CN115735773A - 类番茄茄和多毛番茄的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及类番茄茄和多毛番茄的组织培养方法，属于植物组织培养技术领域。为解决野生番茄扩繁困难的问题，本发明提供了类番茄茄和多毛番茄的组织培养方法，步骤包括种子消毒、组培苗的获得、生根培养和驯化移栽。本发明提供的组织培养方法通过组培苗直接生根培养成功培育出番茄近缘野生种类番茄茄和野生番茄多毛番茄，具有繁殖周期短、繁殖系数高、易生根且根系粗壮，新梢长势好，茎秆粗壮，驯化易成活、裸根移栽成活率高的优点，提高了类番茄茄和多毛番茄的存活率且解决了扩繁困难的问题，为野生番茄种质资源的多样性提供了基础。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及类番茄茄和多毛番茄的组织培养方法。
背景技术
番茄(Solanum lycopersicum)属于茄科茄属，一年生或多年生草本植物，番茄起源于南美洲，在中国南北方广泛栽培。番茄属喜温植物，在15℃～30℃均能生长，被认为是世界上最重要的蔬菜之一。由于全球气候变暖造成的极端天气等影响，对抗性番茄品种以及种质资源多样化的需求大幅增加。
番茄的近缘野生种类番茄茄(Solanum lycopersicoides)，其植株直立，茎秆柔软，奇数羽状复叶，叶缘锯齿状；含复总状花序，花瓣艳黄色，花药白色；果实在成熟前是坚硬的绿色小浆果，叶散发出淡淡的刺激气味。类番茄茄起源于海拔3000米以上的高山，所以耐冷性较强，在-1.25至-5.3℃的条件下能够正常生长，是优质的抗冷材料。而且类番茄茄对灰霉病、疫病、番茄TMV等病害具有较强的抗性。由于类番茄茄柱头伸长且具有自交不结实的特性，其扩繁较为困难。
野生番茄多毛番茄(Solanum habrochaites)，起源于寒冷的安第斯山脉，能够忍受0℃的夜间低温而不受害，并且多毛番茄自身含有丰富的抗病基因。多毛番茄具有特殊的腺毛状体，产生的特殊物质对各种害虫有特别广泛的抗性。由于多毛番茄具有柱头伸长的特性，其扩繁也较为困难。
野生番茄具有许多优良的抗性性状和优质特性，但由于其自交不结实，普通的番茄栽培方式并不都适合野生番茄，导致野生番茄扩繁能力较低，甚至有些品种不能存活，繁育受阻，大部分野生番茄种质资源仍需要从国外引进，使野生番茄的研究应用受到限制。
发明内容
为解决野生番茄扩繁困难的问题，本发明提供了类番茄茄和多毛番茄的组织培养方法。
本发明的技术方案：
类番茄茄和多毛番茄的组织培养方法，步骤如下：
步骤一、种子消毒：种子依次经恒温水浸泡、酒精消毒、无菌水清洗、次氯酸钠消毒、无菌水清洗后备用；
步骤二、组培苗的获得：将步骤一消毒清洗后的种子播种到1/2MS培养基，发芽之前按光暗周期为16/8h培养，发芽之后保持光照强度和培养温度继续培养；
步骤三、生根培养：选取步骤二获得的长出真叶的14d苗龄无菌苗的2～3cm茎段及生长点部位作为外植体接种到生根培养基中进行生根培养；
步骤四、驯化移栽：待幼苗主根长到4～5cm及3～4片真叶后，将幼苗移栽到无菌营养土中驯化培养。
进一步的，步骤一所述恒温水的温度为55℃，所述浸泡时间为4h，所述酒精的体积浓度为75％，所述酒精消毒时间为60s，所述次氯酸钠的体积浓度为10％，所述次氯酸钠消毒时间为10min。
进一步的，步骤一所得消毒清洗后的种子在接种前用小刀划破种皮从而打破种子休眠状态。
进一步的，步骤二所述1/2MS培养基的配方为MS 2.35mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH 5.7～5.8。
进一步的，步骤二所述光照强度为1600lx，培养温度为25℃。
