FR2933842A1 - Procede de production de plantes haploides, haploides doublees et/ou dihaploides, par gynogenese - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de production de plantes haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH, les HD et DH étant homozygotes ou essentiellement homozygotes, ce procédé étant du type de ceux relevant de la technique de gynogenèse induite par du pollen irradié. Ce procédé comprend une étape d'irradiation du matériel reproducteur du parent mâle à une dose comprise entre 160 et 190 Gamma Ray et/ou une étape de sélection des plantes haploïdes H et/ou DH par utilisation de marqueur(s) moléculaire(s). L'invention concerne également un procédé de production de plantes haploïdes, haploïdes doublées et/ou dihaploïdes homozygotes comprenant une étape de détermination de la (ou des) dose(s) d'irradiation adéquate(s) pour augmenter les rendements desdites plantes en fonction de facteurs multiples donnés comme l'espèce végétale, les génotypes du parent mâle et du parent femelle, les conditions climatiques et physiologiques, le moment de la récolte des fruits, le niveau de croissance des embryons recueillis en vue de leur culture, le niveau de développement des embryons mis en culture. Par ailleurs, l'invention concerne le(s) marqueur(s) moléculaire(s) utilisé(s) dans l'étape de sélection ainsi que les embryons haploïdes, les embryons dihaploïdes obtenus par le procédé de l'invention, la descendance et les semences des plantes obtenues par le procédé de l'invention.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION DE PLANTES HAPLOÏDES, HAPLOÏDES DOUBLEES ET/OU DIHAPLOÏDES, PAR GYNOGENESE

Le domaine de l'invention est celui de la sélection ou l'amélioration végétale, à savoir la production de plantes aussi bien sous forme d'embryons que dans tout autre stade, notamment de la plantule à la plante adulte. Plus précisément, la sélection ou l'amélioration végétale selon la présente invention signifie l'obtention d'une plante haploïde ou diploïde homozygote ou essentiellement homozygote ayant une descendance stable quant à ses caractères phénotypiques et/ou génotypiques. En d'autres termes, on aboutit pour une telle plante à une fixation de son génome avec un nombre réduit de générations (par exemple une ou deux). Plus précisément encore, la présente invention se rapporte à un nouveau procédé de production de plantes (e.g. embryons, plantules, plantes adultes), Haploïdes (H), Haploïdes Doublées (HD) et/ou DiHaploïde (DH), homozygotes ou essentiellement homozygotes, ce procédé étant du type de ceux relevant de la technique de gynogenèse avantageusement associée à une irradiation du pollen. Les plantes concernées sont par exemple les courgettes.

Les systèmes de création variétale, à savoir la création de nouvelles plantes adaptées aux besoins spécifiques des agriculteurs et producteurs, se sont accélérés depuis le début du 20etpe siècle. L'un des changements les plus radicaux fut la mise au point des hybrides, aussi commercialement appelés hybrides F1, initialement dans le maïs, et l'utilisation du phénomène d'hétérosis qui correspond à l'augmentation des capacités ou de la vigueur d'un hybride pour de nombreux caractères (vigueur, rendement, résistance aux maladies et à la verse, précocité) sur la moyenne des deux parents ou sur le meilleur des deux parents. Un autre changement concerne l'utilisation des techniques de culture in vitro des plantes basées sur leur totipotence.

La création de plantes hybrides F1, permettant notamment de réunir dans la plante hybride F1 les caractères dominants de ses parents, fut rapidement étendue du maïs à d'autres espèces comme la tomate, les poivrons, les aubergines. En effet, outre la vigueur hybride présente chez certaines espèces, l'obtention d'hybrides F1 permet aussi une amélioration des capacités d'homéostasie de la plante (stabilité de la plante et de l'expression de ses caractères dans différents environnements), et la possibilité de cumuler des gènes d'intérêts. Toutefois, la création de plantes hybrides F1 implique la création de lignées parentales relativement homozygotes. Une fois croisées, ces lignées parentales permettent l'obtention de l'hybride FI. Tant que la pureté génétique des lignées parentales est maintenue, les hybrides F l peuvent être obtenus de manière répétée.

Cette recherche d'homozygotie des lignées parentales n'est pas uniquement développée pour l'obtention des plantes hybrides F1. Similairement, lors du développement de nouvelles plantes commercialisées sous forme de variétés population (laitue, haricot, mâche, etc.), la création de cultivars (ou variétés) relativement homozygotes est devenue un impératif Les exigences d'homogénéités du produit pour les agriculteurs et pour la commercialisation (critères d'homogénéité et de stabilité des nouveaux cultivars inscrits au catalogue), ainsi que la mécanisation et la précision croissante des techniques de culture et de production entrainent un besoin de plantes de plus en plus homogènes dans l'expression de leurs caractères.

Le sélectionneur se rapproche traditionnellement du niveau d'homozygotie recherchée en autofécondant les plantes les plus prometteuses sur plusieurs générations, sélectionnant celles qui présentent les caractères recherchés, homogénéisant progressivement ainsi le génome des plantes d'une génération à l'autre.

Les nouvelles plantes de courgettes développées par les sélectionneurs sont soit des cultivars autogames, soit des hybrides FI. Dans les deux cas, la recherche d'homogénéité du cultivar et/ou des lignées parentales de l'hybride F1 est l'un des buts du programme de sélection. Il est à rappeler que, pour initier le cycle sexuel des plantes, un processus de réduction du nombre des chromosomes (méïose) est nécessaire pour donner naissance à des cellules gamétiques ayant un nombre haploïde de chromosomes (n). Dans les plantes à fleurs, la reproduction sexuée implique une double fécondation. Le grain de pollen produit deux noyaux gamétiques (n) mâles ou noyaux reproducteurs. Un noyau mâle fusionne avec un ovule (n) pour former un zygote (2n) qui produit l'embryon en restaurant le nombre de chromosomes somatiques (2n). Un autre noyau mâle (n) s'unit avec les noyaux polaires du sac embryonnaire haploïdes, pour former une cellule triploïde (3n). Dans certains cas, la formation du zygote ne se produit pas, mais des divisions cellulaires de l'ovule sont toutefois initiées, aboutissant à un embryon haploïde capable de donner naissance à une plantule dont le génome haploïde est entièrement d'origine maternelle (Sarkar and Coe, Genetics, 1966, vol 54, 453-464). Les plantes haploïdes existent en faible nombre dans la nature et sont stériles.

La découverte, au début des années 1920, des plantes haploïdes viables et de la possibilité de doubler leur stock chromosomique a suscité de nombreuses recherches. En effet, ces plantes haploïdes sont intéressantes non seulement dans le domaine de la génétique mais également pour l'amélioration des plantes car, après le doublement chromosomique (spontané ou non), les informations génétiques sont identiques sur les deux chromosomes de chaque paire. De cette façon, l'information génétique est fixée et les haploïdes doublés permettent d'accélérer les processus de sélection.

En 1964, Guha et Maheshwari (Guha and Maheshwari, Nature, 1964, 204, 497) 10 découvrent que des plantes peuvent être régénérées à partir de cellules haploïdes lors de la culture de grains de pollen. Dès lors, de nombreuses recherches ont été lancées sur la production de plantes haploïdes de diverses espèces, en utilisant des techniques de cultures in vitro de gamétophytes. Les deux principales techniques de production d'embryons et de plantes haploïdes 15 (haploïdisation) par culture in vitro de gamétophytes sont l'androgenèse et la gynogenèse. Dans l'androgenèse, des gamétophytes mâles immatures sont mis en culture sur un milieu synthétique afin d'obtenir des embryons haploïdes qui, ensuite, se développent en plantes entières. Les résultats varient avec le génotype, mais aussi avec les protocoles utilisés. Dans la gynogenèse, ce sont les gamétophytes femelles matures (ovaires ou ovules) qui 20 sont mis en culture. Les deux techniques peuvent être utilisées sur la même espèce, sachant que l'une d'elles est plus avantageuse pour certaines espèces, tandis que l'autre technique est plus adaptée à d'autres espèces.

25 Certains auteurs citent aussi la production d'embryons et de plantes haploïdes par l'utilisation d'agents chimiques ou physiques. Le principe de cette technique est de provoquer le développement de l'ovule non fécondé sur la plante (in situ). Si des tentatives par chocs thermiques, rayons X ou des substances chimiques n'ont abouti qu'à de piètres résultats, l'utilisation de pollen irradié a donné, dans certaines espèces comme le melon, 30 des résultats non directement applicables à d'autres espèces.

La majorité des plantes induites par ces techniques sont des plantes haploïdes, mais d'autres plantes avec des niveaux de ploïdies variables peuvent être obtenues. Si les aneuploïdes ou les tétraploïdes peuvent ne présenter que des intérêts mineurs dans des 35 programmes d'amélioration des plantes, les diploïdes spontanés (dihaploïdes DH) sont eux très recherchés puisque le doublement spontané de leur stock chromosomique durant les premières phases de la culture in vitro les rend fertiles. Ces plantes homozygotes sont directement utilisables par les sélectionneurs, ce qui représente un énorme avantage à plusieurs niveaux (temps, espace, coût...).

Les plantes Haploïdes (H), qui sont obtenues par ces diverses techniques et qui n'ont pas spontanément doublé leur stock chromosomique, doivent ensuite subir une étape supplémentaire pour les rendre diploïdes (2n) ou Haploïdes Doublés (HD). Ceci peut se faire au moyen de divers produits chimiques tels que la colchicine (alcaloïde qui permet de doublement d'un stock de chromosomes). Les haploïdes doublés HD ainsi que les dihaploïdes DH (résultats d'une diploïdisation spontanée), sont des individus homozygotes, utilisables notamment directement comme cultivars homogènes (variétés populations) ou comme lignées parentales de variétés hybrides. En effet, ces plantes HD et DH portent, sous forme doublée, l'information génétique d'un seul jeu (n) de chromosomes, celui du gamète femelle dont ils sont originellement issus.

Ainsi, ces techniques de création de plantes in vitro permettent non seulement de gagner du temps mais aussi d'aboutir à une meilleure homogénéité génétique : le génome est stabilisé (homozygote) en une seule génération au lieu d'approcher l'homozygotie génomique à la suite de multiples générations d'autofécondation. Elles permettent aussi d'améliorer le programme de sélection puisqu'elles mettent en exergue les caractéristiques récessives de la plante ainsi créée. L'utilisation des haploïdes doublés HD et des dihaploïdes DH est donc un outil très intéressant. Son usage s'est répandu pour certaines espèces : l'androgenèse est utilisée chez les plantes du genre Brassica (Keller et al, in K.Giles, S. Sen (eds.), Plant Cell Culture in Crop Improvment, 1984, 169-183. Plenum Pub. Corp., New York), la gynogenèse pour le concombre (brevet européen EP 0374755) et la betterave sucrière (Hosemans and Bossoutrot, Z. Pflanzenzuecht, 1983, 91, 74-77), le pollen irradié chez le melon (Sauton et Dumas de Vaulx, Agronomie 7, 1987, 7 (2), 141-148).

En conséquence, des plantes pour le développement desquelles des techniques d'haploïdisation in vitro ont été utilisées, sont aujourd'hui disponibles commercialement dans diverses espèces et inscrites au catalogue officiel.

Toutefois, malgré ces quelques variétés commerciales, les rendements des différents procédés d'haploïdisation restent encore trop dépendants de multiples facteurs inconnus ou imparfaitement maitrisés (génotype, culture des plantes mères, conditions de réalisation de l'haploïdisation, etc.) et parfois encore trop faibles, dans de nombreuses espèces, pour être intégrés de manière routinière dans les procédés de sélection actuels.

En ce qui concerne les courgettes Cucurbita pepo, seuls quelques résultats fragmentaires sont connus à ce jour et aucun n'indique comment produire suffisamment d'embryons haploïdes H (donnant ensuite les haploïdes doublés HD), ou d'embryons dihaploïdes DH pour alimenter un programme d'amélioration végétale.

La première mention de la culture in vitro d'ovules non fécondés de Cucurbita pepo est rapportée par Dumas de Vaux et Chambonnet en 1986 (Dumas and Chambonnet, Genetic Manipulation in Plant Breeding, 1986, 285). Les ovules sont extraits des ovaires un ou deux jours avant la floraison ou le matin même. Dans les deux premiers cas, les fleurs ne sont pas pollinisées, dans le troisième, elles sont pollinisées mais non fécondées. Les ovules sont placés en boites de Pétri sur un milieu contenant des macro et des micro-nutriments, ainsi que des vitamines, de l'acide 2,4 dichlorophénoxyacétique (2,4 D) et de la kinétine. Les auteurs obtiennent leur meilleur rendement, soit 4,3 embryons pour 100 ovules cultivés, lorsque les ovaires sont prélevés un jour avant la floraison. Toutefois, ils rencontrent des difficultés pour obtenir des plantes se développant normalement. L'origine des plantes est analysée lors d'une étape ultérieure d'autopollinisation des plantes diploïdes fertiles et d'un examen phénotypique de la descendance.

