CN109156338B - 一种通过胚挽救获得甜菊自交后代的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种通过胚挽救获得甜菊自交后代的方法，具体包括如下步骤：亲本选用因幼胚败育无法得到自交种子的甜菊品种；人工辅助授粉自交；剥取授粉后5～7天的幼胚；将幼胚进行离体培养，得到S1幼苗；移栽S1幼苗得到完整植株。本发明利用胚挽救技术克服了甜菊自交不亲和障碍，获得了甜菊自交后代，使部分性状纯合，并且可通过多代自交获得纯合体和自交系，可有效提高甜菊育种效率，加速甜菊品种选育进程。
Description
技术领域
本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种通过胚挽救获得甜菊自交后代的方法。
背景技术
甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)属菊科甜菊属，是新兴的糖料作物，其叶片所含甜菊糖苷具有高甜度低热量(甜度为蔗糖的300倍以上，热量仅为蔗糖的1/300)是天然低卡甜味剂，在食品、饮料、医药、化工等领域应用广泛。甜菊种质资源研究和优良新品种培育对甜菊产业的发展十分重要。然而，由于甜菊具自交不亲和性，其天然自交结实率最高仅为0.5％，长期杂交导致其遗传背景复杂，有性繁殖后代性状严重分离，给遗传研究和育种工作带来很多困难，因此创建纯合体和自交系，对创制优良新种质和培育新品种具有重要意义。
幼胚挽救离体培养技术是通过人为改善幼胚发育条件，提供幼胚发育必需营养，促使幼胚发育成植株，是目前克服受精后发育障碍的有效方法，然而在甜菊中尚无相关研究报道。本发明利用幼胚挽救离体培养技术，克服甜菊自交受精后障碍，可获得大量自交后代，为甜菊遗传育种研究和新种质创制奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过胚挽救获得甜菊自交后代的方法，有效克服了甜菊自交胚败育的不亲和障碍，解决了甜菊自交结实率低的问题。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
一种通过胚挽救获得甜菊自交后代的方法，包括如下步骤：
1)亲本材料准备：选用因幼胚败育而无法获得自交种子的品种，扦插繁殖以备种植；
2)隔离和人工辅助授粉：
套袋隔离：在甜菊开花时去掉已开放花朵后，进行硫酸纸套袋隔离和人工辅助授粉；所述人工辅助授粉是指在上午9～12时解开硫酸纸袋，将同株或同品种的不同花枝相互靠近并摩擦促进传粉；地理隔离：不同品种种植区相距20km以上，人工辅助授粉时采用棍棒贴植株上端轻轻横擦而过或手拍，振动花序，使花粉散落。
3)幼胚的剥取：取步骤2)自交授粉后5～7天的头状花序，用清水进行表面冲洗，然后在超净台中进行消毒并用无菌水漂洗，最后在无菌条件下取出果皮变黑的瘦果，剥出幼胚。
4)幼胚挽救离体培养：在无菌条件下，将步骤3)得到的幼胚接种到幼胚萌发培养基中，在温度25～28℃、光周期12h/d、光照度1500～2000Lux条件下离体培养，幼胚萌发得到幼苗。
5)移栽：当步骤4)得到的幼苗长至2～3对真叶时从培养基中取出，清洗根部后移栽到育苗盘中，保鲜膜覆盖保湿，置于人工气候箱中培养，一周后揭开保鲜膜，成活后移栽室外。
上述方案中，步骤1)所述亲本具有因受精后障碍导致幼胚发育受阻无法自然结实的特性，本方法不适用于因受精前障碍导致无法形成合子胚的甜菊品种。
上述方案中，步骤3)所述幼胚取自自交授粉后生长发育了5～7天的幼嫩瘦果。
上述方案中，所述幼胚萌发培养基为MS培养基，含40g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH5.8。
上述方案中，所述适宜移栽的幼苗具2～3对真叶，离体培养时间为20～25d。
上述方案中，所述S1植株的移栽种植方法为：将步骤4)得到的自交S1植株从培养基中取出，洗净附着在根部表面的培养基，将其移栽到育苗盘中，株间距1.5～2.0cm，移栽基质为泥炭∶蛭石∶珍珠岩＝1∶1∶1，用喷壶喷透水，保鲜膜覆盖保湿，置于人工气候箱中培养，设置温度25～28℃、光周期12h/d、湿度60％、光照度1500～2000Lux，一周后揭开保鲜膜，成活后带土移栽。