进一步的，步骤三用于类番茄茄组织培养的生根培养基配方为MS培养基4.7mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L十IAA0.2mg/L，PH 5.7～5.8；用于多毛番茄组织培养的生根培养基配方为MS培养基4.7mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH 5.7～5.8。
进一步的，步骤三所述生根培养的光照强度为1600lx，光暗周期为16/8h，培养温度为25℃，培养时间为7d。
进一步的，步骤四所述无菌营养土包括质量比为2:1的土壤和蛭石，所述驯化培养的光暗周期为16/8h，培养温度为25℃，光照强度为1600lx。
进一步的，步骤四移栽类番茄茄幼苗时将幼苗直接移栽到无菌营养土中；移栽多毛番茄幼苗时先将幼苗移栽到无菌营养液中炼苗3～5天，再转移到无菌营养土中。
进一步的，所述无菌营养液所含氮、磷和钾的质量比为1:3:2。
本发明的有益效果：
本发明提供的组织培养方法通过组培苗直接生根培养成功培育出野生番茄中类番茄茄与多毛番茄，具有繁殖周期短、繁殖系数高、易生根且根系粗壮，新稍长势好，茎秆粗壮，驯化易成活、裸根移栽成活率高的优点，提高了野生番茄的存活率，解决了野生番茄扩繁困难的问题，为野生番茄种质资源的多样性提供了基础。
附图说明
图1为实施例1类番茄茄组织培养过程的照片，图中A为种子播种、B为外植体培养、C为驯化、D为移栽；
图2为实施例2多毛番茄组织培养过程的照片，图中E为种子播种、F为外植体培养、G为驯化、H为移栽；
图3为对比例1与实施例1五组类番茄茄种子的发芽情况对比照片，A为蒸馏水、B为营养液、C为蛭石、D为营养土、E为1/2MS培养基；
图4为对比例2不同IAA浓度下类番茄茄无菌苗生长状态对比照片，A为0mg/L IAA、B为0.1mg/L IAA、C为0.2mg/L IAA、D为0.3mg/L IAA、E为0.4mg/L IAA；
图5为对比例3不同移栽培养基质下类番茄茄的驯化状态对比图，A为营养液，B为蒸馏水，C为蛭石，D为草炭，E为营养土；
图6为对比例4与实施例2五组多毛番茄种子的发芽情况对比照片，A为蒸馏水、B为营养液、C为蛭石、D为营养土、E为1/2MS培养基；
图7为对比例5不同IAA浓度下多毛番茄无菌苗生长状态对比照片，A为0mg/L IAA、B为0.1mg/L IAA、C为0.2mg/L IAA、D为0.3mg/L IAA、E为0.4mg/L IAA；
图8为对比例6不同移栽培养基质下多毛番茄的驯化状态对比图，A为营养液，B为蒸馏水，C为蛭石，D为草炭，E为营养土。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供了野生番茄类番茄茄的的组织培养方法，步骤如下：
步骤一、种子消毒：将番茄种子放于纱布中，纱布中种子的数量视纱布大小而定。种子置于55℃的恒温水中，轻轻揉搓种子，使得番茄种子表面的浮毛得以去除，而后将种子置换于55℃的恒温水中进行浸泡4h，在无菌条件下以75％体积浓度的酒精消毒60s，无菌蒸馏水清洗3次，10％体积浓度的次氯酸钠消毒10min，无菌水清洗3～5次备用。
步骤二、组培苗的获得：由于野生番茄种子种皮较厚，在接种培养基前可用小刀划破步骤一消毒清洗后的种子的种皮从而打破种子休眠；然后将种子播种到1/2MS培养基，1/2MS培养基的配方为MS 2.35mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH 5.7～5.8。
发芽之前组培瓶需用锡纸包裹进行避光处理，在光照强度1600lx，16/8h光暗周期，25℃的培养条件下生长，发芽之后将锡纸去掉，保持光照强度和培养温度继续培养。
步骤三、生根培养：选取步骤二获得的长出真叶的14d苗龄无菌苗的2～3cm茎段及生长点部位作为外植体接种到生根培养基中进行生根培养；