Plus récemment s'agissant toujours des courgettes Cucurbita pepo, Shalaby (Shalaby, Scientia Horticulturae, 2007, 115, 1-6) a analysé l'influence du génotype, de la position des fleurs femelles sur la tige, de la température et de la concentration de saccharose lors de la gynogenèse. Les plantes haploïdes régénérées sont traitées à la colchicine afin d'obtenir des haploïdes doublés. Les auteurs concluent que le génotype utilisé influe grandement sur les possibilités d'utiliser cette technique de manière routinière. Le génotype Yellow Bik ne produit ainsi aucun embryon par gynogenèse alors qu'il répond à 1' andro genèse. La conclusion de cet article quand à l'influence du génotype indique clairement que les techniques d'androgenèse et de gynogenèse ne sont pas aujourd'hui satisfaisantes pour être utilisées de manière étendue et routinière dans un programme d'amélioration de la courgette Cucurbita pepo.

Il a été proposé d'irradier le pollen dans un procédé de gynogenèse induite pour l'obtention de plantes haploïdes H, et/ou de plantes dihaploïdes DH, les plantes haploïdes H donnant ensuite des plantes haploïdes doublés HD. L'irradiation du grain de pollen lui fait perdre son pouvoir fécondant (l'ADN des gamètes est endommagé par les radiations) mais il conserve son pouvoir germinatif, pouvant ainsi induire la division de l'oosphère et son développement en embryon.

Cette technique de gynogenèse avec irradiation du pollen est utilisée notamment chez le melon (Cucumis melo) (Sauton, Cinquantenaire de la Culture in vitro, 24-25 octobre 1989) où la majeure partie des génotypes est capable de produire des embryons et/ou plantes haploïdes ou dihaploïdes.

Dans la technique de gynogenèse mise en oeuvre pour la courgette Cucurbita pepo et rapportée par Kurtar et al. (Kurtar et al, Euphytica, 2002, 127, 335-344), on a également recours à l'irradiation du pollen. Kurtar et al. ont étudié l'influence de la dose d'irradiation et des génotypes sur l'obtention des embryons haploïdes. Ces auteurs obtiennent des embryons et des plantes haploïdes sans avoir pu optimiser la dose d'irradiation et en ayant fait le constat selon lequel la production des embryons est fortement influencée par le niveau d'irradiation, par le développement des embryons mis en culture et par les génotypes. Ainsi, contrairement à ce qui se passe pour le melon, les conditions techniques de production d'embryons haploïdes de courgettes Cucurbita pepo, sont, jusqu'à présent, non généralisables.

Cette variabilité multifactorielle constitue un premier inconvénient notable des procédés connus de gynogenèse, avec ou sans irradiation du pollen.

Un second inconvénient desdits procédés est relatif aux analyses de l'état de ploïdie et de l'état d'homozygotie des plantes obtenues (embryons/plantules/plantes adultes). En effet, les plantes peuvent être haploïdes ou dihaploïdes, mais elles peuvent avoir des niveaux de ploïdie variés, notamment être des chimères haploïdes-diploïdes, des tétraploïdes ou des aneuploïdes (Dumas de Vaux et Chambonnet en 1986).

De manière contradictoire au principe de gynogenèse, l'irradiation du pollen peut donner lieu à des fécondations de l'ovule par l'ADN du grain de pollen, principalement par des fragments d'ADN. Ceci peut provenir du fait que les radiations n'ont pas dégradé suffisamment l'ADN pour empêcher la fécondation partielle, de laquelle résulte la formation d'un embryon chimérique (sans vouloir être limités par la théorie, les présents inventeurs pensent à des recombinaisons entre l'ADN de l'ovule et des fragments de l'ADN du grain de pollen). Lorsque les radiations dégradent suffisamment l'ADN, le grain de pollen devrait perdre son pouvoir fécondant et ne conserver que son pouvoir germinatif. On a toutefois constaté que dans certains cas, lors de l'extension du tube pollinique, des fragments d'ADN mâle peuvent se retrouver au contact de l'ovule et, lors d'une pseudo- fécondation, se recombiner avec l'ADN femelle, donnant ainsi des plantes chimériques haploïdes (lorsque la recombinaison entre l'ADN de l'ovule et les fragments de l'ADN du grain de pollen irradié est suivie de la perte de l'ADN surabondant lors des divisions cellulaires suivantes) ou à ploïdie variée, pouvant notamment être hétérozygotes pour certains gènes lorsqu'elles portent un ou plusieurs chromosomes surnuméraires. Les plantes chimériques haploïdes sont intéressantes puisqu'elles ne possèdent qu'une seule copie de l'information génétique (même si une infime partie du génome provient du gamète mâle) et qu'un doublement de leur stock chromosomique, similairement aux haploïdes, produit des plantes homozygotes ou essentiellement homozygotes. Des plantes hétérozygotes diploïdes issues d'une fécondation classique peuvent aussi être produites, dans le cas, par exemple, d'une insuffisance d'irradiation.

De plus, chez les cucurbitacées, on a constaté que certaines plantes obtenues par ces différents procédés de culture in vitro peuvent être diploïdes mais hétérozygotes car elles ne subissent pas de réduction gamétique lors de la formation des gamètes femelle (Veilleux, Plant Breeding Reviews, 1985, 3, 253-288). Elles portent ainsi l'intégralité de l'information génétique de la plante d'origine et ne présentent donc pas les caractéristiques intéressantes recherchées et propres aux plantes haploïdes, HD et/ou DH.

Les méthodes connues pour déterminer les niveaux de ploïdie permettent de différencier les plantes haploïdes n des plantes diploïdes 2n. Cependant, les méthodes actuelles pour déterminer de façon plus fine le niveau de ploïdie (chimérisme, chromosomes ou fragments de chromosomes manquants ou surnuméraires) restent encore très coûteuses en matériel et en temps. Ainsi, une méthode simple, rapide et économique serait nécessaire pour faire une distinction entre les plantes haploïdes et les plantes chimériques issues d'une pseudo-fécondation. De plus, actuellement, aucune possibilité satisfaisante n'existe pour différencier les plantes 2n diploïdes hétérozygotes issues d'une fécondation, les plantes 2n diploïdes hétérozygotes issues de la non réduction gamétique et les plantes diploïdes 2n dihaploïdes DH homozygotes issues d'un doublement spontané.

L'identification des haploïdes H (chimères ou non) et des différents diploïdes peut se faire par analyse cytologique, notamment par comptage des chromosomes dans des préparations de cellules de racine de plantes passées au microscope optique. L'analyse cytologique est difficile à mettre en oeuvre dans un programme de création variétale où la rapidité et la précision sont nécessaires. Cela ne résout toutefois pas le problème de l'identification des haploïdes par rapport aux chimères non haploïdes issues d'une pseudo-fécondation.

La sélection des plantes diploïdes 2n se fait jusqu'à présent par analyse phénotypique de la descendance de la plante régénérée ; l'autopollinisation d'une plante homozygote doit donner une descendance homogène stable à travers les générations d'autofécondation successives. Si elle ne l'est pas et que l'on observe une ségrégation de caractères, c'est que la plante régénérée n'était pas homozygote, mais hétérozygote. Ainsi, l'identification des dihaploïdes DH a pu se faire jusqu'à présent uniquement par la sélection morphologique et/ou l'utilisation de marqueurs récessifs (par exemple, liguleless, glossy...) présents dans le génome du parent femelle. L'utilisation de ces marqueurs récessifs présente l'inconvénient de nécessiter, préalablement à l'induction de la gynogenèse, leur introduction dans le génome de la lignée destinée à être utilisée comme parent femelle, si elle ne les possède pas déjà. Des marqueurs de coloration peuvent être utilisés dans la sélection des embryons et plantes haploïdes ou dihaploïdes (Chase and Nanda, Maize Gen Coop, 1965, News letter, 39, 59-60 ; Coe and Sarkar, J of Heredity, 1964, vol. 55, 231-233). Toutefois, l'expression de ces marqueurs est influencée par le génotype du parent femelle ou même par le processus général de maturation de l'embryon et ceci peut entraîner une évaluation incorrecte de l'origine des individus obtenus. L'analyse phénotypique de la descendance est longue, puisqu'il faut attendre la floraison, obtenir les graines et observer la descendance de chaque graine afin de vérifier son homogénéité.

Les causes du manque de résultats satisfaisants dans ces différentes méthodes connues d'haploïdisation se situent, en partie, dans les limites actuelles des techniques de culture in vitro, à savoir la grande spécificité génotypique de réponse à la culture in vitro, les faibles pourcentages de différenciation pour donner naissance à des embryons, la perte importante de ces embryons quand on veut les conduire vers une organogénèse complète. Il n'existe donc pas, à ce jour, de technique satisfaisante pour produire, de manière reproductible, suffisamment de plantes (e.g. embryons/plantules/plantes adultes) haploïdes H, haploïdes doublés HD et/ou dihaploïdes DH, afin d'alimenter un programme de sélection, notamment de courgettes. Cucurbita et particulièrement Cucurbita pepo fait en effet partie de ces espèces où l'effort déployé est très important pour surmonter ces différents problèmes.

Dans ce contexte, l'un des objectifs de la présente invention est de fournir un procédé performant permettant d'améliorer la production de plantes haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH, par gynogenèse induite par un gamétophyte mâle irradié (par exemple du pollen irradié).

Un autre objectif de la présente invention est de fournir un nouveau procédé perfectionné de sélection ou d'amélioration végétale, c'est-à-dire d'obtention de plante, haploïde ou diploïde homozygote ou essentiellement homozygote ayant une descendance stable quant à ses caractères phénotypiques et/ou génotypiques, ou en d'autres termes, une plante pour laquelle une stabilisation du génome est acquise avec un nombre réduit de générations (par exemple une ou deux).

Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé de production de plantes haploïdes, haploïdes doublées et/ou dihaploïdes, par gynogenèse induite avec irradiation des gamétophytes mâles (pollen), remédiant aux inconvénients de l'art antérieur et satisfaisant à au moins l'une des spécifications suivantes : - Optimisation de la dose d'irradiation ; - Pouvoir au moins en partie s'affranchir de l'influence du niveau de développement des embryons mis en culture et/ou des génotypes et/ou des conditions climatiques et/ou du moment de la récolte des fruits, du niveau de croissance des embryons recueillis en vue de leur culture, entre autres, (variabilité multifactorielle) ; - Généralisation du procédé à un maximum d'espèces et de genres, en particulier à la majorité des courgettes Cucurbita pepo ; Permettre une analyse efficace et certaine de l'état de ploïdie et de l'origine des plantes produites ; Permettre une bonne identification des plantes obtenues.

Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé de production de plantes haploïdes (donnant ensuite des plantes haploïdes doublées) et/ou dihaploïdes, par gynogenèse induite par du pollen irradié, ledit procédé permettant de réduire le temps ainsi que l'espace de culture nécessaire à la création et la sélection variétale, ceci grâce à une étape de sélection des plantes haploïdes, et/ou dihaploïdes, parmi l'ensemble des plantes à ploïdies variées produites.

Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé permettant, en amont d'un procédé de production de plantes haploïdes et/ou dihaploïdes par gynogenèse avec irradiation du matériel reproducteur du parent mâle, de déterminer la dose d'irradiation adéquate pour augmenter les rendements de production desdites plantes en fonction de facteurs multiples donnés et choisis de préférence parmi l'espèce végétale, les génotypes du parent mâle et du parent femelle, les conditions climatiques et physiologiques de ces plantes, le moment de la récolte des fruits, les conditions de croissance des embryons immatures recueillis en vue de leur culture.

Un autre objectif de l'invention est de fournir au moins l'un des objets suivants : - Marqueur(s) moléculaire(s) ; Embryons ; Plantes régénérées à partir des embryons ; - Descendance des plantes ; Semences de plantes ; utilisables dans ou obtenus par un procédé de production de plantes haploïdes, haploïdes doublées et/ou diplohaploïdes, par gynogenèse induite par du pollen irradié, ce procédé étant du type de celui visé dans les objectifs ci-dessus.

Un autre objectif de l'invention est de fournir un procédé performant d'analyse de l'origine de plantes, notamment de plantes produites par un procédé de production de plantes haploïdes (donnant ensuite des plantes haploïdes doublées) et/ou dihaploïdes, par gynogenèse induite par du pollen irradié, ce procédé étant du type de celui visé dans les objectifs ci-dessus, et permettant de déterminer si les plantes contiennent du matériel génétique du parent mâle.

Un autre objectif de l'invention est de fournir un procédé performant d'identification de plantes, notamment de plantes produites par un procédé de production de plantes haploïdes (donnant ensuite des plantes haploïdes doublées) et/ou dihaploïdes, par gynogenèse induite par du pollen irradié, ce procédé étant du type de celui visé dans les objectifs ci-dessus et permettant de déterminer si les plantes sont homozygotes ou hétérozygotes.