甜菊纯合体的培养和自交系的创建，对甜菊遗传研究和育种工作都具有重大意义，然而甜菊具自交不亲和性，其天然自交结实率最高仅为0.5％。幼胚挽救离体培养技术是通过人为改善幼胚发育条件，提供幼胚发育必需营养，促使幼胚发育成植株，是目前克服受精后发育障碍最有效的方法。因此，本发明所述的利用胚挽救技术克服甜菊受精后障碍获得自交后代的方法具有实际的应用价值。
本发明的有益效果：
1)本发明利用幼胚挽救技术克服甜菊自交不亲和受精后障碍，成功获得了大量自交S1后代，具有实际的应用价值。
2)本发明通过选择合适的幼胚挽救接种时期和离体培养条件，自交幼胚经离体培养可直接萌发，经缓苗移栽后获得S1植株，并且可以对自交S1植株进行长期保存和繁殖，为甜菊纯合种质创制提供了便利条件。
3)本发明提供了一套完整的利用胚挽救技术获得甜菊自交后代的方法，并且通过此方法可进行多代自交以获得纯合体和自交系，对甜菊遗传研究和育种工作都具有重大意义。
附图说明
图1为甜菊幼胚挽救离体萌发的图片。
图2为获得的部分S1代植株，叶色显著差异。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
一种通过胚挽救获得甜菊自交后代的方法，包括如下步骤：(1)亲本材料准备：亲本选用总甜菊糖苷含量高、综合性状较好的栽培品种‘中山8号’，该品种自交有胚率高达16％，但因幼胚败育其天然自交结实率为0。2017年5月扦插繁殖‘中山8号’，生根移栽花盆中，常规水肥管理；
(2)自交：在甜菊‘中山8号’开花时去掉已开放的花朵后，用硫酸纸套袋隔离，随后每隔一天进行一次人工辅助授粉；所述人工辅助授粉是将同品种揭开硫酸纸袋的花序靠近，相互碰擦，将花粉涂抹到柱头上；
(3)胚珠的剥取：分别选择自交授粉后不同天数的头状花序，用清水进行表面冲洗，然后在超净台中用75％酒精消毒30秒，再用0.1％HgCl2消毒3～4分钟，然后用无菌水漂洗2～3次，每次3～4分钟，并在灭菌纸上晾干；在灭菌纸上用镊子取出瘦果，挑选果皮变黑的瘦果，轻轻剥出胚珠。
(4)幼胚挽救离体培养：在无菌条件下，将步骤3)得到的胚珠接种到幼胚萌发培养基中，在温度25～28℃、光周期12h/d、光照度1500～2000Lux条件下离体培养3～5天，幼胚即可萌发(见图1)；所述幼胚萌发培养基是在MS基本培养基中添加40g/L蔗糖和6g/L琼脂，培养基的pH值为5.8；
(5)自交S1植株的获得：步骤(4)中幼胚在萌发培养基中继续培养至2～3对真叶，2～3条根；所述培养时间为20～25天。
(6)自交S1植株的移栽：将步骤(5)得到的自交S1植株从培养基中取出，洗净附着在根部表面的培养基，将其移栽到育苗盘中，移栽基质为泥炭∶蛭石∶珍珠岩＝1∶1∶1，用喷壶喷透水，保鲜膜覆盖保湿，置于人工气候箱中培养，设置温度25～28℃、光周期12h/d、湿度60％、光照度1500～2000Lux，一周后揭开保鲜膜，成活后带土移栽室外。
实施例2
本实施例所述通过胚挽救获得甜菊自交后代的方法与实施例1大体相同，不同点在于：(1)亲本材料为甜菊苷含量较高的甜菊品种‘中山5号’；(2)所述自交在地理隔离条件下进行，选扦插繁殖的‘中山5号’30株，定植于大田，5株×6行，株间距约30cm，附近20km内没有甜菊种植，移栽后打顶促进分枝；(3)所述人工辅助授粉是在8月下旬至9月上旬‘中山5号’花期，每天上午10-11时，用棍棒贴植株上端轻轻横擦，振动花序，使花粉散落；(4)所述胚珠的剥取是采集开花后10天左右的头状花序带回室内，从花序中剥取幼嫩瘦果，挑选果皮变黑且饱满的幼果，用清水进行表面冲洗，然后在超净台中用75％酒精消毒30秒，再用0.1％HgCl2消毒3～4分钟，接着用无菌水漂洗2～3次，每次3～4分钟，并在灭菌纸上晾干；在灭菌纸上用解剖针轻轻剥出胚珠，进行离体培养。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种通过胚挽救获得甜菊自交后代的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)亲本材料准备：选用因幼胚败育而无法获得自交种子的甜菊品种，扦插繁殖以备种植；
2)隔离和人工辅助授粉自交：
套袋隔离：在甜菊开花时去掉已开放花朵后，进行硫酸纸套袋隔离和人工辅助授粉；所述人工辅助授粉是指在上午9～12时解开硫酸纸袋，将同株或同品种的不同花枝相互靠近并摩擦促进传粉；地理隔离：不同品种种植区相距20km以上，人工辅助授粉时采用棍棒贴植株上端轻轻横擦而过或手拍，振动花序，使花粉散落；
