)同实施例3；

步骤3)选择实施例3中未侵染病毒的百香果培养材料进行后续实验；

步骤4)百香果增殖培养

将经过脱病毒培养并在病毒RT-PCR检测中表现为阴性的黄金果培养材料，接种于含有不同浓度配比的6-BA和IAA的MS培养基中，培养基中用于固化的琼脂3.5g·L^-1，蔗糖30g·L^-1，pH调至5.8。试验采取正交试验设计，6-BA取0.5、1.0、1.5mg·L^-1三个水平，IAA取0.1、0.2、0.3mg·L^-1三个水平，每组处理接种20个茎段，重复3次，接种之后，每隔10d观测记录材料的生长情况，培养30d后，统计各个处理的增殖系数和长势(叶片颜色、苗高及茎杆的粗细等)。试验培养温度为28±3)℃、光照时间为12h/d、光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

在培养30d后，统计发现6-BA浓度为0.5mg·L^-1时，增殖效果差，增殖系数在2.0以下，植株健壮，叶片宽大，IAA浓度提高也不能使其增殖效果显著提高。处理5(6-BA浓度1.0mg·L^-1、IAA浓度0.2mg·L^-1)的增殖系数最高，可以达到5.6，且与其他处理达到极显著水平(表4，图3)。相对于其他处理其植株叶片鲜绿，丛生芽较多，且植株长势旺盛。处理6和处理7虽然增殖系数也能够达到4.0以上，但是二者高增长明显且叶片宽大发黄，随着继代次数的增多会导致增殖系数逐渐降低。综上，确定表4中的处理5即培养基MS+6-BA 1.0mg·L^-1+IAA 0.2mg·L^-1为较适合的黄金果百香果增殖培养基，培养30d，增殖系数5.60。

表4 6-BA和IAA组合对黄金果百香果增殖系数的影响

注：同一列不同的小写字母表示0.05水平差异显著

将通过抗病毒预处理的紫果型百香果幼苗接种于含有不同浓度配比的6-BA和IAA的MS培养基中，培养基中用于固化的琼脂3.5g·L^-1，蔗糖30g·L^-1，pH调至5.8。试验采取正交试验设计，6-BA取1.5、2.0、2.5mg·L^-1三个水平，IAA取0.1、0.2、0.3mg·L^-1三个水平，每组处理接种20个茎段，重复3次，接种之后，每隔10d观测记录材料的生长情况，培养30d后，统计各个处理的增殖系数和长势(叶片颜色、苗高及茎杆的粗细等)。试验培养温度为28±3℃、光照时间为12h/d、光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

结果如表5和图4所示，紫果型百香果增殖系数也可以接近或达到4.0，处理5(6-BA2.0mg·L^-1，IAA 0.2mg·L^-1)和处理6(6-BA 2.0mg·L^-1，IAA 0.3mg·L^-1)增殖效果最好，增殖系数分别为4.27/30d和4.23/30d，二者差异不显著，但与其他处理达到了极显著水平。虽然处理5和处理6在增殖系数方面没有显著性差异，但利用处理6进行增殖培养，紫果型百香果组培苗茎秆纤细、叶片蜷曲且部分掉落，植株生长不良，因此确定表5中的处理5即MS+6-BA 2.0mg·L^-1+IAA 0.2mg·L^-1为较是较为适宜的紫果型百香果增殖培养基，培养30d，增殖系数4.27。

表5 6-BA和IAA组合对紫果型百香果增殖系数的影响

注：同一列不同的小写字母表示0.05水平差异显著。

以上述试验确定优选的步骤4)：

实施例5

步骤1)、2)和3)同实施例4；

步骤4)将经过脱病毒培养并在病毒RT-PCR检测中表现为阴性的黄金果培养材料，接种于增殖培养基MS+6-BA 1.0mg·L^-1+IAA 0.2mg·L^-1上进行增殖培养；而紫果型培养材料接种于增殖培养基MS+6-BA 2.0mg·L^-1+IAA 0.2mg·L^-1上进行增殖培养；二者的试验培养温度为28±3℃、光照时间为12h/d、光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