Au moins l'un des objectifs ci-dessus, parmi d'autres, est atteint par la présente invention qui concerne, tout d'abord, un nouveau procédé de production de plantes haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH, les HD et DH étant homozygotes ou essentiellement homozygotes, ce procédé étant du type de ceux relevant de la technique de gynogenèse induite par du pollen irradié, caractérisé en ce qu'il comprend : une étape d'irradiation du matériel reproducteur du parent mâle à une dose comprise entre 160 et 190 Gamma Ray, de préférence entre 165 et 185 Gamma Ray 25 (Gy), ou une étape de sélection des plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH par utilisation d'un marqueur moléculaire, ou une étape d'irradiation du matériel végétal reproducteur du parent mâle à une dose comprise entre 160 et 190 Gamma Ray, de préférence entre 165 et 185 30 Gamma Ray (Gy) et une étape de sélection des plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH par utilisation d'un marqueur moléculaire. Il est à noter que dans la présente demande, classiquement l'article indéfini "un" doit être considéré comme un pluriel générique (signification de "au moins un" ou encore "un ou 35 plusieurs"), sauf lorsque le contexte montre le contraire (1 ou "un seul"). Ainsi, par exemple, lorsque l'on dit ci-dessus que l'on ajoute une étape d'irradiation, il s'agit de l'ajout d'une ou plusieurs étapes d'irradiations. Il en va de même pour l'étape de sélection des plantes qui peut être faite par plusieurs étapes de sélections, pour l'utilisation d'un ou plusieurs marqueurs moléculaires. Le procédé selon la présente invention ouvre une nouvelle voie d'obtention de plantes (lato sensu) haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH. Cette nouvelle voie 5 apporte des améliorations en termes : d'élargissement du spectre des végétaux concernés par cette technique de gynogenèse avec irradiation des gamétophytes mâles (pollen) ; de réduction de la variabilité multifactorielle propre à cette technique jusqu'alors ; d'analyse de l'état de ploïdie des plantes produites ; 10 d'identification de l'origine des plantes obtenues ; de réduction de temps ainsi que d'espace de culture nécessaire à la création et la sélection variétale. Ce procédé s'est par ailleurs avéré tout à fait approprié pour les plantes de courgettes.

15 Compte tenu de la variabilité factorielle de la gynogenèse induite par irradiation du pollen, toutes les avancées en termes d'optimisation sont les bienvenues. Ainsi, selon un autre de ses aspects, l'invention vise un procédé de production de plantes haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH, les HD et DH étant homozygotes ou essentiellement homozygotes, par gynogenèse induite par irradiation du matériel reproducteur du parent 20 mâle, caractérisé en ce qu'il comprend une étape préalable de détermination de la (ou des) dose(s) d'irradiation adéquate(s) pour augmenter les rendements d'obtention desdites plantes en fonction de facteurs multiples donnés et choisis de préférence parmi l'espèce végétale, les génotypes du parent mâle et du parent femelle, les conditions climatiques et physiologiques, le moment de la récolte des fruits, le niveau de croissance des embryons 25 recueillis en vue de leur culture.

L'invention vise également un procédé de production de plantes haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH, les HD et DH étant homozygotes ou essentiellement homozygotes, par gynogenèse induite par du pollen irradié, caractérisé en ce qu'il 30 comprend l'utilisation d'un marqueur moléculaire pour identifier les plantes exemptes de matériel génétique du parent mâle dont le pollen a été irradié ou qui en possèdent une quantité insuffisante pour provoquer, dans la descendance desdites plantes, une disjonction d'un caractère phénotypique et/ou génotypique ainsi que pour déterminer leur état d'homozygotie. 35 Selon encore un autre de ses aspects, l'invention se rapporte à un marqueur moléculaire susceptible d'être utilisé dans le procédé selon l'invention, ce marqueur étant, par exemple, choisi parmi les marqueurs microsatellites (SSR), définis par les couples d'amorces de séquences nucléotidiques annexées SEQ ID N° 1 à 16.

Selon encore un autre de ses aspects, l'invention se rapporte à des embryons haploïdes H, 5 HD et/ou DH de plantes, en tant que produits intermédiaires du procédé selon l'invention.

Selon encore un autre de ses aspects, l'invention concerne la descendance des plantes obtenues par le procédé selon l'invention.

10 Selon encore un autre de ses aspects, l'invention concerne les semences des plantes obtenues par le procédé selon l'invention.

Afin de mieux comprendre l'invention, il convient tout d'abord de rappeler ou de donner quelques définitions, qui doivent toutes être considérées comme des exemples non 15 limitatifs. - Par génotype, on entend l'ensemble du matériel génétique porté par un individu et qui constitue son patrimoine héréditaire. Un caractère génotypique correspond ou non à un caractère phénotypique, qu'il soit récessif ou dominant. - Le terme phénotype désigne l'ensemble des caractères morphologiques ou fonctionnels 20 apparents d'un individu, qui correspondent à la fois à la partie exprimée du génotype et à des phénomènes déterminés par le milieu extérieur. - Par plante, on entend un végétal à quelque stade de développement que ce soit, notamment : embryon, ou tout autre stade plantule ou de la plante adulte. - Par plante mâle ou parent mâle on entend une plante utilisée comme donneur de pollen 25 dans un croisement. - Par plante femelle ou parent femelle on entend une plante utilisée comme receveur de pollen, ou donneur d'ovule dans un croisement. - Par matériel reproducteur mâle, on entend la fleur mâle ou toute partie comportant les cellules gamétiques haploïdes mâles, à savoir l'étamine, les gamétophytes mâles ou grains 30 de pollen. Par simplification, dans la présente demande, par pollen on entend désigner le matériel reproducteur mâle utilisé. - Par matériel reproducteur femelle, on entend la fleur femelle ou toute partie comportant les cellules gamétiques haploïdes femelles, les ovaires, les ovules, les gamétophytes 35 femelles (sac embryonnaire) ou les cellules reproductrices femelles (oosphères). - Par autogame, on entend une plante dont le mode de reproduction est l'autogamie et dont les graines sont issues de la fécondation des deux gamètes issus du même individu. - Par pollinisation., on entend l'apport d'un grain de pollen depuis l'étamine (organe mâle) sur les organes femelles. La pollinisation donne lieu à une fécondation, voire à une pseudofécondation lorsque le matériel male utilisé est irradié. - Par fécondation, on entend la fusion entre un gamète mâle et un gamète femelle donnant 5 naissance à un embryon. - Par pseudo-fécondation, on entend la formation induite d'embryon sans fusion au préalable d'un gamète mâle et femelle. Dans le cadre de la présente invention, la technique de gynogenèse induite par irradiation du pollen permet la formation d'un embryon par pseudo-fécondation. La pseudo fécondation peut aussi être une fécondation partielle, 10 lorsque des fragments d'ADN du gamète male fusionnent avec le gamète femelle. - Par autofécondation, on entend la pollinisation d'un individu par son propre pollen, les individus qui en résultent étant dits autofécondés. - Par plante hybride, on entend une plante issue du croisement entre deux parents génétiquement différents. Pour une plante de la première génération d'un croisement entre 15 deux parents homozygotes génétiquement distincts, par exemple deux variétés distinctes, on pourra parler d'hybride Fl. - Par hétérosis ou vigueur hybride, on entend le phénomène selon lequel un hybride F l est significativement supérieur au meilleur de ses parents quant à un ou plusieurs caractères, notamment pour ce qui concerne la vigueur. 20 - Par stock chromosomique, on entend le nombre de chromosomes contenus dans le noyau de la cellule, ou la quantité d'ADN. - Par allèle, on entend selon la présente invention les diverses versions d'une séquence d'ADN donnée située à un locus (emplacement sur un chromosome) chromosomique donné. 25 - Par homozygote, on entend une cellule ou un individu qui possède deux allèles identiques d'un même gène sur un locus déterminé de la même paire de chromosome, et ce pour la caractéristique apportée par ce gène. - Par essentiellement homozygote, on entend les plantes selon l'invention, dès lors que l'identité des deux allèles est vérifiée par exemple pour au moins 80%, de préférence 85%, 30 notamment 90% et plus particulièrement 95%, des allèles testés ou dès lors qu'après une autofécondation, il n'y a pas de ségrégation des caractères dans la descendance. Par extension, dans la présente demande, les plantes essentiellement homozygotes sont considérées comme des plantes homozygotes. - Par diploïdes, on entend un qualificatif applicable à des cellules ou à des plantes ou des 35 parties de plantes comprenant de telles cellules, lesquelles présentent, dans leur noyau, un lot de chromosomes deux à deux semblables dits homologues. Les cellules diploïdes sont habituellement le résultat de la fécondation de deux gamètes haploïdes. - Par haploïdes, on entend un qualificatif applicable à des cellules ou à des plantes ou des parties de plantes comprenant de telles cellules, dont les chromosomes contenus dans leur noyau ne sont chacun qu'en un seul exemplaire (n). - Par chimères on entend un qualificatif applicable à des cellules ou à des plantes ou des parties de plantes comprenant de telles cellules, qui comprennent un fragment d'ADN additionnel provenant du pollen irradié ou dont l'un des chromosomes a subi une recombinaison avec de l'ADN du pollen irradié. Ces cellules peuvent être haploïdes H, dihaploïdes DH (lorsqu'il y a doublement spontané du stock chromosomique) ou à ploïdie variée.

Lorsqu'une plante est une chimère à ploïdie variée (comprenant notamment des chromosomes ou des fragments de chromosomes surnuméraires), elle est hétérozygote pour certains allèles Lorsqu'une plante est issue d'une recombinaison avec un fragment d'ADN du pollen mâle irradié, elle est intéressante dans deux cas : 1) Si elle ne possède qu'une seule copie de chacun des chromosomes, elle est considérée comme haploïde et pourra donc subir un doublement chromosomique ultérieur pour devenir une plante haploïde doublée (2n) homozygote. 2) Si elle a subi un doublement chromosomique spontané, elle est dihaploïde (2n) homozygote. - Par haploïde doublé (HD), on entend un qualificatif applicable à des cellules ou à des plantes ou des parties de plantes comprenant de telles cellules, dont le stock chromosomique a été multiplié artificiellement, la plupart du temps par traitement chimique et principalement par la colchicine. - Par dihaploïdes (DH), on entend un qualificatif applicable à des cellules ou à des plantes ou des parties de plantes comprenant de telles cellules, ces cellules étant au départ haploïdes et ayant vu leur stock chromosomique doublé spontanément. Ce doublement du stock chromosomique permet d'obtenir une cellule, plante ou partie de plante à 2n entièrement homozygote. - Par parent femelle hybride, on entend une plante hybride utilisée comme plante receveuse 30 de pollen dans un croisement. - Par courgette, on entend une plante du genre Cucurbita. La courgette est en réalité un ensemble de cultivars de l'espèce Cucurbita pepo et de la sous-espèce Cucurbita pepo ssp. pepo. - Par dose, on entend la dose d'irradiation absorbée par la cible, à savoir notamment le 35 matériel végétal reproducteur du parent mâle. - Par marqueur moléculaire, on entend un fragment spécifique d'une séquence d'ADN pouvant être identifiée au sein du génome d'un individu et pouvant être notamment utilisée pour localiser un gène d'intérêt, vérifier si un individu a hérité d'une caractéristique particulière d'un parent ou différencier deux individus. Il peut s'agir ou non d'une séquence codante. Le marqueur peut être dominant, co-dominant. La détection du marqueur moléculaire, ou sa non-détection, permet de sélectionner les individus présentant le gène d'intérêt ou la caractéristique particulière, ou au contraire, de ne pas sélectionner les individus ne présentant pas le gène d'intérêt ou la caractéristique particulière. Dans la présente invention, les marqueurs moléculaires permettent de tester rapidement les plantes ou plantules en cours de développement et de retenir celles qui possèdent les caractéristiques recherchées. Des marqueurs moléculaires de différentes natures sont connus de l'homme du métier : AFLP (polymorphismes de longueur des fragments d'amplification), SCAR (caractérisation de produits d'amplification), SSR (microsatellites, répétitions de séquences simples), RFLP (polymorphismes de longueur des fragments de restriction), etc. - Par marqueur microsatellite ou séquence microsatellite ou encore SSR, on entend une séquence d'ADN formée par une répétition continue de motifs composés de 1 à 4 nucléotides. Ces séquences microsatellites sont présentes sur l'ensemble du génome, le plus fréquemment au niveau des introns des gènes mais également au niveau d'exons. Le polymorphisme des microsatellites peut être utilisé comme marqueur génétique afin d'identifier un individu ou une population, par exemple des plantes.

Lors de la création et la sélection de variétés végétales, la transmission de façon stable et homogène des caractères choisis est un pré-requis indispensable. Aussi, il est fondamental de pouvoir connaître de façon fiable le génotype et le phénotype des plantes produites. Pour maintenir un hybride, de préférence un hybride FI, il faut des lignées parentes stables. Pour obtenir des plantes fixées, les plantes sont généralement autofécondées de manière répétée, les plantes ne présentant pas les caractéristiques recherchées étant éliminées à chaque génération. De nouvelles techniques ont permis le développement de plantes à partir des gamètes (n) seuls. Ainsi, ont été développées l'androgenèse et la gynogenèse. L'utilisation de la gynogenèse avec du pollen irradié est connue pour générer des plantes. Cependant, comme exposé ci-dessus, cette technique présente certaines limites et principalement les cas de pseudo-fécondations par le pollen, même lorsque celui-ci a été fragmenté par les rayonnements, de préférence des rayons X ou gamma. En effet, il se peut que le pollen ne soit pas assez dégradé et qu'un fragment d'ADN du pollen irradié pseudo-féconde le gamétophyte femelle alors que dans cette technique, il doit simplement induire le développement d'un embryon haploïde sans en modifier le génome.

