CN108040873A - 醋栗番茄pi128216的组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种醋栗番茄PI128216的组织培养方法。所述的方法包括：(1)种子的灭菌及萌发；(2)愈伤组织的诱导及不定芽的分化；(3)诱导生根等步骤。本发明以鲜有报道且富含抗性基因的野生醋栗番茄PI128216为材料，通过优化激素组合，改善培养条件，建立了一套高效的番茄再生体系。通过该再生体系可快速实现大量醋栗番茄PI128216植株的扩繁，同时也可以实现醋栗番茄PI128216的优质栽培，为建立醋栗番茄PI128216的组织培养方法提供了有效技术手段。

Description

醋栗番茄PI128216的组织培养方法
技术领域
本发明涉及一种番茄的组织培养方法，特别涉及一种醋栗番茄PI128216的组织培养方法。本发明属于农业技术领域。
背景技术
番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)作为模式经济作物备受研究者关注，伴随着番茄基因组测序工作的完成，利用基因工程技术改良番茄性状成为必然趋势，而番茄再生体系成功的建立是利用遗传转化技术改良番茄品种(如抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆、果实的延熟保鲜等)的重要前提。虽然目前以子叶、下胚轴为外植体建立番茄再生系统已取得成功，但番茄再生体系具有基因依赖性，不同基因型番茄的生理特性、生长条件均不相同，因此不能盲目套用他人的研究结果，需对每个特定番茄品种再生体系的建立进行相应研究，本发明以鲜有报道且富含抗性基因的野生醋栗番茄PI128216为材料，通过优化激素组合，改善培养条件，以期建立一套高效的番茄再生体系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是建立一种醋栗番茄PI128216的组织培养方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明以野生醋栗番茄PI128216为研究对象，对其幼嫩的子叶和下胚轴进行离体培养，研究不同激素浓度及配比对愈伤组织诱导培养、不定芽分化培养和诱导生根培养的影响。试验发现对醋栗番茄PI128216种子的灭菌，用3％NaClO灭菌5min效果为最佳；最适宜诱导子叶和下胚轴愈伤组织分化的培养基为:MS+0.2mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA；最适宜诱导不定芽分化的培养基为：MS+0.1mg/L IAA+3.0mg/L6-BA；最适宜诱导再生苗的生根的培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA。通过本发明建立的醋栗番茄PI128216的组织培养方法，可快速实现大量的植株扩繁，同时也可以实现醋栗番茄PI128216的优质栽培，为植物再生体系研究以及番茄遗传转化体系的构建提供技术手段。
具体的，本发明的一种醋栗番茄PI128216的组织培养方法，包括以下步骤：
(1)将颗粒饱满的醋栗番茄PI128216种子放入无菌水中浸泡4～5h后，用75v/v％酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，然后用3w/v％NaClO溶液浸泡3-5min，之后再用无菌水将种子冲洗3次，用无菌纸将种子表面水分吸干；最后将种子接入种子萌发培养基中，放入人工气候室进行培养获得无菌苗；
(2)愈伤组织的诱导及不定芽的分化
将培养6～8d的无菌苗放入超净工作台内，取子叶和下胚轴进行诱导，将子叶用刀片切成0.4-0.6cm2的小方块，子叶背面向下平铺在愈伤组织培养基中，将下胚轴切成0.5-1.5cm长的小段，接种在愈伤组织培养基中，以诱导愈伤组织的发生；将出愈好的愈伤组织移植到诱导不定芽分化培养基上，之后再进行光照培养，诱导不定芽的分化，每隔10d继代一次；
(3)诱导生根
观察不定芽，当不定芽长至2～3cm时，在超净工作台内用刀片自芽基部切下，将再生苗接种于诱导生根培养基中进行诱导生根，得到醋栗番茄PI128216的组织培养幼苗。
在所述的培养方法中，优选的，步骤(1)中3w/v％NaClO溶液浸泡的时间为5min。
在所述的培养方法中，优选的，步骤(1)所述的种子萌发培养基为含有6～7g/L琼脂的1/2MS培养基。
在所述的培养方法中，优选的，步骤(2)中所述的愈伤组织培养基为含有0.2mg/LIAA、2.0mg/L 6-BA、20g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH＝6.8的MS培养基。
在所述的培养方法中，优选的，步骤(2)中所述的诱导不定芽分化培养基为含有0.1mg/L IAA、3.0mg/L 6-BA、20g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH＝6.8的MS培养基。
在所述的培养方法中，优选的，步骤(3)中所述的诱导生根培养基为含有0.1mg/LNAA、6～7g/L琼脂的1/2MS培养基。
