KR101634349B1 - 체세포배 발생 및 발아체 유도 기술을 이용한 가래나무의 무성번식 방법 - Google Patents

체세포배 발생 및 발아체 유도 기술을 이용한 가래나무의 무성번식 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 채취한 가래나무 종자를 절단하여 종자배의 자엽 절편체를 수득하는 단계, 상기 자엽 절편체를 체세포배 유도용 배지에 치상하여 체세포배를 유도하는 단계, 및 상기 유도된 체세포배를 배양하여 체세포배를 발아시켜 신초 및 뿌리를 발생시키는 단계를 포함하는 가래나무의 무성번식 방법에 관한 것으로, 본 발명의 무성번식 방법에 의하면, 단시간 내에 가래나무의 클론묘 생산이 가능하고, 차후에는 병충해 등에 강한 외래 유전자의 삽입 방식으로 가래나무의 신품종 육종에도 동일하게 적용될 수 있다.

Description

체세포배 발생 및 발아체 유도 기술을 이용한 가래나무의 무성번식 방법{Method for vegetative propagation of Juglans mandshurica using somatic embryogenesis technique}
본 발명은 가래나무의 무성번식 방법에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 채취한 가래나무 종자를 절단하여 종자배의 자엽 절편체를 수득하는 단계, 상기 자엽 절편체를 체세포배 유도용 배지에 치상하여 체세포배를 유도하는 단계, 및 상기 유도된 체세포배를 배양하여 체세포배를 발아시켜 신초 및 뿌리를 발생시키는 단계를 포함하는 가래나무의 무성번식 방법에 관한 것이다.
가래나무(Juglans mandshurica)는 과실 뿐만 아니라 목재로서의 효용가치가 매우 높은 수종이다. 이러한 우수품종의 가래나무를 육종하기 위해선 실생 번식, 접목 등의 재래육종 기술이 있지만, 클론화가 가능한 생물공학적인 체세포배 발생기술을 이용하여 우수 품종의 폿트 묘를 생산하는 것이 가능하다.
캐나다, 뉴질랜드 등과 같은 임업 선진국에서는 유용 침엽수종을 대량 생산하기 위한 무성증식 기술의 일환으로 이미 오래전부터 체세포배 발생방법을 응용한 신품종 육성에 많은 연구가 이루어져, 현재에는 이 분야에서 우위를 달리고 있다.
조직배양 기술 중, 아배양을 이용한 호두나무 속(Juglans)의 연구로서는 J. regia 실생묘 줄기로부터 다경 유도 및 발근 유도에 관하여 보고된 이래(Commun. Inst. For. Cech. 12:255-271., 1981), J. nigra(Proc. 7th North Amer. For. Biol. Workshop pp 224-230, 1982), J. sinensis (Res. Rep. Inst. For. Gen. Kor. 26:63-68, 1990) 및 J. regia × hindsii (HortSci. 19:507-509., 1984) 등에서 이루어졌으나, 기내에서 유도된 줄기의 발근 및 순화과정 등에서 어려움이 있어 완전한 발근묘까지의 분화율이 저조하였다.
최근 체세포배의 대량배양을 통한 식물체 증식연구가 활발히 이루어 지고 있는 바, 호두나무 속의 체세포배 유도 연구는 J. nigra (Plant Cell Rep. 14:799-803, 1995), J. regia (Plant Cell. Rep. 7:301-304, 1988) 및 J. cinerea ( Can. J For. Res. 23:835-838, 1993) 등의 수종에서 이루어져 있으나, 가래나무에 관한 연구는 전혀 보고된 바가 없다.
호두나무속 수종의 체세포배 연구는 체세포배 유기에 관한 기술개발보다는 유도된 체세포배를 정상적인 소식물체로 발아시키고, 최종적으로는 식물체를 토양에 이식시켜 완전한 식물체로 재분화에 관한 내용이 대부분이다.
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 체세포배 발생을 통하여 우수한 형질의 가래나무를 대량생산할 수 있는 가래나무의 무성번식 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, (a) 채취한 가래나무 종자를 절단하여 종자배의 자엽 절편체를 수득하는 단계, (b) 상기 자엽 절편체를 체세포배 유도용 배지에 치상하여 체세포배를 유도하는 단계, 및 (c) 상기 유도된 체세포배를 배양하여 체세포배를 발아시켜 신초 및 뿌리를 발생시키는 단계를 포함하는 가래나무의 무성번식 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 무성번식된 가래나무를 제공한다.
본 발명에 의한 가래나무의 무성번식 방법은 단시간 내에 가래나무의 클론묘 생산이 가능하고, 차후에는 병충해 등에 강한 외래 유전자의 삽입 방식으로 가래나무의 신품종 육종에도 동일하게 적용될 수 있다.