Cet embryon, et par conséquent la plante issue de cet embryon, ne doit donc idéalement pas contenir de génome du parent mâle ayant servi à la pollinisation du matériel reproducteur du parent femelle. Mais il se trouve que la descendance produite par gynogenèse induite par du pollen irradié peut être de différentes natures, notamment : des plantes haploïdes (à n chromosomes), des plantes dihaploïdes (à 2n chromosomes identiques n+n), des chimères contenant n chromosomes du parent femelle et des morceaux d'ADN fragmentés du parent mâle recombinés ou non avec l'ADN du parent femelle, soit sous forme haploïde, soit ayant une ploïdie variée, soit étant dihaploïdes, ayant subit un doublement spontané de leur stock chromosomique, des plantes diploïdes issues d'une fécondation des plantes diploïdes ayant le même génome que la plante mère (2n). Dans les processus de création variétale, il est nécessaire de ne conserver que les plantes haploïdes H (y compris les chimères haploïdes), pouvant ensuite donner par doublement du stock chromosomique les haploïdes doublés HD, et les plantes dihaploïdes DH pour être certain de leur homozygotie.

Après de longues recherches, les inventeurs ont perfectionné ce tri en proposant une gamme judicieusement sélectionnée de doses d'irradiation des gamétophytes mâles, qui permet d'orienter la gynogenèse vers une population d'individus souhaités (H, DH) exempte ou quasi-exempte d'individus non souhaités. Le fait d'associer ou de substituer le choix de cette gamme de doses à un processus de sélection par utilisation de marqueurs moléculaires et/ou de cytométrie de flux va dans le 20 même sens. Selon un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, le procédé concerné de gynogenèse induite avec irradiation du pollen, comprend les étapes successives suivantes : a) Mettre en oeuvre du matériel reproducteur du parent mâle, de préférence une fleur, b) Irradier ledit matériel végétal reproducteur du parent mâle à une dose comprise entre 25 160 et 190 Gamma Ray, de préférence entre 165 et 185 Gamma Ray (Gy) et tout particulièrement entre 170 et 180 Gy, c) Polliniser le matériel végétal reproducteur du parent femelle avec ledit matériel végétal reproducteur du parent mâle irradié, d) Récolter les fruits dont les graines portent les embryons, 30 e) Extraire les graines desdits fruits, f) Extraire les embryons desdites graines, g) Mettre en culture les embryons sur un milieu approprié jusqu'à l'obtention d'une plante, de préférence une plantule.

35 L'étape d'irradiation du matériel reproducteur mâle peut être répétée plusieurs fois, de préférence deux ou trois fois, afin que le matériel génétique soit bien dégradé. La dose d'irradiation du matériel reproducteur mâle tout particulièrement préférée est autour de 175 Gy.

Dans un mode tout particulièrement préféré de mise en oeuvre de l'invention, le procédé comporte en outre, après l'étape g) décrite ci-dessus, une étape h) consistant à sélectionner les plantes haploïdes H et/ou DH par cytométrie de flux, ou par utilisation de marqueur(s) moléculaire(s), ou par cytométrie de flux et utilisation de marqueur(s) moléculaire(s).

Cette étape h de sélection des plantes haploïdes H et/ou DH comporte : -I- l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) spécifique(s) d'allèle(s) donné(s) contenu(s) dans le matériel génétique du parent mâle irradié pour sélectionner parmi les plantes obtenues à l'issue de l'étape g), les plantes qui sont exemptes de matériel génétique du parent mâle irradié ou qui en possèdent une quantité insuffisante pour provoquer dans la descendance desdites plantes, une disjonction d'un ou plusieurs caractère phénotypique et/ou génotypique ; -II- l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) spécifique(s) d'allèle(s) donné(s) contenu(s) dans le matériel génétique du parent femelle hybride, ce(s) marqueur(s) permettant de déterminer l'état homozygote/hétérozygote des plantes à sélectionner c'est-à- dire les plantes obtenues à l'issue de l'étape g), ce(s) marqueur étant utilisé(s) pour sélectionner les plantes homozygotes et essentiellement homozygotes, en particulier les plantes DH.

Il est bien évident que lors de l'étape h de sélection, l'ordre de l'utilisation des marqueurs moléculaires spécifiques donnés contenus dans le matériel génétique e du parent mâle et de ceux contenus dans le matériel génétique du parent femelle importe peu. I et II ne sont pas nécessairement réalisées dans un ordre précis et peuvent être concomitantes (I et II en même temps) ou successives (I puis II ou II puis I). De plus, l'étape de sélection h) peut être répétée plusieurs fois. Ceci peut être intéressant lorsque l'on utilise plusieurs marqueurs moléculaires spécifiques, pour effectuer des sélections successives de plus en plus fines avec de moins en moins d'individus à tester. Enfin, lorsque l'étape h consiste à sélectionner les plantes haploïdes H et/ou DH par cytométrie de flux et utilisation de marqueur(s) moléculaire(s), la cytométrie de flux peut précéder l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s), l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) peut précéder la cytométrie de flux, et l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) peut être concomitante avec la cytométrie de flux.

De préférence, les plantes parents sont choisies dans le genre Cucurbita, famille des cucurbitacées, de préférence dans l'espèce Cucurbita pepo, et, plus préférentiellement 35 encore, dans la sous-espèce Cucurbita pepo ssp. pepo.

Selon une caractéristique remarquable de l'invention, on met en oeuvre comme plante femelle des plantes hybrides et des plantes hybrides F 1. En effet, lors de la production des gamètes d'une plante hybride ou d'une plante hybride F1, les appariements chromosomiques des chromosomes homologues lors de la première division permettent des recombinaisons génétiques et donnent donc une grande variabilité génétique des gamètes produits. Les plantes haploïdes H, (donnant les haploïdes doublées HD) et les plantes dihaploïdes DH issues de ces gamètes et obtenues par le procédé selon la présente invention, sont génétiquement différentes les unes des autres, donnant ainsi un choix accru au sélectionneur.

Etape.a) Pour faire un bref rappel du cycle de vie de plantes à fleurs, telle que les courgettes, une fleur pollinisée ou autopollinisée va produire des fruits contenant eux-mêmes des graines, lesquelles contiennent des embryons, qui vont se développer en plantules pour aboutir à des plantes. Le matériel végétal mâle et femelle est choisi en fonction des caractéristiques recherchées.

Le matériel végétal reproducteur mâle récolté et mis en oeuvre comprend principalement des fleurs d'une plante mâle choisie mais il peut s'agir également des étamines ou des gamétophytes ou directement des gamètes mâles ou grains de pollen. Les fleurs par exemple sont avantageusement récoltées sur la plante mère mâle au moment de l'anthèse. Une ou deux fleurs mâles étant généralement utilisées pour la fécondation de chaque fleur femelle. Pour les plantes préférées selon l'invention, à savoir celles du genre Cucurbita, les plantes mâles retenues selon l'invention peuvent être par exemple celles dont les génotypes sont dans le groupe comprenant : JIB, JEDIDA, ESKENDARENI. Ces plantes mâles sont particulièrement intéressantes car ce sont de bons polinisateurs, à savoir qu'elles émettent de bonnes quantités de pollen.

Le moment de la récolte du matériel végétal reproducteur du parent mâle, de préférence des fleurs, peut avoir une importance. Ce moment est choisi en fonction du développement de la plante dont les fleurs proviennent, de la saison... Ainsi, il est préférable de les récolter lors de l'anthèse et de féconder les fleurs femelles avant leur ouverture.

Etape_b) L'étape d'irradiation b) du matériel végétal reproducteur du parent mâle, c'est-à-dire des gamétophytes mâles, comme le pollen, est importante dans la réussite du procédé de production des plantes H (donnant des haploïdes doublés HD) et/ou des plantes DH. Les rayons utilisés sont de préférence les rayons gamma, mais on peut également utiliser les rayons X. L'irradiation est réalisée à l'aide de moyens connus et appropriés tel que des rayons gamma par exemple pendant une durée suffisante pour que le matériel végétal reproducteur du parent mâle reçoive la dose prescrite sur des bocaux fermés contenant de préférence dix à douze fleurs mâles par bocal. Par exemple, pour JIB, la durée d'irradiation est de préférence entre 20 minutes et 1heure et demie. Les conditions choisies d'irradiation (tous paramètres confondus) permettent d'obtenir des résultats très satisfaisants, à savoir après pollinisation avec le matériel végétal reproducteur mâle, une production suffisante de fruits, lesquels contiennent un nombre suffisant d'embryons qui conduisent à des plantes dont la majorité possède les caractéristiques recherchées. En effet, la majorité des embryons et donc des plantes produites par le procédé selon l'invention sont H et/ou DH, les haploïdes donnant des haploïdes doublés.

Etape_c) Avant d'effectuer l'étape c) du procédé selon l'invention, il peut être avantageux de faire germer quelques grains de pollen irradiés, dans un milieu approprié, comme par exemple dans un milieu nommé MP15 (solution à 15 % de sucrose, 100 mg/L H3BO3 et 700 mg/L CaC12, 2H2O), ceci afin de vérifier que le pollen irradié est encore capable de germer.

Après un temps de germination donné, par exemple de 15 à 60 min, les grains de pollen sont ensuite observés à la loupe afin d'estimer les pourcentages de grains germés et de grains éclatés. Le matériel reproducteur du parent femelle utilisé aura un génotype choisi en fonction de la plante à créer.

Pour les plantes préférées selon l'invention, à savoir celles du genre Cucurbita, les plantes femelles retenues selon l'invention peuvent être par exemple celles dont les génotypes sont dans le groupe de génotypes comprenant VN001, VG06, VN002, Odessa, VG 14, Tosca et VE 547 peuvent également être utilisés. L'étape c) du procédé selon l'invention consiste essentiellement en la pollinisation du matériel reproducteur du parent femelle avec le matériel reproducteur du parent mâle. Dans cette technique de gynogenèse, des plantes entières peuvent être régénérées à partir des gamétophytes femelles (ovaires ou ovules) contenus dans le matériel végétal reproducteur du parent femelle. La pollinisation consiste avantageusement à mettre en contact les gamètes mâles et les gamètes femelles, mais étant donné que les gamètes mâles sont irradiés, il ne peut y avoir de réelle fécondation des gamètes femelles mais juste un allongement du tube pollinique et, par induction de l'oosphère, le développement d'un embryon. La pollinisation du matériel végétal reproducteur du parent femelle peut se faire de diverses manières. Les techniques préférées seront la pollinisation par la technique fleur à fleur où l'ensemble de la superficie des stigmates (extrémité des pistils) est recouverte du matériel reproducteur du parent mâle mais également la pollinisation au pinceau. Dans la technique fleur à fleur , une fleur ou le matériel reproducteur du parent femelle est fécondé(e) par une fleur ou le matériel reproducteur du parent mâle.

Dans la technique dite du pinceau , un pinceau est utilisé pour effectuer le transport des grains de pollen du matériel reproducteur du parent mâle vers un ou plusieurs fleurs ou matériel reproducteur du parent femelle.

Etape.d) Avantageusement, les jours suivant la pollinisation, la bonne formation du fruit (nouaison) est observée et les fleurs ne formant pas de fruit sont éliminées. Après la pollinisation, la durée après laquelle les fruits sont récoltés dépend de la famille, du genre et de l'espèce concernée.

De préférence, on récolte les fruits dont la maturité convient pour l'extraction des embryons. La morphologie du fruit et son aspect extérieur permet d'évaluer le moment opportun pour cueillir le fruit. Par exemple, environ 4 à 5 semaines (durée variable selon le genre et l'espèce) après la pollinisation, les fruits sont récoltés puis de préférence lavés à l'eau éventuellement avec un détergent (e.g. savon de Marseille), rincés, séchés et éventuellement nettoyés à nouveau à l'alcool.

Etape_e) Les fruits sont alors ouverts pour extraire les graines, de préférence en conditions stériles, par exemple sous flux laminaire.

Etape_ Les graines sont ensuite ouvertes pour en extraire les embryons.

Etape_ g) Les embryons extraits sont mis en culture sur un milieu adapté, de type de ceux décrits dans les exemples qui suivent, le milieu S2P étant préféré (cf. tableau 8). Les embryons, par exemple, sont cultivés à l'obscurité, une à deux nuits, à 20-25°C, puis 30 ils sont placés en pleine lumière pendant 10 heures à 20 heures environ, e.g. 16 heures environ à la même température. Les embryons peuvent être récoltés à divers stades de développement embryonnaire et certains stades peuvent influencer le rendement du procédé selon l'invention. En effet, les embryons peuvent être récoltés au stade embryonnaire globulaire, coeur, torpille ou 35 cotylédonnaire. Les embryons peuvent être repiqués régulièrement, de préférence tous les 15 jours environ, sur le même milieu ou sur un milieu de culture différent adapté à leur stade de développement, en particulier dès l'apparition des jeunes feuilles et de petites racines.

Lorsque les plantules sont bien développées, elles sont avantageusement repiquées sur un autre milieu de culture approprié, dont la composition est e.g. celle donnée dans les exemples qui suivent (cf. tableaux 8 et 9).