在实施例1优选的步骤1)、实施例2优选的步骤2)、实施例3和实施例4优选的步骤4)的基础上进行后续的步骤5)

步骤5)百香果组培苗生根培养及炼苗移栽

选择增殖培养所得的丛生苗和芽苗为生根材料，转入含有不同浓度NAA的1/2MS培养基中进行生根培养。培养基中用于固化的琼脂3.5或卡拉胶3.8g·L^-1，蔗糖20g·L^-1，pH调至5.8。试验所用NAA取0.2、0.3、0.4mg·L^-1三个水平，共设计3个处理，每个处理10瓶，每瓶接种百香果无根苗5株，重复三次得到数据。接种后，培养20d，观测统计各处理幼苗的根数、根长、根毛、生根率及植株长势等。百香果组培苗生根培养条件为：温度28±3℃、光照时间12h/d、光照强度40μmol·m^-2·s^-1。

根据表6的统计结果显示，紫果型型百香果生根培养，处理2在生根数方面与其他两个处理差异极显著，平均生根数量为5条。三个处理在根长和生根率方面没有显著差异。经过20d生长根长都能够达到4cm，生根率都能达到95％以上。根据表7的统计结果显示，黄金百香果生根培养和紫果型的生根培养类似，二者都以含有NAA 0.3mg·L^-1的1/2MS培养基为较适宜的百香果组培苗生根的培养基。

分别以琼脂和卡拉胶为固体支撑物，两者的生根率和株根数没有明显差异；但前者茎基部通常包绕较大团的愈伤组织，而后者愈伤团较小；另外后者的根系长短和粗细比前者更均匀。因此，百香果的生根培养为1/2MS+NAA 0.3mg·L^-1+糖20.0g·L^-1+卡拉胶3.8g·L^-1，在该培养基中，生根苗健壮，生根率95％以上(若接种的无根苗足够健壮，生根率可达100％)，每株平均生根数量5条，根系均匀洁白、有韧性，更易于清洗和移栽(图5)。

表6不同NAA浓度对紫果型百香果组培苗生根影响

注：同一列不同的小写字母表示0.05水平差异显著。

表7不同NAA浓度对黄金百香果组培苗生根影响

注：同一列不同的小写字母表示0.05水平差异显著。

打开百香果组培瓶的瓶盖，将百香果组培苗置于70％遮阴度的大棚中炼苗7d。炼苗结束后，取出生根苗并洗净根部培养基，移栽于装有消过毒的移栽基质(黄壤土：腐殖土＝1:2)的营养杯(12cm×12cm)中，在温室大棚培养30d后，统计成活率。在温室大棚培养14d后，如图6所示，成活率在90％以上。

对比例1

在实施例1的基础上，不进行实施例2和实施例3的脱毒培养和检测，直接进行实施例4的增殖培养。结果发现，只能生长为芽点的初代芽继代培养后仍为芽点，不仅不能增大伸长，还随着培养进程芽点萎缩变黄。即使初代培养生长正常的材料，在后续增殖培养过程中，许多培养材料叶片蜷曲脱落，新生成的腋芽只有小突起而基本不生长(图2)。经检测其中明显携带一到多种病毒，从而抑制了百香果组培苗的正常生长。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所

<120> 一种百香果脱毒快繁方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttgcatgtc ctagacctcg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aactgtggtc ggtttaccca a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accgtgtggg ttacagttcg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacggactaa gtcgggagca 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcaagtaagg tggatgatgt t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctgcacagag ccaaccccaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accctctcaa gccaatggtt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agtgtgcctt tcagtgtcct 20

Claims (8)

1.一种百香果脱毒快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以百香果的幼嫩茎段作为外植体，对外植体消毒后接种于初代培养基上进行初代培养，得芽苗；所述初代培养基以MS为基本培养基，还包括：6-BA 1.0 mg/L和IAA 0.1 mg/L；