本实施例用于类番茄茄组织培养的生根培养基配方为MS培养基4.7mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L十IAA0.2mg/L，PH 5.7～5.8；生根培养的光照强度为1600lx，光暗周期为16/8h，培养温度为25℃，培养时间为7d左右。
步骤四、驯化移栽：待幼苗主根长到4～5cm及3～4片真叶后，将幼苗移栽到质量比为2:1的土壤和蛭石组成的无菌营养土中进行培养，为了保湿在苗上方盖上保鲜膜，覆膜培养3～4d后去掉保鲜膜继续培养，培养的光暗周期为16/8h，光照强度为1600lx，培养温度为25℃。
实施例2
本实施例提供了野生番茄多毛番茄的的组织培养方法，步骤如下：
步骤一、种子消毒：将番茄种子放于纱布中，纱布中种子的数量视纱布大小而定。种子置于55℃的恒温水中，轻轻揉搓种子，使得番茄种子表面的浮毛得以去除，而后将种子置换于55℃的恒温水中进行浸泡4h，在无菌条件下以75％体积浓度的酒精消毒60s，无菌蒸馏水清洗3次，10％体积浓度的次氯酸钠消毒10min，无菌水清洗3～5次备用。
步骤二、组培苗的获得：由于野生番茄种子种皮较厚，在接种培养基前可用小刀划破步骤一消毒清洗后的种子的种皮从而打破种子休眠；然后将种子播种到1/2MS培养基，1/2MS培养基的配方为MS 2.35mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH 5.7～5.8。
发芽之前组培瓶需用锡纸包裹进行避光处理，在光照强度1600lx，16/8h光暗周期，25℃的培养条件下生长，发芽之后将锡纸去掉，保持光照强度和培养温度继续培养。
步骤三、生根培养：选取步骤二获得的长出真叶的14d苗龄无菌苗的2～3cm茎段及生长点部位作为外植体接种到生根培养基中进行生根培养；
本实施例用于多毛番茄组织培养的生根培养基配方为MS培养基4.7mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH 5.7～5.8；生根培养的光照强度为1600lx，光暗周期为16/8h，培养温度为25℃，培养时间为7d左右。
步骤四、驯化移栽：待幼苗主根长到4～5cm及3～4片真叶后，先将幼苗移栽到氮、磷和钾的质量比为1:3:2的无菌营养液中炼苗3～5天，再转移到质量比为2:1的土壤和蛭石组成的无菌营养土中进行培养，为了保湿在苗上方盖上保鲜膜，覆膜培养3～4d后去掉保鲜膜继续培养，培养的光暗周期为16/8h，光照强度为1600lx，培养温度为25℃。
图1和图2依次为实施例1类番茄茄组织培养过程的照片和实施例2多毛番茄组织培养过程的照片，其中图1的D图和图2的H图依次为组培得到的类番茄茄和多毛番茄的完整植株，由图1和图2可以看出本发明提供的组织培养方法通过组培苗直接生根培养成功培育出野生番茄中类番茄茄与多毛番茄，解决了野生番茄扩繁困难的问题，为野生番茄种质资源的多样性提供了基础。
对比例1
本对比例提供了四种不同培养基质对类番茄茄组培苗进行培育，具体为：
第一组：用未灭菌蒸馏水进行培养；第二组：用氮、磷和钾的质量比为1:3:2的无菌营养液进行培养，第三组：用蛭石进行培养；第四组用质量比为2:1的土壤和蛭石组成的无菌营养土进行培养。
本对比例种子消毒方法与实施例1相同，消毒清洗后的类番茄茄种子在接种培养基前可用小刀划破步骤一消毒清洗后的种子的种皮从而打破种子休眠；然后将种子播种到四种不同培养基质中，发芽之前组培瓶需用锡纸包裹进行避光处理，在光照强度1600lx，16/8h光暗周期，25℃的培养条件下生长，发芽之后将锡纸去掉，保持光照强度和培养温度继续培养。
图3为对比例1与实施例1五组类番茄茄种子的发芽情况对比照片，A为蒸馏水，B为营养液，C为蛭石，D为营养土，E为1/2MS培养基。统计本对比例与实施例1五组种子的发芽率，发芽率＝发芽种子个数/接种种子总数，结果如表1所示。