Etape_h) Dans une variante préférée du procédé selon l'invention, on réalise une étape de sélection des plantes haploïdes H et/ou DH produites selon le procédé : hl) par cytométrie de flux et/ou, h2) par utilisation d'un marqueur moléculaire.

Cette sélection hl et/ou h2 est avantageusement réalisée lorsque la plante issue de la gynogenèse présente quelques feuilles, un échantillon de la plante, de préférence de feuille, étant prélevé et analysé suivant cette étape de sélection h) du procédé. Ces sélections hl) et/ou h2) qui peuvent être mises en oeuvre, simultanément ou non, dans n'importe quel ordre, voire par intermittence, permettent notamment de déterminer le niveau de ploïdie des plantes produites. Une discrimination entre les plantes ayant 2n chromosomes et les plantes à n chromosomes est possible par ces techniques. Ainsi, les plantes ayant n chromosomes (haploïdes H) sont conservées pour être par la suite soumises à une étape de doublement de leur stock chromosomique, de préférence à la colchicine, produisant ainsi des haploïdes doublés (HD). Les plantes haploïdes H sont stériles, en revanche les plantes haploïdes doublées HD et les dihaploïdes DH ne le sont pas et sont particulièrement intéressantes pour les sélectionneurs. Dans le cas de la sélection hl) par cytométrie de flux, la cytométrie de flux permet de faire une distinction fiable entre les plantes 2n et les plantes n mais il n'est pas possible par cette technique de différencier les plantes dihaploïdes DH (2n identiques, homozygotes) et les plantes diploïdes 2n hétérozygotes issues d'un défaut de réduction gamétique ou d'une fécondation par le grain de pollen. Lors de cette sélection, seront conservées les plantes 2 n ainsi que les plantes n. Les plantes 2n seront analysées ultérieurement avec des marqueurs moléculaires (étape h2 ci-dessous) afin de faire une sélection plus fine sur entre les plantes 2n dihaploïdes homozygotes ou essentiellement homozygotes et les plantes 2n diploïdes hétérozygotes. Les plantes n haploïdes (chimères ou non) seront conservées en vue d'être analysées également à l'aide de marqueurs moléculaires puis en vue d'obtenir des haploïdes doublées homozygotes ou essentiellement homozygotes après doublement du stock chromosomique. La sélection par cytométrie de flux permet de classer les plantes en deux groupes : haploïdes n et diploïdes 2n.

Comme méthodes alternatives ou complémentaires à la cytométrie de flux, on peut citer le dénombrement chromosomique réalisé sur des pointes racinaires ou le comptage du nombre de chloroplastes dans les cellules de garde des stomates réalisés au microscope optique.

La sélection 112) par l'utilisation d'un marqueur moléculaire offre quant à elle, cette possibilité de discrimination entre les différents types de plantes 2n exposés ci-dessus. Cela permet un gain de temps, d'espace et de coût très important. De plus, cette méthode de sélection offre aussi une plus grande finesse d'analyse puisqu'elle permet également de déterminer si les plantes haploïdes H ou dihaploïdes DH contiennent ou non du génome du parent mâle, et ce de façon fiable et rapide. Ainsi, la méthode de sélection par l'utilisation d'un marqueur moléculaire permet de déterminer l'état d'homozygotie de la plante en question mais aussi son niveau de ploïdie. La sélection h2) par l'utilisation d'un marqueur moléculaire est de préférence une étape 15 h2) de sélection des plantes H et/ou DH comportant : -I- l'utilisation d'un marqueur moléculaire spécifique d'allèle(s) donné(s) contenu(s) dans le matériel génétique du parent mâle irradié pour sélectionner parmi les plantes obtenues à l'issue de l'étape g) les plantes qui sont exemptes de matériel génétique du parent mâle irradié ou qui en possèdent une quantité insuffisante pour provoquer dans la 20 descendance desdites plantes sélectionnées, une disjonction d'un caractère phénotypique et/ou génotypique ; -II- l'utilisation d'un marqueur moléculaire spécifique d' allèle(s) donné(s) contenu(s) dans le matériel génétique du parent femelle hybride, ce(s) marqueurs permettant de déterminer l'état homozygote/hétérozygote, éventuellement le niveau de 25 ploïdie, des plantes à sélectionner c'est-à-dire les plantes obtenues à l'issue de l'étape g), ce(s) marqueur(s) étant utilisé(s) pour sélectionner les plantes homozygotes ou essentiellement homozygotes, en particulier les plantes DH, étant bien précisé que au moins un marqueur utilisé pour chaque analyse peut être un marqueur unique, lors d'une analyse unique, notamment dans le cadre d'un marqueur codominant permettant de 30 discriminer immédiatement entre plusieurs formes alléliques d'un même marqueur génétique. De préférence, on utilise un marqueur moléculaire spécifique d'au moins deux allèles. Ce marqueur moléculaire spécifique d'allèle(s) du matériel génétique du parent mâle 35 irradié et/ou d'un, de préférence deux, allèles donnés contenus dans le matériel génétique du parent femelle hybride est préférentiellement un marqueur microsatellite SSR. Ces différents marqueurs servent donc, d'une part, à identifier les plantes qui ont une partie de matériel génétique mâle dans leur génome et, d'autre part, à différencier les plantes homozygotes des plantes hétérozygotes. Plus on utilise de marqueurs moléculaires, plus le niveau d'homozygotie est défini. Il se peut qu'à un locus donné, la plante apparaisse homozygote avec les marqueurs moléculaires utilisés mais qu'elle ne soit pas homozygote (ou essentiellement homozygote) sur l'ensemble de ses gènes. Il est donc préférable d'utiliser plusieurs marqueurs moléculaires (de préférence au moins 3, particulièrement 5 et plus particulièrement 6) pour sélectionner avec fiabilité les plantes DH. Lesdits marqueurs sont sélectionnés en fonction des génomes des parents utilisés dans la gynogenèse. Ces marqueurs moléculaires permettent de faire la différence entre les plantes haploïdes H et/ou dihaploïdes DH homozygotes qui sont issues des gamètes femelles et les plantes diploïdes (2n) hétérozygotes issues d'une non réduction gamétique, issues d'une fécondation, ou recombinées issues d'une fécondation partielle avec le pollen irradié. Les marqueurs sont avantageusement choisis de manière à identifier des allèles différents entre les plantes femelles donnant les gamètes femelles et les plantes mâles donnant le pollen qui est irradié. Ainsi, une plante issue d'une fécondation partielle possède les allèles provenant des deux plantes parentales (mâle et femelle) alors qu'une plante haploïde H ou dihaploïde DH n'a que les allèles provenant de la plante mère femelle. Les plantes issues de la gynogenèse induite par le pollen irradié et ayant dans leur génome des allèles du parent mâle témoignant ainsi d'une "fécondation" sont donc écartées. Un cas particulier concerne les chimères haploïdes puisque ces dernières ont des allèles provenant de la plante femelle et de la plante mâle, mais chaque allèle n'étant présent que sous une seule copie. Pour schématiser, si la plante femelle porte les allèles A et B et que la plante mâle porte les allèles C, toutes les plantes régénérées portant un allèle C sont considérées comme issues d'une fécondation et sont donc écartées. Seules sont retenues les plantes présentant uniquement l'allèle A ou les plantes présentant uniquement l'allèle B. Les plantes présentant l'allèle A peuvent être des plantes AA lorsqu'elles sont dihaploïdes et A lorsqu'elles sont haploïdes, les plantes présentant l'allèle B peuvent être des plantes BB lorsqu'elles sont dihaploïdes et B lorsqu'elles sont haploïdes. Dans le cas particulier des chimères haploïdes, leur identification sera rendue possible par l'utilisation de plusieurs marqueurs. Ce(s) marqueur(s) moléculaire(s) peut(peuvent) également servir à trier et à écarter les plantes diploïdes issues de gamètes non réduits et identiques à la plante mère, car elles sont hétérozygotes pour des allèles donnés et déterminés du matériel femelle utilisé (plante mère). Dans ce cas, le(s) marqueur(s) moléculaire(s) est(sont) choisi(s) de manière à identifier des allèles qui se trouvent à l'état hétérozygote chez les plantes femelles et donc aussi chez les plantes issues de gamètes non réduits mais qui se retrouvent soit à l'état homozygote pour des plantes dihaploïdes, soit en une seule copie chez les plantes haploïdes.

Pour schématiser, si la plante femelle porte les allèles A et B, toutes les plantes régénérées portant la combinaison d'allèles AB sont considérées comme issues d'un gamète non réduit. Là encore, seules sont retenues les plantes présentant uniquement l'allèle A ou les plantes présentant uniquement l'allèle B. Les marqueurs Selon une forme préférée de l'invention, les marqueurs microsatellites ou SSR sont utilisés pour déterminer, dans les plantes obtenues et testées, à la fois la présence du génome du parent mâle et l'état homozygote/hétérozygote. Ils peuvent également être utilisés pour 10 déterminer le niveau de ploïdie des plantes obtenues et testées.

Selon une forme particulière et remarquable de l'invention, le(s) marqueur(s) moléculaire(s) utilisé(s), pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, est(sont) un(des) marqueur(s) microsatellite(s). Chacun de ces marqueurs moléculaires 15 microsatellites est défini par une séquence nucléotidique donnée d'une taille donnée, amplifiée par PCR grâce à une paire d'amorces spécifiques (une amorce sens et une amorce anti-sens). Pour l'étape de sélection h), le ou les marqueurs moléculaires qui peuvent être utilisés dans la présente invention sont les huit marqueurs suivants CMAGN73, CMBR153, CMBR22, CMMP73, CUCNITRA, FAD2, PATL1,TJ3. Chacun 20 de ces marqueurs est définis par un couple d'amorces nucléotidiques de séquences données (cf. ci-dessous SEQ ID N° 1 à 16). Il est bien évident que pour cette étape h), il est envisageable d'utiliser des marqueurs moléculaires (microsatellites ou non) autres que ces huit marqueurs cités ci-dessus.

25 Les séquences SEQ ID N° 1 à 16 sont particulièrement intéressantes pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Aussi, l'invention vise-t-elle également un marqueur moléculaire susceptible d'être utilisé dans le procédé selon l'invention, du type microsatellite (SSR), et avantageusement choisi dans le groupe des marqueurs microsatellites définis par les couples d'amorces de séquence nucléotidiques annexées 30 SEQ ID N° 1 à 16. Pour accroître la fiabilité de la sélection, il est préférable d'utiliser une combinaison de deux marqueurs moléculaires selon l'invention, à savoir de préférence les marqueurs microsatellites. De manière encore plus préférée selon l'invention, on utilise une combinaison de trois marqueurs moléculaires microsatellites, particulièrement de quatre 35 marqueurs moléculaires microsatellites, et tout particulièrement on choisit une combinaison de cinq marqueurs microsatellites. Il peut bien évidemment être utilisé plus de cinq marqueurs moléculaires si besoin. Pour ces combinaisons de marqueurs5 microsatellites utilisés, les séquences des couples d'amorces définissant le(s) marqueur(s) sont choisies parmi les séquences SEQ N°1 à 16. Les marqueurs microsatellites de séquence SEQ N° 1 à 16 utilisables sont notamment spécifiques de la famille des Cucurbitacées, de préférence du genre Cucurbita et plus 5 préférentiellement encore de l'espèce cucurbita pepo. Le(s) marqueur(s) moléculaire(s) microsatellite(s) (SSR) des courgettes selon l'invention est(sont) choisi(s) en fonction des génotypes de plantes pour la gynogenèse induite par du pollen irradié. Ce(s) marqueur(s) moléculaire(s) microsatellite(s) est(sont) défini(s) par sa(leur) séquence 10 nucléotidique qui sera détectée par amplification par réaction en chaine (PCR) à l'aide d'amorces spécifiques dont les séquences SEQ ID 1 à 16 sont détaillées ci-dessous dans les exemples. Ces amorces peuvent être des fragments de polynucléotides clonés ou des oligonucléotides synthétisés chimiquement.

15 Etape_i) doublemet, çhrpmpspmique Les plantes sélectionnées et/ou obtenues à l'issue de l'étape h, sont les plantes haploïdes H, et dihaploïdes DH. Les plantes H donnent des plantes dihaploïdes DH lorsque le doublement du stock chromosomique est spontané ou haploïdes doublées HD lorsque le doublement du stock chromosomique se fait par traitement chimique ou physique, de 20 préférence à l'aide de colchicine. Le procédé selon l'invention comporte donc de préférence une étape i) de doublement du stock chromosomique des plantes haploïdes H, l'étape de doublement du stock de chromosomes étant réalisée de préférence à l'aide de la colchicine. Les plantes HD déjà 2n sont sorties en terre sous serre tandis que les plantes haploïdes H 25 sont de préférence "colchicinées" in vitro puis repiquées sur milieu approprié, puis enracinées et sorties en terre sous serre. Cette technique de doublement du stock de chromosomes à l'aide de la colchicine, comprend avantageusement les étapes successives suivantes°: 1- Isoler l'apex principal de la plante ainsi que les bourgeons axillaires s'il en existe, 30 2- Préparer une solution de colchicine puis la stériliser, 3- Mettre les boutures dans des petites boites de pétri stériles, 4- Verser une quantité suffisante de colchicine pour les recouvrir puis fermer les boites de Pétri, 5- Laisser tremper pendant plusieurs heures, 35 6- Sortir les boutures et les rincer dans des pots d'eau stérile, 7- Après les avoir légèrement séchées sur papier stérile, repiquer toutes les boutures sur leur milieu d'origine, 8- Repiquer des bourgeons se développant sur le milieu d'origine, 9- Lorsque les boutures sont racinées, les sortir in vivo sur un support comprenant une solution nutritive.