도 1은 가래나무 미숙 종자의 자엽으로부터 유도한 미숙 체세포배를 나타낸 사진이다.
도 2는 다수 발생된 가래나무의 체세포배 덩이를 나타낸 사진이다.
도 3은 정상적인 자엽 단계의 가래나무의 체세포배 유도를 나타낸 사진이다.
도 4는 다양한 형태의 가래나무 체세포배를 유도한 결과를 나타낸 사진이다.
도 5는 초기 단계의 가래나무의 발아묘를 나타낸 사진이다.
도 6은 자엽 및 뿌리가 발생된 가래나무의 발아묘를 나타낸 사진이다.
본 발명은 (a) 채취한 가래나무 종자를 절단하여 종자배의 자엽 절편체를 수득하는 단계, (b) 상기 자엽 절편체를 체세포배 유도용 배지에 치상하여 체세포배를 유도하는 단계, 및 (c) 상기 유도된 체세포배를 배양하여 체세포배를 발아시켜 신초 및 뿌리를 발생시키는 단계를 포함하는 가래나무의 무성번식 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 가래나무의 무성번식 방법에서, 상기 가래나무 종자의 채취는 미숙자엽에 수분을 한 후 8주~10주, 바람직하게는 9주에 수행할 수 있다.
본 발명에 의한 가래나무의 무성번식 방법은 상기 (a) 단계에서 상기 채취한 루브라참나무 종자의 표면 살균을 하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 가래나무의 무성번식 방법에서, 상기 표면 살균은 상기 종자의 표면을 세척한 후, 에탄올에 0.5분~5분간 침지한 다음, 차아염소산나트륨 용액에 10분~20분간 살균하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 가래나무의 무성번식 방법에서, 상기 체세포배 유도용 배지는 하기 표 1과 같은 성분 및 함량으로 조성되는 Driver and Kuniyuki Walnut(DKW, 1984) 기본 배지에, 인돌부틸산(IBA) 0.1mg/L~2.0mg/L 및 사이토키닌(cytokinin) 0.5mg/L~5.0mg/L을 포함할 수 있다.
Figure 112014063174459-pat00001
본 발명에 의한 가래나무의 무성번식 방법에서, 상기 사이토키닌은 6-벤질아미노퓨린(BA), 티디아주론(thidiaziron) 및 카이네틴(kinetin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 의한 가래나무의 무성번식 방법에서, 상기 (c) 단계의 체세포배 배양은, 상기 유도된 체세포배를 0.1~1.0mg/L의 6-벤질아미노퓨린이 첨가된 상기 Driver and Kuniyuki Walnut(DKW) 기본 배지에서 3~5℃의 온도로 7~9주간 암배양한 후, 0.1%(w/w)~1.0%(w/w)의 활성탄이 첨가된 1/2 Driver and Kuniyuki Walnut(DKW) 배지에서 3~5주간 광배양할 수 있다.
본 발명에 의한 가래나무의 무성번식 방법에서, 상기 (c) 단계의 체세포배 배양은, 상기 유도된 체세포배를 상기 Driver and Kuniyuki Walnut(DKW) 기본 배지에서 3~5℃의 온도로 5~7주간 암배양한 후, 건조시켜 6~8일간 암배양한 다음, 0.1%(w/w)~0.3%(w/w)의 6-벤질아미노퓨린 및 2%(w/w)~5%(w/w)의 AgNO3가 첨가된 1/2 Driver and Kuniyuki Walnut(DKW) 배지에서 3~5주간 광배양할 수 있다.
본 발명에 의한 가래나무의 무성번식 방법은 상기 (c) 단계에 의해 발생된 발아체를 토양에 이식하여 재분화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 가래나무의 무성번식 방법에 의해 무성번식된 가래나무를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 종자의 채취
실험 재료인 가래나무 종자의 미숙자엽은 국립산림과학원 수원 클론보존원에서 육성중인 가래나무 5개체를 대상으로 하였으며, 수분을 한 후 6주부터 11주까지 1주 간격으로 종자를 채취하였다.
<실시예 2> 배양을 위한 표면살균
종자의 표면 세척은 먼저 Tween 20을 3-4 방울 첨가한 수돗물로 종자의 표면을 세척한 후, 무균대로 가져와 95%(w/v) 에탄올에 1분간 침지한 다음, 2%(w/v) 차아염소산나트륨 용액에 15분간 표면살균하였다.
그 후, 멸균 증류수로 4회 세척한 다음, 2%(w/v) 차아염소산나트륨 용액에 30분간 표면살균 처리한 후, 95%(w/v) 에탄올에 1분간 침지하고, 화염 살균후 종자를 절단하여 실험재료인 종자배의 자엽을 추출하였다.