（2）将所述芽苗接种于脱毒培养基上进行5~7d的脱毒，转接于增殖培养基上进行恢复培养50~60d，截取顶部0.5~1cm部位作为第二外植体；所述脱毒培养基以MS为基本培养基，还包括抗毒剂 0.0125~0.025g/L、蔗糖30 g/L和琼脂3.5 g/L；所述增殖培养基以MS为基本培养基，还包括：6-BA 1.0~2.0mg/L、IAA 0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂3.5g/L；所述抗毒剂的品种为绿士杀毒风，有效成分为乙酸铜和盐酸吗啉胍，所述乙酸铜占所述抗毒剂质量的4%，所述盐酸吗啉胍占所述抗毒剂质量的16%；当脱毒培养基中含有的抗毒剂为0.025 g/L时，处理时间为5 d，为0.0125 g/L时，处理时间为7 d；

（3）将所述第二外植体接种于所述增殖培养基中进行继代增殖培养，得组培苗；对所述组培苗进行病毒检测，所述病毒检测的病毒种类包括东亚西番莲病毒、黄瓜花叶病毒、夜来香花叶病毒和西番莲木质化病毒；

（4）将病毒检测阴性的组培苗接种于所述增殖培养基上进行增殖培养，得增殖苗；

（5）将所述增殖苗接种于生根培养基上进行生根培养，得百香果脱毒苗；所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，还包括：NAA 0.3 mg/L、蔗糖20.0 g/L和卡拉胶4.0g/L。

2.根据权利要求1所述脱毒快繁方法，其特征在于，步骤（1）所述消毒包括：利用质量百分含量为1%的洗洁精水溶液浸泡所述外植体10 min，取出后流水冲洗，无菌环境中，用体积百分含量为70%的乙醇水溶液浸泡60 s，取出后置于质量百分含量为0.1%的氯化汞水溶液中浸泡8min，无菌水清洗3~5次。

3.根据权利要求2所述脱毒快繁方法，其特征在于，外植体经过所述消毒后，还包括将所述外植体裁剪成含有1或2个腋芽的茎段。

4.根据权利要求1所述脱毒快繁方法，其特征在于，步骤（1）所述初代培养、步骤（2）所述脱毒和恢复培养、步骤（3）所述继代增殖培养、步骤（4）所述增殖培养和步骤（5）所述生根培养的温度均为28±3℃，光照时间均为12 h/d，光照强度均为40 µmol·m^-2·s^-1。

5.根据权利要求1所述脱毒快繁方法，其特征在于，步骤（3）所述病毒检测包括利用SEQID NO.1~SEQ ID NO.2所示的引物对检测东亚西番莲病毒，利用SEQ ID NO.3~SEQ ID NO.4所示的引物对检测黄瓜花叶病毒，利用SEQ ID NO.5~SEQ ID NO.6所示的引物对检测夜来香花叶病毒，利用SEQ ID NO.7~SEQ ID NO.8所示的引物对检测西番莲木质化病毒。

6.根据权利要求5所述脱毒快繁方法，其特征在于，所述病毒检测的PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃~58℃梯度退火30 s，72℃延伸30 s，循环40次；72℃延伸10 min。

7.根据权利要求1所述脱毒快繁方法，其特征在于，步骤（4）进行所述增殖培养，当培养的为黄金百香果时，所述增殖培养基的配方为MS、6-BA 1.0 mg/L、IAA 0.2 mg/L、蔗糖30g/L和琼脂3.5 g/L；

当培养的为紫果型百香果时，所述增殖培养基的配方为MS、6-BA 2.0 mg/L、IAA 0.2mg/L、蔗糖30 g/L和琼脂3.5 g/L。

8.根据权利要求1所述脱毒快繁方法，其特征在于，在步骤（5）得到百香果脱毒苗后，还包括炼苗和移栽；

所述移栽用基质为黄壤土和腐殖土的混合基质，所述混合基质中，黄壤土和腐殖土的体积比为1：2。

Images