Comme expliqué ci-avant, la présente invention s'étend au-delà de la production de plantes H, HD et DH, par gynogenèse induite par du pollen irradié. Elle propose en effet une nouvelle méthode d'optimisation de cette production de plantes. Cette méthode permet de surmonter le problème de la variabilité multifactorielle et de généraliser la gynogenèse avec irradiation du pollen à de nombreuses espèces végétales.

Cette méthode repose sur une étape préalable de détermination de la (ou des) dose(s) d'irradiation adéquate(s) pour augmenter les rendements d'obtention des plantes, en tenant compte de multiples facteurs tels que l'espèce végétale, les génotypes du parent mâle et du parent femelle, les conditions climatiques et physiologiques, le moment de la récolte des fruits, le niveau de croissance des embryons recueillis en vue de leur culture.

Cette étape préalable consiste essentiellement à mettre en oeuvre, pour chaque dose d'irradiation testée, une étape h') de sélection des plantes H et/ou DH, h') étant semblable à h) telle que définie ci-dessus, pour établir ensuite les rendements en plantes correspondants et in fine déterminer la ou les doses offiant les meilleurs rendements. Outre les rendements en plantes, on peut aussi appréhender dans cette étape préalable d'autres résultats tels que : le pourcentage de fruits obtenus, le pourcentage de graines obtenues, le pourcentage d'embryons et de plantes H, HD et DH, pour une dose d'irradiation donnée. Ainsi la présente invention porte sur un procédé de production de plantes haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH, les HD et DH étant homozygotes ou essentiellement homozygotes, par gynogenèse avec irradiation du matériel reproducteur du parent mâle, caractérisé en ce qu'il comprend une étape préalable de détermination de la (ou des) dose(s) d'irradiation adéquate(s) pour augmenter les rendements desdites plantes en fonction de facteurs multiples donnés et choisis de préférence parmi l'espèce végétale, les génotypes du parent mâle et du parent femelle, les conditions climatiques et physiologiques, le moment de la récolte des fruits, le niveau de croissance des embryons recueillis en vue de leur culture ; le niveau de développement des embryons mis en culture, cette étape préalable consistant : i) à tester, pour un facteur donné, différentes doses d'irradiation sur le matériel végétal reproducteur du parent mâle, ii) à mettre en oeuvre, pour chaque dose d'irradiation testée, une étape h') de sélection des plantes H et/ou DH, ladite cette étape h' comportant : -I- l'utilisation d'un marqueur moléculaire spécifique d'allèle(s) du matériel génétique du parent mâle irradié pour sélectionner parmi les plantes obtenues à l'issue de la gynogenèse induite par du pollen irradié, les plantes qui sont exemptes de matériel végétal du parent mâle irradié ou qui en possèdent une quantité insuffisante pour provoquer, dans la descendance desdites plantes, une disjonction d'un caractère phénotypique et/ou génotypique ; -II- l'utilisation d'un marqueur moléculaire spécifique d'un allèle, de préférence deux allèles donnés spécifiques du matériel génétique du parent femelle hybride mis en oeuvre dans la gynogenèse, ce marqueur permettant de déterminer l'état homozygote/hétérozygote, éventuellement le niveau de ploïdie, des plantes à sélectionner c'est-à-dire des plantes obtenues à l'issue de la gynogenèse, ce marqueur étant utilisé pour sélectionner les plantes homozygotes ou essentiellement homozygotes, en particulier les plantes DH ; iii) à dénombrer, pour chaque dose d'irradiation testée, des plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH obtenues ; iv) à calculer, pour chaque dose d'irradiation testée et à partir des numérations issues de (iii), le rendement en plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH obtenues ; v) à comparer les numérations issues de (iii) et/ou les rendements issus de (iv) pour en déduire la (ou les) dose(s) d'irradiation adéquate(s). Comme évoqué précédemment, l'étape h' comporte l'utilisation de marqueurs et l'ordre d'utilisation du ou des marqueurs moléculaires spécifique(s) d'allèle(s) du matériel génétique mâle et celui(ceux) spécifique(s) d'allèle(s) du matériel femelle importe peu. I et II ne sont pas nécessairement réalisées dans un ordre précis et peuvent être concomitantes (I et II ensembles) ou successives (I puis II ou II puis I).

L'invention porte également sur les plantes H et DH elles-mêmes produites par le procédé tel que défini ci-dessus, sachant que le terme "plante" englobe ici, tous ses stades de développement : embryons, plantule, plante adulte. En particulier, cela vise les embryons haploïdes H et dihaploïdes DH obtenus, en tant que produits intermédiaires, par le procédé selon l'invention tel que défini ci-dessus et les plantes régénérées à partir desdits embryons.

L'invention porte également sur les plantes et plantules HD obtenues par le procédé tel que défini ci-dessus avec l'étape i) de colchicination.

Par ailleurs, l'invention concerne également la descendance ainsi que les semences et les graines provenant des plantes obtenues par le procédé tel que défini ci-dessus. En effet, la présente demande concerne également la descendance des plantes obtenues par le procédé tel que défini ci-dessus, ladite descendance étant obtenue par croisement desdites plantes (HD ou DH) entre elles ou par croisement entre une plante HD ou DH obtenue par le procédé tel que défini ci-dessus et une plante issue d'une lignée ou issue d'autofécondations répétées.

Enfin, l'invention porte également sur les semences de plantes obtenues par le procédé tel 5 que défini précédemment ou à partir des embryons tels que définis ci-dessus, ainsi qu'à partir de plantes issues de la descendance telle que définie ci-dessus.

Les conditions préférentielles de mises en oeuvre des procédés décrits ci-dessus s'appliquent également aux autres objets de l'invention ci-dessus, notamment au procédé 10 d'optimisation de production de plantes par détermination de la dose d'irradiation adéquate, aux embryons et à la descendance des plantes obtenues par les procédés ainsi que leur mise en oeuvre.

Les exemples qui suivent illustrent la présente demande. EXEMPLES

I- Le procédé de fabrication de plantes haploïdes H et/ou dihaploïdes DH par 20 gynogenèse induite par du pollen irradié selon l'invention

Les expérimentations sont réalisées en serre dont la température de nuit est de 15°C et de jour 25°C. Les plantes sont conduites en sac de terreau (2 plantes par sac pour les femelles et 3 plantes 25 par sac pour les mâles), palissées et irriguées au goutte à goutte. La serre est ombrée, ventilée et la régulation des ravageurs se fait par protection biologique intégrée.

Le matériel biologique végétal utilisé se constitue comme suit : 30 Plantes femelles : 2 génotypes. VN001 : 66 Plantes VGO6 : 66 plantes Plantes mâles : 1 génotype JIB : 90 plantes 35 Les plantes sont étiquetées avec un numéro et le nom de leur génotype. 15 Etape a) La veille de l'irradiation (ou ionisation), toutes les plantes mâles et femelles sont contrôlées et seules les fleurs qui serviront pour la pollinisation sont conservées. Le nombre de fleurs mâles au bon stade (l'extrémité de la corolle commence à devenir jaune) est comptabilisé de façon à connaître à peu près le nombre de pollinisation qui sera faite pour chaque dose d'irradiation. Il en est fait de même pour les fleurs femelles au bon stade (l'extrémité de la corolle commence à devenir jaune). Des témoins sont préparés : - Témoin voyageur (V) : les fleurs voyagent dans les mêmes conditions mais ne sont pas 10 irradiées, - Témoin non-voyageur non coupé (NV) : les fleurs sont cueillies juste avant la pollinisation.

Etape b) 15 Les fleurs mâles sont prélevées très tôt le matin (5h30 à 6h). - Conditionnement des fleurs lors du transport et de l'irradiation 10-12 fleurs sont insérées dans chaque bocal qui sera fermé. Les bocaux fermés sont placés dans une glacière contenant un bloc réfrigérant. Sur chaque bocal, le traitement ou le type de témoin est inscrit. L'irradiation du matériel reproducteur du parent mâle se fait le matin 20 pendant une heure. Ceci sera répété à cinq dates différentes et deux doses d'irradiation seront testées dose H 175 Gamma Ray (Gy) dose 0 200 Gamma Ray (Gy)

25 - Estimation du pouvoir germinatif du pollen irradié Le pollen est mis à germer dans une goutte de 45 L de milieu à 15 % de saccharose, 100 mg/L de H3BO3 et 700 mg/L de CaC12, 2H2O. Les gouttes sont déposées sur lame EPDXY et laissées 45 mn en boîte de Pétri dont l'atmosphère est saturée d'eau, à 26°C. 30 Le pourcentage de grains germés et de grains éclatés est estimé à la loupe.

Etape c) Deux heures après l'irradiation, le matériel reproducteur du parent mâle est utilisé pour la pollinisation. 35 Une fleur femelle ou matériel reproducteur du parent femelle est fécondé par une fleur mâle ou matériel reproducteur du parent mâle. Les jours suivant la pollinisation, la nouaison des fruits est vérifiée et si celle-ci ne se fait pas, le fruit est éliminé.

Etape d) Les fruits seront récoltés 4 à 5 semaines après la pollinisation et étiquetés en fonction de leur génotype, du traitement des fleurs mâles ou du type de témoin. Les fruits sont récoltés, de préférence le matin.

Etape e) Chaque fruit est lavé à l'eau et au savon de Marseille, il est rincé et séché. Sous le flux laminaire, de l'alcool à 70° est versé sur le fruit qui est ensuite nettoyé sur toute sa surface avec un papier stérile.

A partir de cette étape, toutes les opérations se dérouleront dans des conditions stériles, sous le flux laminaire. Une incision est réalisée tout autour du fruit puis la chair est écartée à l'aide d'un couteau. Les graines sont récupérées à l'aide d'une cuillère, dégagées de la chair avec une pince et un scalpel puis comptabilisées.

Les graines sont mises en agitation toute la nuit.

Etape 1) Sous flux laminaire, le bocal rond est vidé dans un bocal haut stérile à travers un entonnoir stérile puis rincé avec de l'eau stérile. Les graines sont ouvertes une à une sous la loupe 20 binoculaire à l'aide d'une pince et d'un scalpel. Les instruments sont stérilisés régulièrement pour éviter tout risque de contamination. L'embryon est déposé sur un milieu de culture SIC, dont la composition est détaillée dans les tableaux 8 et 9 ci-dessous, dans des boîtes de Pétri 60x15, 4 embryons par boîte de Pétri. 25 Les embryons obtenus après fécondation par du pollen irradié n'ont pas la même forme que les embryons normaux. Les boîtes de Pétri sont placées à l'obscurité 1 à 2 nuits en chambre à 20/25°C puis elles sont mises à la lumière dans la même chambre à 20/25°C pendant 16 H.

30 Etape g) Les embryons sont mis en culture sur le milieu de culture par le PPM (plant preservative mixture) commercialisé par la société Kalys . Les embryons sont repiqués sur milieu S3P (P = PPM) dont la composition figure dans les tableaux 8 et 9. 35 Les boîtes de Pétri sont surveillées régulièrement. Les embryons sont repiqués s'il y a une contamination par une bactérie ou un champignon. Les embryons sont repiqués tous les 15 jours en boîte de Pétri sur milieu neuf tant qu'ils ne sont pas suffisamment développés.

Dès l'apparition des jeunes feuilles et de petites racines, les embryons sont transférés sur milieu en tubes S3P (cf. composition dans les tableaux 8 et 9). Les plantules bien développées sont ensuite repiquées en bocal sur S2P ou S4P dont les compositions figurent dans les tableaux 8 et 9. Etape h) Dès que le développement foliaire est suffisant, un échantillon de chaque plante est prélevé et il est analysé par cytométrie de flux ainsi qu'à l'aide des marqueurs moléculaires SSR.

10 Etape hl) Un échantillon de chaque plante est prélevé et le niveau de ploïdie est analysé par cytométrie de flux selon les protocoles développés par de Laat et al. dans Theo. Appl. Genet, 1984, 67 :463-467 et dans Plant Breeding,1987, 99 : 303-307. Les plantes à ploïdies indéterminées, anormales, sont écartées et les plantes à n chromosomes sont distinguées 15 des plantes à 2n chromosomes.