在所述的培养方法中，优选的，人工气候培养室的培养温度为25℃±1℃，光照时间16h/天，光照强度2000lx。
在所述的培养方法中，优选的，用于醋栗番茄PI128216的组织培养的外植体为子叶。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明以鲜有报道且富含抗性基因的野生醋栗番茄PI128216为材料，通过优化激素组合，改善培养条件，以期建立一套高效的番茄再生体系。通过该再生体系可快速实现大量醋栗番茄PI128216植株的扩繁，同时也可以实现醋栗番茄PI128216的优质栽培，为建立醋栗番茄PI128216的组织培养方法提供了有效技术手段。
附图说明
图1为采用3w/v％NaClO灭菌5min的种子的萌发以及染菌情况；
图2为采用0.1w/v％升汞灭菌3min的种子的萌发以及染菌情况；
图3A为采用愈伤组织培养基(MS+0.2mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA)得到的子叶愈伤；
图3B为采用愈伤组织培养基(MS+0.2mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA)得到的下胚轴愈伤；
图4A为采用愈伤组织培养基(MS+0.1mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA)得到的子叶愈伤；
图4B为采用愈伤组织培养基(MS+0.1mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA)得到的下胚轴愈伤；
图5A为采用愈伤组织培养基(MS+0.3mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA)得到的子叶愈伤；
图5B为采用愈伤组织培养基(MS+0.3mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA)得到的下胚轴愈伤；
图6A为在不定芽分化培养基(MS+0.1mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA)上子叶诱导形成的不定芽；
图6B在不定芽分化培养基(MS+0.1mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA)上下胚轴诱导形成的不定芽；
图7A在不定芽分化培养基(MS+0.5mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA)上子叶诱导形成的不定芽；
图7B在不定芽分化培养基(MS+0.5mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA)上下胚轴诱导形成的不定芽；
图8A在不定芽生根培养基(1/2MS+0.1mg/L NAA)上诱导的初期生根情况；
图8B在不定芽生根培养基(MS+0.1mg/L NAA)上诱导的初期生根情况；
图9在不同的不定芽生根培养基上的诱导生根比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1醋栗番茄PI128216组织培养方法的建立
1材料及方法
1.1材料
1.1.1试验品种
醋栗番茄PI128216来自中国农业大学园艺学院蔬菜分子遗传育种实验室。
1.1.2培养基
种子萌发培养基：1/2MS培养基(含6～7g/L琼脂，大量元素减半，其他成分不变)
愈伤组织培养基和不定芽分化培养基：在MS培养基中(含20g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH＝6.8)添加不同浓度的IAA(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L)和不同浓度的6-BA(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/L)组合。
诱导生根培养基：在1/2MS和MS培养基(含6～7g/L琼脂)中分别添加不同浓度的NAA(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L)。
1.1.3培养条件
人工气候培养室(培养温度25℃±1℃，光照时间16h/天，光照强度2000lx)
1.2试验方法
1.2.1无菌苗的获取
挑选400粒颗粒饱满的醋栗番茄PI128216种子平均分成四份，提前将种子放入无菌水(在高压灭菌锅中灭过菌的蒸馏水)中浸泡4～5h。接种前，先将超净工作台提前半小时打开，用紫外灯进行杀菌。接种时，将四份种子置于超净工作台内，先用75v/v％酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，然后用3w/v％NaClO浸泡5min、3％NaClOw/v浸泡3min、0.1w/v％升汞浸泡灭菌5min、0.1w/v％升汞浸泡3min四种处理方式处理番茄种子，之后再用无菌水将种子分别冲洗3次，用无菌纸(在高压灭菌锅中灭过菌的滤纸)将种子表面水分吸干；最后将种子接入种子萌发培养基中，每种灭菌方法接种10个培养基，每个培养基接种10粒种子。放入人工气候室进行培养，培养6～8d后即可获得无菌苗。