3)幼胚的剥取：取步骤2)自交授粉后5～7天的头状花序，用清水进行表面冲洗，然后在超净台中进行消毒并用无菌水漂洗，最后在无菌条件下取出果皮变黑的瘦果，剥出幼胚；
4)幼胚挽救离体培养：在无菌条件下，将步骤3)得到的幼胚接种到萌发培养基中，在温度25～28℃、光周期12h/d、光照度1500～2000Lux条件下离体培养，幼胚萌发得到幼苗；所述幼胚萌发培养基为MS培养基，含40g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH5.8；
5)移栽：当步骤4)得到的幼苗长至2～3对真叶时从培养基中取出，清洗根部后移栽到育苗盘中，保鲜膜覆盖保湿，置于人工气候箱中培养，一周后揭开保鲜膜，成活后移栽室外。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述亲本具有因受精后障碍导致幼胚发育受阻无法自然结实的特性，本方法不适用于因受精前障碍导致无法形成合子胚的甜菊品种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述幼胚取自自交授粉后生长发育了5～7天的幼嫩瘦果，有胚的瘦果果皮变黑，无胚的瘦果果皮仍为绿色；因甜菊为无限花序，持续开花，此步骤可以持续进行至花期结束。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述幼苗具2～3对真叶，离体培养时间为20～25d。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述幼苗的移栽方法为：将步骤4)得到的幼苗从培养基中取出，洗净附着在根部表面的培养基，将其移栽到育苗盘中，株间距1.5～2.0cm，移栽基质为泥炭∶蛭石∶珍珠岩＝1∶1∶1，用喷壶喷透水，保鲜膜覆盖保湿，置于人工气候箱中培养，设置温度25～28℃、光周期12h/d、湿度60％、光照度1500～2000Lux，一周后揭开保鲜膜，成活后带土移栽。
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| CN110073981B (zh) * | 2019-06-17 | 2022-03-29 | 南京林业大学 | 一种利用胚拯救获得杨树杂交苗的方法 |
| CN110447522B (zh) * | 2019-09-10 | 2022-06-21 | 江苏省农业科学院 | 一种利用幼胚进行映山红亚属植物育苗的方法 |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN1985575A (zh) * | 2006-09-27 | 2007-06-27 | 王其斌 | 系统选育甜菊无性系父母本培育杂交新品种的方法 |
| CN105104186A (zh) * | 2015-07-10 | 2015-12-02 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种和栽培种远缘杂交后代的方法 |
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2018
- 2018-09-26 CN CN201811199754.9A patent/CN109156338B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
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| Plant growth regulators affecting in vitro cultivation of Stevia rebaudiana;Ibrahim A. Ibrahim 等;《Sugar Tech》;20081231;第10卷(第3期);第254-259页 * |
| 菊花二倍体野生种与栽培种间杂种的幼胚拯救;李辛雷等;《林业科学》;20061130;第42卷(第11期);第42-46页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN109156338A (zh) | 2019-01-08 |
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