<실시예 3> 체세포배의 유도를 위한 배지 조성 및 조제
하기 표 3에서 보는 바와 같이, 체세포배 유도를 위한 배지는 상기 표 1과 같은 성분 및 함량으로 조성된 Driver and Kuniyuki Walnut (DKW, Driver and Kuniyuki)의 기본 배지에, 옥신(auxin)으로 1-나프탈렌 아세트산(NAA), 2,4-D 및 인돌부틸산(IBA)의 3종, 사이토키닌(cytokinin)으로 6-벤질아미노퓨린(BA), 티디아주론(thidiazuron), 카이네틴(kinetion)의 3종을 첨가한 총 4 조합의 배지를 조제하였다.
이때, 슈크로즈 30g/L를 각각 첨가하였고, 겔화제로는 0.8%(w/w) Difco-Bacto agar를 사용하였으며, 상기 각 조합의 배지는 121℃에서 고압 살균한 후, 페트리 디쉬(87× 15 mm)에 20㎖씩 분주하였다.
<실시예 4> 체세포배의 유도
상기 실시예 3에서 조제한 체세포배 유도용 배지에 10개의 자엽 절편체(0.5× 0.5cm)를 치상하였고, 각 호르몬 조합당 5반복으로 하여 25± 1 ℃의 유도 조건으로 암배양 하였다.
상기에서 배양된 절편체로부터 페놀성 물질이 분비되어 갈변화 징후가 보이면, 즉시 새 배지로 옮겨 4주간 배양한 후, 절편체를 식물 생장조절물질이 없는 각각의 기본 배지로 옮겨 8주간 더 암배양 하였다.
<실시예 5> 체세포배의 발아
유도된 체세포배 괴(somatic embryos cluster) 중에서 발달 단계가 자엽형을 보이는 체세포배 만을 선별하여 발아 실험에 이용하였다.
체세포배의 발아를 유도하기 위하여, 하기 표 3과 같이 4가지의 처리를 하였다.
즉, 처리구 1은 0.5 mg/L의 BA가 첨가된 DKW 배지에서 4주간 광배양한 후, 무기염류의 양을 반으로 줄인 1/2 DKW 배지로 옮겨 4주간 광배양을 실시하였다. 처리구 2는 DKW 배지에서 4℃의 저온 상태에서 8주간 암배양한 후, 3.0 mg/L AgNO3가 첨가된 DKW 배지에서 4주간 광배양을 실시하였다.
또한, 처리구 3은 DKW 배지에서 4℃의 저온 상태에서 6주간 암배양 한 후, 암소에서 1주간 탈수 처리하여 건조시킨 다음, 0.5 mg/L의 BA 및 3.0 mg/L의 AgNO3가 첨가된 1/2 DKW 배지에서 4주간 광배양을 실시하였다.
처리구 4는 0.5 mg/L의 BA가 첨가된 DKW 배지에서 4℃의 저온 상태에서 8주간 암배양한 후, 0.5%(w/w)의 활성탄(Sigma사)이 첨가된 1/2 DKW 배지에서 4주간 광배양을 실시하였다.
<실험예 1> 종자채취 시기에 따른 체세포배 유도율 조사
상기 실시예 1의 수분을 한 후 6주부터 11주까지 1주 간격으로 종자를 채취하여 체세포배 유도율을 조사한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2를 참조하면, 최대의 체세포배 유도율을 보인 시료는 수분후 9주째 채취한 종자자엽에서 가장 높은 유도율인 14.5%를 보이고, 그 후로는 급격히 감소하였지만, 수분후 11주 시료(0.9%)에서도 체세포 유도는 가능함을 보였다. 그러나 수분 후 6 및 7주 시료에서는 체세포배가 전혀 유도되지 않았는데 이것은 아직 충분히 자엽으로 발달되지 않은 것으로 보이며 점차 자엽형성이 시작되는 8주 (1.2%)부터 체세포배 유도가 가능한 것으로 나타났다.
Figure 112014063174459-pat00002
< 실험예 2> 배지 및 식물생장 조절물질의 종류 및 농도에 따른 체세포배의 유도율 조사
상기 실시예 4에 의한 체세포배 유도율을 조사한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
표 3을 참조하면, 1.0mg/L의 IBA 및 1.0mg/L의 thidiazuron(TDZ) 를 첨가한 DKW 배지(DKW-1)에서의 체세포배 유도율이 17.9%로 가장 높아, 체세포배 유도에 가장 효과적인 것으로 나타났다.
반면, DKW-3 배지 및 DKW-4 배지에서는 전혀 체세포배가 유도되지 않아, 식물생장 조절물질의 종류에 따라 특이적으로 반응함을 알 수 있다.