1.2.2愈伤组织的诱导及不定芽的分化
将生长6～8d的无菌苗放入超净工作台内，取子叶和下胚轴进行诱导试验。将子叶用刀片切成约0.5cm2的小方块，子叶背面向下平铺在愈伤组织培养基中；将下胚轴切成1cm左右长的小段，接种在相同培养基内。每个培养基都接种5个外植体，以诱导愈伤组织的发生；将出愈好的愈伤组织移植到诱导不定芽分化培养基上，之后再进行光照培养，诱导不定芽的分化，每隔10d左右继代一次，观察并记录试验数据。
1.2.3诱导生根
观察不定芽，当不定芽长至2～3cm左右时，在超净工作台内用刀片自芽基部切下，将再生苗接种于诱导生根培养基中进行诱导生根。每隔3天观察记录生根情况。
1.2.4数据统计
发芽率(％)＝(发芽种子个数/接种总种子数)×100％
愈伤组织诱导率(％)＝(诱导出愈伤组织的外植体个数/接种总外植体数)×100％
不定芽的诱导率(％)＝(分化出不定芽的外植体个数/接种总外植体数)×100％
用Excel进行数据统计和分析。
2结果与分析
2.1不同消毒剂对杀菌效果的影响
从表1中可以看出，采用不同的试剂及浸泡不同的时间对醋栗番茄PI128216种子的灭菌效果和萌发均有影响。用3w/v％NaClO溶液灭菌5min种子的发芽率为81％，没有杂菌污染，如图1所示种子基本都能正常发芽且无染菌；用3w/v％NaClO溶液灭菌3min种子的有较高的发芽率为90％，但同时存在灭菌不彻底等问题，染菌率为7％；用0.1w/v％升汞无论是灭菌3min还是灭菌5min都能很好地控制染菌率，但是用0.1w/v％升汞灭菌5min同时抑制了种子的萌发，发芽率为0；灭菌3min是也仅有少量的种子萌发，发芽率仅16％，如图2所示只有少量种子发芽。因此，可以选择用3w/v％NaClO溶液对种子进行灭菌5min来获得醋栗番茄PI128216的无菌苗。
表1、不同消毒剂对杀菌效果的影响
2.2外植体的筛选、激素浓度及配比对愈伤组织的影响
取醋栗番茄PI128216无菌苗的子叶和下胚轴为外植体做比较试验，试验结果发现子叶和下胚轴愈伤组织的发生时间不同，下胚轴的出愈要早于子叶1～2d开始发生膨大。通过观察发现，当子叶接种培养12d左右时开始从切口处逐渐向内卷起，逐渐出现大量易碎的绿色胚状体；不同激素浓度及配比对子叶的诱导现象也有所不同，如图所示3A(MS+0.2mg/LIAA+2.0mg/L 6-BA)、图4A(MS+0.1mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA)和图5A(MS+0.3mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA)现象分别是：致密绿色愈伤组织、褐色愈伤组织和少量绿色愈伤组织；下胚轴下端在10d左右开始出愈膨大，现象与子叶出愈现象类似如图3B(MS+0.2mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA)、图4B(MS+0.1mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA)和图5B(MS+0.3mg/L IAA+2.0mg/L6-BA)。在人工气候室培养2～3周可以明显发现子叶和下胚轴都形成了较大块的愈伤组织，有的子叶愈伤组织可以观察到不定芽也开始分化出来。
从表2的统计数据中可以看出，试验的子叶和下胚轴各25个培养基均能进行脱分化形成愈伤组织，并且具有较高的出愈率，子叶的出愈率为100％，而下胚轴的出愈率也可以达到90％以上，在MS+0.2mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA培养基中子叶和下胚轴的出愈率可以达到100％。比较统计数据可知：可以优先选择MS+0.2mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA作为醋栗番茄PI128216的愈伤组织分化的最适诱导培养基。在该愈伤组织培养基中形成的愈伤组织较致密，颜色深绿。
利用子叶和下胚轴诱导不定芽的试验发现：在相同处理的培养基上，虽然下胚轴先于子叶出愈膨大形成愈伤组织，但是下胚轴诱导形成不定芽的时间较长而子叶分化出不定芽的时间明显较短，出芽率也要明显高于下胚轴的出芽率，形成的不定芽在生长势方面较下胚轴要好。因此，在选择醋栗番茄PI128216的外植体时，可优先选择子叶为外植体。
表2、不同浓度的IAA和6-BA组合对愈伤组织诱导的影响
2.3激素浓度及配比对不定芽诱导的影响
将愈伤组织移植到诱导不定芽分化的培养基上，在人工气候室继续进行培养，由子叶和下胚轴脱分化形成的愈伤组织可以再分化生成不定芽。培养三周后，子叶上开始产生大量的不定芽，如图6A(MS+0.1mg/L IAA+3.0mg/L 6-BA)和图7A(MS+0.5mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA)；而下胚轴产生的愈伤组织只在下端产生少量的不定芽如图6B(MS+0.1mg/LIAA+3.0mg/L 6-BA)和图7B(MS+0.5mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA)。