表1
由表1数据和图3显示，实施例1组培苗的培养方法得到的类番茄茄发芽率最高，达到92％。
对比例2
本对比例以实施例1步骤二获得的长出真叶的14d苗龄无菌苗的2～3cm茎段及生长点部位作为外植体接种到五组不同生根培养基上进行生根培养；生根培养的光照强度为1600lx，光暗周期为16/8h，培养温度为25℃，培养时间为7d左右。
本对比例使用的生根培养基的基础培养基配方为MS培养基4.7mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH 5.7～5.8；五组不同生根培养基在基础培养基配方基础上还含有不同浓度的IAA，IAA浓度依次为0、0.1、0.2、0.3、0.5mg/L；观察五组类番茄茄茎端生长状态，结果如图4和表2所示。
图4为本对比例不同IAA浓度下类番茄茄无菌苗生长状态对比照片，A为0mg/LIAA、B为0.1mg/L IAA、C为0.2mg/L IAA、D为0.3mg/L IAA、E为0.4mg/L IAA。
表2
由图4和表2结果可知，0.2mg/L浓度的IAA适合类番茄茄茎段生长。
对比例3
本对比例以实施例1步骤三培养的生根幼苗的主根长到4～5cm及3～4片真叶后，将幼苗移栽到五种不同培养基质中，分别用蒸馏水、营养液、蛭石、草炭、质量比为2:1的土壤和蛭石组成的无菌营养土中进行培养，为了保湿在苗上方盖上保鲜膜，覆膜培养3～4d后去掉保鲜膜继续培养，培养的光暗周期为16/8h，光照强度为1600lx，培养温度为25℃。
图5为对比例3不同移栽培养基质下类番茄茄的驯化状态对比图，A为营养液，B为蒸馏水，C为蛭石，D为草炭，E为营养土；由图5可知，将类番茄茄直接移栽到灭过菌的营养土中，类番茄茄植株的长势最好。
对比例4
本对比例提供了四种不同培养基质对多毛番茄组培苗进行培育，具体为：
第一组：用未灭菌蒸馏水进行培养；第二组：用氮、磷和钾的质量比为1:3:2的无菌营养液进行培养，第三组：用蛭石进行培养；第四组用质量比为2:1的土壤和蛭石组成的无菌营养土进行培养。
本对比例种子消毒方法与实施例2相同，消毒清洗后的多毛番茄种子在接种培养基前可用小刀划破步骤一消毒清洗后的种子的种皮从而打破种子休眠；然后将种子播种到四种不同培养基质中，发芽之前组培瓶需用锡纸包裹进行避光处理，在光照强度1600lx，16/8h光暗周期，25℃的培养条件下生长，发芽之后将锡纸去掉，保持光照强度和培养温度继续培养。
图6为对比例4与实施例2五组多毛番茄种子的发芽情况对比照片，A为蒸馏水、B为营养液、C为蛭石、D为营养土、E为1/2MS培养基；统计本对比例与实施例2五组种子的发芽率，发芽率＝发芽种子个数/接种种子总数，结果如表3所示。
表3
由表3数据和图6显示，实施例1组培苗的培养方法得到的多毛番茄发芽率最高，达到95％左右。
对比例5
本对比例以实施例2步骤二获得的长出真叶的14d苗龄无菌苗的2～3cm茎段及生长点部位作为外植体接种到五组不同生根培养基上进行生根培养；生根培养的光照强度为1600lx，光暗周期为16/8h，培养温度为25℃，培养时间为7d左右。
本对比例使用的生根培养基的基础培养基配方为MS培养基4.7mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH 5.7～5.8；五组不同生根培养基在基础培养基配方基础上还含有不同浓度的IAA，IAA浓度依次为0、0.1、0.2、0.3、0.5mg/L；观察五组类多毛番茄端生长状态，结果如图7和表4所示。
图7为对比例5不同IAA浓度下多毛番茄无菌苗生长状态对比照片，A为0mg/L IAA、B为0.1mg/L IAA、C为0.2mg/L IAA、D为0.3mg/L IAA、E为0.4mg/L IAA；
表4