Etape h2) Un échantillon de chaque plante est prélevé, l'ADN est extrait selon le protocole CTAB modifié de Tomas et al (1989). Le(s) marqueur(s) SSR est(sont) choisi(s) parmi les SSR 20 définis par les couples d'amorces de séquences SEQ ID 1 à SEQ ID 16 ci-dessous. Le marqueur FAD2 est défini par les couples d'amorces SEQ ID N° 11 et SEQ ID N° 12. La réaction de PCR est réalisée dans un volume réactionnel de 5 l constitué de la moitié de 5 l d'ADN dilué, 0.85 l d'eau, 1 pl de tampon 10x, 1 i de MgC12 (25mM), 1 pl de dNTP (2.5mM), 0.5 pl de chaque amorce (2 M), 0.075 de queue M13 (8 M) et 0.075 de 25 Taq Invitrogen (5U/ l). La réaction de PCR consiste en plusieurs cycles d'amplification décrits comme suit : 1 étape de 5 minutes à 94 °C, 10 cycles à 94 °C pendant 15 secondes puis 57 degrés pendant 15 secondes et enfin 72 °C pendant 30 secondes, puis 30 cycles à 94 °C pendant 15 secondes puis 52 degrés pendant 15 secondes et enfin 72 °C pendant 30 secondes, une 30 élongation finale réalisée à 72 °C pendant 7 minutes.

Pour réaliser l'étape de sélection h (en particulier h2), parmi les huit marqueurs moléculaires microsatellites (SSR) préférés suivants et définis par les amorces nucléotidiques SEQ ID N° 1 à 16 suivantes , les marqueurs FAD2, CMAGN73, 35 CUCNITRA, TJ3, CMBR153 et PALT1 ont été utilisés :5 - Marqueur CMAGN73 défini par le couple d'amorces de séquence nucléotidiques suivantes : 5' ATCCAACTCGACCAAGAAAC 3' (SEQ ID N°1) soit l'amorce sens et 3' CAGCTCTACAACAACATCTC 5' (SEQ ID N°2) soit l'amorce anti-sens.

- Marqueur CMBR153 défini par le couple d'amorces de séquence nucléotidiques suivantes : 5' TCAAAGACAAGAAGACCAACCA 3' (SEQ ID N°3) soit l'amorce sens 10 et 3' TGTGCTAAGAGAGAGAGAGAAGATTG 5' (SEQ ID N°4) soit l'amorce anti-sens.

- Marqueur CMBR22 défini par le couple d'amorces de séquence nucléotidiques suivantes: 15 5' CCAAAACGACCAAATGTTCC 3' (SEQ ID N°5) soit l'amorce sens et 3' ATACAGACACGCCTTCCACC 5' (SEQ ID N°6) soit l'amorce anti-sens.

- Marqueur CMMP73 défini par le couple d'amorces de séquence nucléotidiques 20 suivantes : 5' GCACTTTGAGTAAGAAGCAGA 3' (SEQ ID N°7) soit l'amorce sens et 3' GCTGTGAGGTTGACTACGA 5' (SEQ ID N°8) soit l'amorce anti-sens.

25 - Marqueur CUCNITRA défini par le couple d'amorces de séquence nucléotidiques suivantes : 5' CAAACCATAACTTCCAAGG 3' (SEQ ID N° 9) soit l'amorce sens et 3' GGAGATCGACGAATTTGA 5' (SEQ ID N° 10) soit l'amorce anti-sens. - Marqueur FAD2 défini par le couple d'amorces de séquence nucléotidiques suivantes : 5' CACGAGCAGAGAGATAATAAA 3' (SEQ ID N° 11) soit l'amorce sens et 3' CCTGAAAGAGAGGAAGAAGAA 5' (SEQ ID N° 12) soit l'amorce anti-sens. 30 35 - Marqueur PATLI défini par le couple d'amorces de séquence nucléotidiques suivantes : 5' TACTCCGCCCTCTCTCTC 3' (SEQ ID N° 13) soit l'amorce sens et 3' CAGGTGCAGAATCTGGTAGT 5'(SEQ ID N° 14) soit l'amorce anti-sens. - Marqueur TJ3 défini par le couple d'amorces de séquence nucléotidiques suivantes : 5' TGGGCCTACGCTACAAACTT 3' (SEQ ID N° 15) soit l'amorce sens et 3' AGCAGCACAAAAGCACTTCA 5' (SEQ ID N° 16) soit l'amorce anti-sens. 10

Ces amorces ont été réalisées selon les méthodes connues de l'homme du métier. Pour des marqueurs microsatellites donnés, en fonction de la taille des fragments amplifiés par PCR grâce aux amorces spécifiques (cf. tableaux 3 à 6 ci-dessous), les plantes H, ou DH, ou H 15 et DH ont pu être sélectionnées. Ainsi, les marqueurs moléculaires utilisés permettent, entre autres, de déterminer si une plante est issue ou non d'une fécondation, si elle est homozygote ou non. Si la plante est issue d'une fécondation entre le matériel végétal mâle et le matériel végétal femelle ou si elle n'a pas subi de réduction gamétique, elle est éliminée après analyse avec 20 les marqueurs moléculaires SSR mais si c'est une plante dihaploïde, elle est conservée.

Les plantes n subissent un traitement à la colchicine in vitro pour doubler leur stock chromosomique (cf. étape i) ci-dessous). Ensuite elles sont repiquées, enracinées et sorties

25 Etape i) Le doublement du stock chromosomique (traitement à la colchicine) : 1- Isoler l'apex principal ainsi que les bourgeons axillaires s'il en existe (boutures), 2- Préparer une solution de colchicine à 5 pour 1000 (0.5 g de colchicine dans 100 ml) et la stériliser, 3- Mettre les boutures dans des petites boites de Pétri stériles (BP 35x10) , 30 4- Sous poste de sécurité microbiologique, verser une quantité suffisante de colchicine pour recouvrir les boutures (6 à 8 ml) puis fermer la boite, 5- Laisser tremper 2 heures, 6- Sortir les boutures et les rincer dans des petits pots d'eau stérile, 7- Après les avoir légèrement séchées sur papier stérile, repiquer toutes les boutures en 35 bocaux boule sur leur milieu d'origine, 8- Repiquer des bourgeons se développant sur le milieu d'origine en les numérotant de Cl ( C pour colchicine) à CX, 10 9- Lorsque les boutures sont racinées et donc prêtes, les sortir in vivo sur support coco avec un arrosage de la solution nutritive.

II- Résultats des nouaisons et effectifs en fruits en fonction des génotypes (Tableau 1) Irradiation N° 1 2 3 4 5 Total J-1 Jour et Heure irradiation J-1 J 8H J 811 J 8H 16H 16H Jour et Heure pollinisation J 7H J 111130 J 7H J 12H15 J 11H30 Nombre fruits VG06 10 9 19 11 12 61 VGO6 pollinisés 10 9 19 11 12 61 Nombre fruits VG06 à général terme 100% 100% 100% 100% 100% 100% % d'accrochage de VGO6 Nombre fruits VN001 11 10 19 15 9 61 VN001 pollinisés Nombre fruits VN001 à 11 10 16 14 8 59 général terme 100% 100% 100% 93% 88% 97% % d'accrochage de VN001 VGO6 détail VG06 175 Gy JIB 7 7 13 7 7 41 (Nombre de VG06 200 Gy JIB 3 2 4 2 3 14 fruits) Témoins X X 2 2 2 6 VN001 VN001 175 Gy JIB 7 7 12 9 6 41 détail VN001 200 Gy J1B 3 2 4 5 2 16 (Nombre de Témoins 1 1 X X X 2 fruits) Total 21 19 35 30 20 125 Tableau 1 On constate une très bonne nouaison générale. 127 fécondations ont permis le développement de 125 fruits soit 98% de réussite.

III- Résultats obtenus en fonction des génotypes des parents et de la dose d'irradiation (ionisation) effectuée (Tableau 2)

Les doses 175 Gy et 200 Gy ont été testées sur le matériel végétal reproducteur du parent 5 mâle JIB et les résultats de la gynogenèse avec le matériel végétal femelle (VN001 et VG06) figurent ci-dessous. Génotype Dose Gy Nombre Nombre Nombre moyenne Nombre plantes de fruits graines embryons embryons. en tubes de Taille cm VGO6 175(H) 44 9707 289 0,18 24 200(0) 16 3710 30 0,12 1 VN001 175(H) 41 2435 62 0,13 4 200(0) 16 722 11 0,1 0 Tableau 2 10 Le tableau montre que la dose 200 Gy utilisée pour l'irradiation du pollen est trop forte pour obtenir, avec les génotypes VG06 et VN001, des embryons qui se développent. En revanche, la dose de 175 Gy est mieux adaptée car elle permet de produire non seulement plus de fruits avec les deux génotypes femelles testés (VG06 et VN001) mais également 15 plus d'embryons se développant (24 pour VG06 et 4 pour VN001). IV- Sélection avec les marqueurs moléculaires 20 1. Analyse des plantes issues de VN001

A/ Analyse des plantes afin d'identifier les plantes contenant du matériel génétique du parent mâle (Tableau 3) : Les plantes hybrides VN001 utilisées comme femelle dans le procédé de production de plantes par gynogenèse avec irradiation du matériel reproducteur du parent male possèdent un allèle de 171 paires de base pour le marqueur FAD2 alors que les plantes JIB utilisées comme plante mâle possèdent un allèle de 169 paires de bases pour ce même marqueur. Similairement, l'allèle du marqueur CMAGN73 est de 128 paires de bases pour VN001, alors qu'il est de 132 pour JIB et l'allèle du marqueur Cucnitra est de 160 paires de bases pour VN001, alors qu'il est de 165 pour JIB.

10 Le tableau 3 montre l'analyse moléculaire des plantes issues de VN001 selon le procédé de la présente invention et indique, pour chaque plante testée, la présence ou l'absence de matériel génétique du parent mâle. Marqueurs N° Plante FAD2 CMAGN73 CUCNITRA JIB 169 132 165 VN001 171 128 160 Plante 1 X X X Plante 2 X X X Plante 3 X X Plante 4 X X X X 15 Tableau 3,

Ce tableau 3 montre que les marqueurs FAD2, CMAGN73 et CUCNITRA permettent d'identifier les plantes possédant du génome mâle. Après une PCR utilisant les amorces 20 (SEQ ID N°11 et 12 définies ci-dessus) spécifiques du marqueur moléculaire FAD2, l'analyse de cette PCR révèle pour les plantes 1, 3 et 4 la présence de l'allèle de 169 paires de bases spécifique du matériel reproducteur mâle JIB. Les plantes 1, 2 et 4 possèdent donc du génome mâle dans leur génome. Ces résultats démontrent donc que l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) déterminé(s) (ici CMAGN73, CUCNITRA et particulièrement 25 FAD2) permet de faire une analyse et une sélection efficace et certaine de l'origine des plantes produites.5 B/ Analyse des plantes afin d'identifier les plantes homozygotes des plantes hétérozygotes (Tableau 4) :

Les plantes hybrides VN001 utilisées comme femelle dans le procédé de production de plantes par gynogenèse avec irradiation du matériel reproducteur du parent mâle possèdent un allèle de 130 paires de base et un allèle de 138 paires de bases pour le marqueur TJ3. Similairement, les allèles du marqueur CMBR153 sont de 166 et 182 paires de bases pour VN001, et ceux de PLAT1 sont de 195 et 204 paires de bases.

Le tableau 4 montre l'analyse moléculaire des plantes issues de VN001 selon le procédé de la présente invention et indique, pour chaque plante testée, la présence d'un ou plusieurs allèles de chaque marqueur. Marqueurs N° Plante TJ3 CMBR153 PALT1 VN001 130 138 166 182 195 204 Plante l X X X X Plante 2 X X X Plante 3 X X X X Plante 4 X X X Tableau 4

Ce tableau montre que les plantes 1 et 3 sont hétérozygotes. En effet grâce au marqueur TJ3, on constate la présence d'un allèle de 130 paires de bases et d'un autre allèle de 138 paires de bases. Avec les marqueurs TJ3, CMBR153 et PALT1, les plantes 2 et 4 apparaissent homozygotes. Ces résultats démontrent que l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) déterminé(s) (ici TJ3, CMBR153, PATL1) permet de faire une analyse et une sélection efficace et certaine de l'état homozygote/hétérozygote, et éventuellement de ploïdie, des plantes produites. 2. Analyse des plantes issues de VG06

Al Analyse des plantes afm d'identifier les plantes contenant du matériel génétique du parent mâle (Tableau 5) : Les plantes hybrides VGO6 utilisées comme femelle dans le procédé de production de plantes par gynogenèse avec irradiation du matériel reproducteur du parent male possèdent un allèle de 171 paires de base pour le marqueur FAD2 alors que les plantes JIB utilisées comme plante mâle possèdent un allèle de 169 paires de bases pour ce même marqueur. Similairement, l'allèle du marqueur Cucnitra est de 160 pour VN001, alors qu'il est de 165 pour JIB et l'allèle du marqueur CMAGN73 est de 128 paires de bases pour VGO6, alors qu'il est de 132 pour JIB

10 Le tableau 5 montre l'analyse moléculaire des plantes issues de VGO6 selon le procédé de la présente invention et indique, pour chaque plante testée, la présence ou l'absence de matériel génétique du parent mâle. Marqueur N° Plante FAD2 CUCNITRA CMAGN73 Jib 169 165 132 VGO6 171 160 128 Plante 1 X X X Plante 2 X Plante 3 X Plante 4 X X X X X Plante 5 X X X X Plante 6 X X X X X Plante 7 X X X Plante 8 X X X Plante 9 X X X X Plante 10 X X X X X Plante 1l X X X X Plante 12 X X X X X X Plante 13 X X X X Plante 14 X X Plante 15 X X Plante 16 X X Plante 17 X X Plante 18 X X X Plante 19 X X 15 Tableau 5, De la même façon que pour les analyses avec VN001 (tableau 3), grâce aux marqueurs moléculaires FAD2, CUCNITRA, CMAGN73, ce tableau permet de définir les plantes contenant du génome mâle : les plantes 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 18 et 19. Ces résultats démontrent donc que l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) déterminé(s) (ici FAD2, CUCNITRA, CMAGN73) permet de faire une analyse et une sélection efficace et certaine de l'origine des plantes produites.