通过表3可知，每种激素浓度及配比对不定芽生成的影响都存在明显的差异，在MS+0.1mg/L IAA+3.0mg/L 6-BA的培养基上子叶和下胚轴分化成不定芽分化率较高且用的时间较短。在该培养基上不定芽生长较快，长势较好并且随着时间的推移不定芽的数目越来越多。同时还可以发现在0.1mg/L IAA和1.0～5.0mg/L 6－BA激素浓度配比下不定芽的分化率维持在较高的水平，随着两种激素浓度及配比的增大，不定芽分化率出现下降，不定芽生长较慢。
综合分析最适于醋栗番茄PI128216子叶和下胚轴的不定芽分化的培养基为：MS+0.1mg/L IAA+3.0mg/L 6－BA，可以通过建立这样的激素浓度及配比体系来快速获得大量醋栗番茄PI128216的不定芽。
表3、不同浓度的IAA和6-BA组合对不定芽分化的影响
2.4NAA浓度对生根的影响
当再生苗的不定芽长到2～3cm时，在超净工作台中用刀片自牙基部切下接种到诱导生根的培养基上，放入人工气候室内继续培养。培养一周左右，开始长出不定根，然后进行数据统计。
由表4可知，发现未添加NAA激素的1/2MS和MS培养基的在长时间的培养下仍能产生少量的不定根，说明不定芽在生长过程中可以产生促进生根的激素，但生成根较细，生命力较弱，长势较差。添加不同浓度NAA激素的培养基都有生根但差异较大，在MS培养基中随着NAA浓度的增加生根数在逐渐增多，根系长势由细长逐渐变粗短。在1/2MS培养基中随着NAA浓度的增加生根数先增加后出现减少的趋势，根系长势长且伴有须根如图8A(1/2MS+0.1mg/L NAA)和图8B(MS+0.1mg/L NAA)，生命力较强。综合比较图9可以看出表4中A1的生根及生长状况较好，因此最适宜不定芽生根的培养基可以确定为：1/2MS+0.1mg/L NAA。
表4、培养基及不同浓度NAA浓度对生根的影响

Claims (8)

1.一种醋栗番茄PI128216的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将颗粒饱满的醋栗番茄PI128216种子放入无菌水中浸泡4～5h后，用75v/v％酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，然后用3w/v％NaClO溶液浸泡3-5min，之后再用无菌水将种子冲洗3次，用无菌纸将种子表面水分吸干；最后将种子接入种子萌发培养基中，放入人工气候室进行培养获得无菌苗；
(2)愈伤组织的诱导及不定芽的分化
将培养6～8d的无菌苗放入超净工作台内，取子叶和下胚轴进行诱导，将子叶用刀片切成0.4-0.6cm2的小方块，子叶背面向下平铺在愈伤组织培养基中，将下胚轴切成0.5-1.5cm长的小段，接种在愈伤组织培养基中，以诱导愈伤组织的发生；将出愈好的愈伤组织移植到诱导不定芽分化培养基上，之后再进行光照培养，诱导不定芽的分化，每隔10d继代一次；
(3)诱导生根
观察不定芽，当不定芽长至2～3cm时，在超净工作台内用刀片自芽基部切下，将再生苗接种于诱导生根培养基中进行诱导生根，得到醋栗番茄PI128216的组织培养幼苗。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中3w/v％NaClO溶液浸泡的时间为5min。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)所述的种子萌发培养基为含有6～7g/L琼脂的1/2MS培养基。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述的愈伤组织培养基为含有0.2mg/L IAA、2.0mg/L 6-BA、20g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH＝6.8的MS培养基。
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述的诱导不定芽分化培养基为含有0.1mg/L IAA、3.0mg/L 6-BA、20g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH＝6.8的MS培养基。
6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)中所述的诱导生根培养基为含有0.1mg/L NAA、6～7g/L琼脂的1/2MS培养基。
7.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，人工气候培养室的培养温度为25℃±1℃，光照时间16h/天，光照强度2000lx。
8.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，用于醋栗番茄PI128216的组织培养的外植体为子叶。
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