由图7和表4结果可知，0mg/L浓度的IAA适合多毛番茄茎段生长。
对比例6
本对比例以实施例2步骤三培养的生根幼苗的主根长到4～5cm及3～4片真叶后，将幼苗移栽到五种不同培养基质中，分别用蒸馏水、营养液、蛭石、草炭、质量比为2:1的土壤和蛭石组成的无菌营养土中进行培养，为了保湿在苗上方盖上保鲜膜，覆膜培养3～4d后去掉保鲜膜继续培养，培养的光暗周期为16/8h，光照强度为1600lx，培养温度为25℃。
图8为对比例6不同移栽培养基质下多毛番茄的驯化状态对比图，A为营养液，B为蒸馏水，C为蛭石，D为草炭，E为营养土；由图8可知，多毛番茄移栽到营养液上其根系长势最旺盛，经过炼苗3～5天，再转移到灭菌的营养土的多毛番茄培养效果最好。
Claims (10)
1.类番茄茄和多毛番茄的组织培养方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一、种子消毒：种子依次经恒温水浸泡、酒精消毒、无菌水清洗、次氯酸钠消毒、无菌水清洗后备用；
步骤二、组培苗的获得：将步骤一消毒清洗后的种子播种到1/2MS培养基，发芽之前按光暗周期为16/8h培养，发芽之后保持光照强度和培养温度继续培养；
步骤三、生根培养：选取步骤二获得的长出真叶的14d苗龄无菌苗的2～3cm茎段及生长点部位作为外植体接种到生根培养基中进行生根培养；
步骤四、驯化移栽：待幼苗主根长到4～5cm及3～4片真叶后，将幼苗移栽到无菌营养土中驯化培养。
2.根据权利要求1所述类番茄茄和多毛番茄的组织培养方法，其特征在于，步骤一所述恒温水的温度为55℃，所述浸泡时间为4h，所述酒精的体积浓度为75％，所述酒精消毒时间为60s，所述次氯酸钠的体积浓度为10％，所述次氯酸钠消毒时间为10min。
3.根据权利要求1或2所述类番茄茄和多毛番茄的组织培养方法，其特征在于，步骤一所得消毒清洗后的种子在接种前用小刀划破种皮从而打破种子休眠状态。
4.根据权利要求3所述类番茄茄和多毛番茄的组织培养方法，其特征在于，步骤二所述1/2MS培养基的配方为MS2.35mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH5.7～5.8。
5.根据权利要求4所述类番茄茄和多毛番茄的组织培养方法，其特征在于，步骤二所述光照强度为1600lx，培养温度为25℃。
6.根据权利要求5所述类番茄茄和多毛番茄的组织培养方法，其特征在于，步骤三用于类番茄茄组织培养的生根培养基配方为MS培养基4.7mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L十IAA0.2mg/L，PH5.7～5.8；用于多毛番茄组织培养的生根培养基配方为MS培养基4.7mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH5.7～5.8。
7.根据权利要求6所述类番茄茄和多毛番茄的组织培养方法，其特征在于，步骤三所述生根培养的光照强度为1600lx，光暗周期为16/8h，培养温度为25℃，培养时间为7d。
8.根据权利要求7所述类番茄茄和多毛番茄的组织培养方法，其特征在于，步骤四所述无菌营养土包括质量比为2:1的土壤和蛭石，所述驯化培养的光暗周期为16/8h，培养温度为25℃，光照强度为1600lx。
9.根据权利要求8所述类番茄茄和多毛番茄的组织培养方法，其特征在于，步骤四移栽类番茄茄幼苗时将幼苗直接移栽到无菌营养土中；移栽多毛番茄幼苗时先将幼苗移栽到无菌营养液中炼苗3～5天，再转移到无菌营养土中。
10.根据权利要求9所述类番茄茄和多毛番茄的组织培养方法，其特征在于，所述无菌营养液所含氮、磷和钾的质量比为1:3:2。
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