B/ Analyse des plantes afm d'identifier les plantes homozygotes des plantes 10 hétérozygotes (Tableau 6) :

Les plantes hybrides VGO6 utilisées comme femelle dans le procédé de production de plantes par gynogenèse avec irradiation du matériel reproducteur du parent male possèdent un allèle de 130 paires de base et un allèle de 138 paires de bases pour le marqueur TJ3. Similairement, les allèles du marqueur CMBR153 sont de 166 et 182 paires de bases pour VGO6, et ceux de PLATI sont de 195 et 204 paires de bases.

Le tableau 6 montre l'analyse moléculaire des plantes issues de VGO6 selon le procédé de 20 la présente invention et indique, pour chaque plante testée, la présence d'un ou plusieurs allèles de chaque marqueur. Marqueurs N° Plante TJ3 CMBR153 PALT1 VGO6 130 138 166 182 195 204 Plante 1 X X X X X Plante 2 X X X Plante 3 X X X X X Plante 4 X X X Plante 5 X X X X X Plante 6 X X X Plante 7 X X X Plante 8 X X X X X Plante 9 X X X X X Plante 10 X X X X X X Plante 1l X X X X Plante 12 X X X X Plante 13 X X X X X X 15 Plante 14 X X X Plante 15 X X X X X Plante 16 X X X X Plante 17 X X X X X Plante 18 X X X X Plante 19 X X X X X Tableau 6 Ce tableau montre qu'avec les marqueurs TJ3, CMBR153 et PALT1, seules les plantes 4 et 6 sont homozygotes, les autres plantes apparaissant hétérozygotes avec ces marqueurs moléculaires. Ces résultats démontrent que l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) déterminé(s) (ici TJ3, CMBR153, PATL1) permet de faire une analyse et une sélection efficace et certaine de l'état homozygote/hétérozygote, et éventuellement de ploïdie, des plantes produites. V- Tableau récapitulatif de l'effet des doses d'irradiation sur l'obtention de plantes hétérozygotes et de plantes haploïdes (Tableau 7) Doses Année Nombre de Nombre de plantes Nombre de d'irradiation plantes testées hétérozygotes (2n) plantes haploïdes par cytométrie (n) de flux et SSR 25 Gy/150Gy 2003 628 628 0 125 Gy /150Gy 2004 1734 1734 0 125 Gy 2005 2931 2931 0 125 Gy /150Gy 2006 461 460 0 175Gy/ 200Gy 2007 20 10 10 Tableau 7 20 Les doses de 25 à 50 Gy entrainent la production de nombreuses plantes, toutes identifiées comme hétérozygotes. La dose de 175 Gy permet non seulement de diminuer le nombre de plantes produites à analyser mais aussi d'augmenter considérablement le nombre de plantes haploïdes parmi les plantes produites. Comme ceci a été largement expliqué ci- 25 dessus, ces plantes haploïdes sont particulièrement intéressantes. Par conséquent, ce tableau démontre que la dose d'irradiation influe sur la réussite du procédé mis en ouvre 10 dans la présente invention et que cette dose peut s'optimiser pour une meilleure production de plantes haploïdes. Ainsi, avec la dose de 175 Gy, il est possible d'améliorer la production de plantes haploïdes H et haploïdes doublées HD, par gynogenèse induite par un gamétophyte mâle irradié et d'obtenir par conséquent une stabilisation du génome des plantes produites avec un nombre réduit de générations. VI- Milieux de culture Composition SIC S3P S2P S4P TZ2 X %2 X TZ4 X X Saccharose 30/g/1 5g/1 5g/1 Plant Preservation Mixture lml/1 1 ml/l 1 ml/l (Kalys ) Vitro Agar 8 g/1 8 g/1 8 g/1 8 g/1 pH 5.9 5.9 5.9 5.9 Autoclavage 120°C/20 mn Kinetine 0.05 mg/1 0.05 mg/1 Naphtaleneacetic acid 0.05 mg/1 0.05 mg/1 Céfotaxime 300mg/1 Tableau 8 Composition milieux TZ2 TZ4 15 Macro Murashige et Skoog X Macro CP X Micro Murashige et Skoog X Micro CP X Vitamines MOREL X 20 Vitamines P X Saccharose 3% Tableau 9 25 Détails des compositions du tableau 9 : - Milieu TZ4 sans sucrose ni agar : Macro élément CP : en mg . L -1 KNO3 2150 NH4NO3 1238 Ca(NO3)2, 4 H2O 50 CaC12,2H2O 313 MgSO4,7H2O 412 KC1 7 Na H2PO4,H2O 38 KH2PO4 142 (NH4)2SO4 34 Fer EDTA : en mg. L -1 FeSO4,7H2O 27,8 Na2EDTA 37,8 Micro Elément CP : en mg L -1 MnSO4,H2O 22,13 H3BO3 3,15 ZnSO4,7H2O 3,62 Na2MoO4 0,188 CuSO4,5H2O 0,016 CoC12 0,016 KI 0,695 Vitamines P : en g. L -1 50,35 mg . L -1 Méso Inositol Thiamine 600 g. L -1 Acide nicotinique 700 Pyridoxine 5500 Panthothénate de calcium 500 Biotine 5 - Milieu TZ2 avec sucrose : Macro élément MS : en mg L -1 KNO3 1900 NH4NO3 1650 Ça Cl2 332.02 Mg SO4, 180.54 KH2PO4 170 FeNa EDTA : 36.70 45 Micro Elément MS : en mg . L MnSO4,H20 16.90 H3BO3 6.20 ZnSO4, 7H20 8.60 Na2MoO4, 2H20 0,25 CuSO4,5H20 0,025 CoC12, 6H20 0,025 KI 0,83 Vitamines MOREL : en mg. L -1 Méso Inositol 100 mg . L -1 Thiamine 1 Acide nicotinique 1 Pyridoxine 1 Panthothénate de calcium 1 Biotine 0.01 Sucrose : 30 000.00 mg/l

Claims (16)

1. REVENDICATIONS1- Procédé de production de plantes haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH, les HD et DH étant homozygotes ou essentiellement homozygotes, ce procédé étant du type de ceux relevant de la technique de gynogenèse induite par du pollen irradié, caractérisé en ce qu'il comprend : une étape d'irradiation du matériel reproducteur du parent mâle à une dose comprise entre 160 et 190 Gamma Ray, de préférence entre 165 et 185 Gamma Ray 10 (Gy), ou une étape de sélection des plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH par utilisation de marqueur(s) moléculaire(s), ou une étape d'irradiation du matériel reproducteur du parent mâle à une dose comprise entre environ 165 et 185 Gamma Ray (Gy) et une étape de sélection des 15 plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH par utilisation de marqueur(s) moléculaire(s).
2. 2- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : 20 a) Mettre en oeuvre du matériel reproducteur du parent mâle, b) Irradier ledit matériel reproducteur du parent mâle à une dose comprise entre 160 et 190 Gamma Ray (Gy), de préférence entre 165 et 185 Gamma Ray, c) Polliniser le matériel reproducteur du parent femelle hybride avec ledit matériel reproducteur du parent mâle irradié, 25 d) Récolter les fruits dont les graines portent des embryons, e) Extraire les graines desdits fruits, f) Extraire les embryons desdites graines, g) Mettre en culture les embryons sur un milieu approprié jusqu'à l'obtention d'une plante. 30
3. 3- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comporte en outre, après l'étape g), une étape h) consistant à sélectionner les plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH par cytométrie de flux, ou par utilisation de marqueur(s) moléculaire(s), ou par cytométrie de flux et utilisation de 35 marqueur(s) moléculaire(s).
4. 4- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'étape h de sélection des plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH comporte : -I- l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) spécifique(s) d'allèle(s) donné(s) contenu(s) dans le matériel génétique du parent mâle irradié pour sélectionner parmi les plantes obtenues à l'issue de l'étape g), les plantes qui sont exemptes de matériel génétique du parent mâle irradié ou qui en possèdent une quantité insuffisante pour provoquer dans la descendance desdites plantes, une disjonction d' un caractère phénotypique et/ou génotypique; -II- l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) spécifique(s) d'allèle(s) donné(s) contenu(s) dans le matériel génétique du parent femelle hybride, ce(s) marqueur(s) permettant de déterminer l'état homozygote/hétérozygote des plantes à sélectionner c'est-à-dire les plantes obtenues à l'issue de l'étape g), ce(s) marqueur étant utilisé(s) pour sélectionner les plantes homozygotes ou essentiellement homozygotes, en particulier les plantes DH.
5. 5- Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape i) de doublement du stock chromosomique des plantes haploïdes H.
6. 6- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'étape i) de doublement du stock de chromosomes est réalisée à l'aide de la colchicine. 25
7. 7- Procédé, en particulier selon l'une des revendications précédentes, de production de plantes haploïdes H, haploïdes doublées HD et/ou dihaploïdes DH, les HD et DH étant homozygotes ou essentiellement homozygotes, par gynogenèse induite avec irradiation du matériel reproducteur du parent mâle, caractérisé en ce qu'il comprend une étape préalable de détermination de la (ou des) 30 dose(s) d'irradiation adéquate(s) pour augmenter les rendements desdites plantes en fonction de facteurs multiples donnés et choisis de préférence parmi l'espèce végétale, les génotypes du parent mâle et du parent femelle, les conditions climatiques et physiologiques, le moment de la récolte des fruits, le niveau de croissance des embryons recueillis en vue de leur culture, le niveau de développement des embryons mis en culture, 35 cette étape préalable consistant : i) â tester, pour un facteur donné, différentes doses d'irradiation sur le matériel végétal reproducteur du parent mâle,20ii) à mettre en oeuvre, pour chaque dose d'irradiation testée, une étape h') de sélection des plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH, ladite cette étape h' comportant : -I- l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) spécifique(s) d'allèle(s) du matériel génétique du parent mâle irradié pour sélectionner parmi les plantes obtenues à l'issue de la gynogenèse induite par du pollen irradié, les plantes qui sont exemptes de matériel végétal du parent mâle irradié ou qui en possèdent une quantité insuffisante pour provoquer, dans la descendance desdites plantes, une disjonction d'un caractère phénotypique et/ou génotypique ; -II- l'utilisation de marqueur(s) moléculaire(s) spécifique(s) d'allèle(s) donné(s) spécifique(s) du matériel génétique du parent femelle hybride mis en oeuvre dans la gynogenèse, ce(s) marqueur(s) permettant de déterminer l'état homozygote/hétérozygote des plantes à sélectionner c'est-à-dire des plantes obtenues à l'issue de la gynogenèse, ce(s) marqueur(s) étant utilisé(s) pour sélectionner les plantes homozygotes ou essentiellement homozygotes, en particulier les plantes DH ; iii) à dénombrer, pour chaque dose d'irradiation testée, des plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH obtenues ; iv) à calculer, pour chaque dose d'irradiation testée et à partir des numérations issues de (iii), le rendement en plantes haploïdes H, ou DH, ou H et DH obtenues ; v) à comparer les numérations issues de (iii) et/ou les rendements issus de (iv) pour en déduire la (ou les) dose(s) d'irradiation adéquate(s).
8. 8- Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les 25 plantes parents sont choisies dans le genre Cucurbita.
9. 9- Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le(s) marqueur(s) moléculaire(s) utilisé(s) est(sont) un(des) marqueur(s) microsatellite(s) (SSR).
10. 10- Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le(s) marqueur(s) moléculaire(s) utilisé(s) est(sont) choisi(s) parmi les marqueurs définis par un ou des couples d'amorces de séquences nucléotidiques SEQ ID N° 1 à 16. 30 35
11. 11- Marqueur moléculaire, caractérisé en ce qu'il est un marqueur microsatellite (SSR) choisi parmi les marqueurs définis par un ou des couples d'amorces de séquences nucléotidiques annexées SEQ ID N° 1 à 16.
12. 12- Embryons haploïdes H de plantes tels qu'obtenus par le procédé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 10.
13. 13- Embryons dihaploïdes DH de plantes tels qu'obtenus par le procédé tel que défini 10 dans l'une des revendications 1 à 10.
14. 14- Descendance des plantes obtenues par le procédé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 10. 15
15. 15- Descendance des plantes obtenues par le procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 10, ladite descendance étant obtenue par croisement entre deux plantes (HD ou DH) issues du procédé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 10 ou par croisement entre une plante HD ou DH issue du procédé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 10 et une plante issue d'une lignée stable ou issue d'autofécondations 20 répétées.
16. 16- Semences de plantes obtenues par le procédé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 10 ou à partir des embryons tels que définis dans l'une des revendications 12 ou 13, ainsi qu'à partir de plantes issues de la descendance telle que 25 définie dans l'une des revendications 14 ou 15.5