일반적으로, 절편체로부터 체세포배의 유도에는 첨가한 옥신류의 종류 및 농도가 큰 영향을 미치는데 ,특히 IBA를 첨가한 처리구에서만 체세포배가 유도되고 NAA 및 2,4-D 첨가구에서는 체세포배가 전혀 유도되지 않아, IBA에 대한 특이성을 보임을 알 수 있다.
Figure 112014063174459-pat00003
< 실험예 3> 발아 처리의 종류에 따른 발아율 조사
상기 실시예 5에 의한 4개의 처리구에 따라 처리를 한 후, 각 처리구별로 체세포배 상배축(epicotyl) 및 유근(radicle)의 유도율로 체세포배의 발아 효과를 조사한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
표 4를 참조하면, 발아처리 후 신초 및 뿌리의 발생 정도를 조사한 결과, 신초 유도율은 처리구 3(14.3 %) 및 처리구 4(13.1%)에서 높았으나, 처리구 1과 처리구 2에서는 전혀 유도되지 않아 효과가 없음을 알 수 있다.
처리구 3에서와 같이, 저온 및 건조 처리를 한 후, 에틸렌 발생 억제제인 AgNO3에 배양하거나, 처리구 4에서와 같이 저온처리 후, 활성탄 첨가배지에 배양하는 것 또한 자엽 발생에 효과적인 것으로 나타났다.
뿌리의 유도는 처리구 1(8.0%) 및 처리구 4(9.6%)에서 효과적이었는데, 처리구 2에서 1.0%의 유도율을 보여 가장 낮았다. 특히 처리구 4의 경우, 신초 유도와 같이 동일하게 높은 뿌리 유도율을 보였는데, 이는 신초 및 뿌리의 유도가 모두 저온처리 후, 활성탄 첨가 배지가 주효한 것으로 나타났다.
Figure 112014063174459-pat00004
이상에서 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상술한 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 많은 변형이 가능함은 자명할 것이다.
본 발명에 의한 가래나무의 무성번식 방법은 단시간 내에 가래나무의 클론묘 생산이 가능하고, 차후에는 병충해 등에 강한 외래 유전자의 삽입 방식으로 가래나무의 신품종 육종에도 동일하게 적용될 수 있다. 아울러 이 기술의 개발로 산림수종의 품종화를 통한 산림 생산성증진 등의 산림자원화에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (10)

  1. (a). 채취한 가래나무 종자를 절단하여 종자배의 자엽 절편체를 수득하는 단계;
    (b). 상기 자엽 절편체를 체세포배 유도용 배지에 치상하여 체세포배를 유도하는 단계; 및
    (c). 상기 유도된 체세포배를 배양하여 체세포배를 발아시켜 신초 및 뿌리를 발생시키는 단계를 포함하는 가래나무의 무성번식 방법에 있어서,
    상기 체세포배 유도용 배지는 Driver and Kuniyuki Walnut(DKW) 기본 배지에, 인돌부틸산 0.1mg/L~2.0mg/L 및 티디아주론 0.5mg/L~5.0mg/L을 포함하는 것을 특징으로 하는 가래나무의 무성번식 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 가래나무 종자의 채취는 미숙자엽에 수분을 한 후 8주~10주에 수행하는 것을 특징으로 하는 가래나무의 무성번식 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 채취한 가래나무 종자의 표면 살균을 하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 가래나무의 무성번식 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 표면 살균은 상기 종자의 표면을 세척한 후, 에탄올에 0.5분~5분간 침지한 다음, 차아염소산나트륨 용액에 10분~20분간 살균하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 가래나무의 무성번식 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 체세포배 배양은, 상기 유도된 체세포배를 0.1~1.0mg/L의 6-벤질아미노퓨린이 첨가된 Driver and Kuniyuki Walnut(DKW) 기본 배지에서 3~5℃의 온도로 7~9주간 암배양한 후, 0.1%(w/w)~1.0%(w/w)의 활성탄이 첨가된 1/2 Driver and Kuniyuki Walnut(DKW) 배지에서 3~5주간 광배양하는 것을 특징으로 하는 가래나무의 무성번식 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 체세포배 배양은, 상기 유도된 체세포배를 Driver and Kuniyuki Walnut(DKW) 기본 배지에서 3~5℃의 온도로 5~7주간 암배양한 후, 건조시켜 6~8일간 암배양한 다음, 0.1%(w/w)~0.3%(w/w)의 6-벤질아미노퓨린 및 2%(w/w)~5%(w/w)의 AgNO3가 첨가된 1/2 Driver and Kuniyuki Walnut(DKW) 배지에서 3~5주간 광배양하는 것을 특징으로 하는 가래나무의 무성번식 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에 의해 발생된 발아체를 토양에 이식하여 재분화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 가래나무의 무성번식 방법.
  10. 삭제
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