CN110305800B - 一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法，包括以下具体步骤：第一步，将菌丝置于液体培养基中培养得到成熟的菌丝体；第二步，制备染色菌丝液或染色原生质体悬浮液；第三步，确定二倍体和单倍体的分选参数，第四步，分选得到菌丝单倍体或原生质体单倍体。本发明优点在于克服了传统单倍体分选得率低、培育周期长的技术问题，本发明的整个培育过程可实现无菌分离，避免单倍体感染，同时培育周期短，分选得到的单倍体得率高，可直接作为杂交育种的原料，特别适用于平菇、香菇、木耳等二倍体食用菌的单倍体分离，为食用菌新品种的培育打下基础。

Description

一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法

技术领域

本发明涉及食用菌育种技术，尤其是涉及一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法。

背景技术

食用菌味道鲜美、营养丰富、具有很高的食用价值，有“素中之荤”的美誉。随着民众生活水平的提高，民众对食用菌的消费需求日益增加，对食用菌种类的要求也越来越多样化，仅河南的食用菌栽培种类多达30多种。因而，目前急需研发选育新的食用菌品种以填补市场空白、满足市场发展需求、满足民众消费需求。

食用菌育种技术主要有杂交育种、诱变育种、转基因育种等，杂交育种食用菌生产中最为快速有效、应用最多的育种方法，而在杂交育种中，获得大量单倍体是杂交育种的基础，现有食用菌单倍体的获取方式主要有单孢分离和原生质体分选，单孢分离包括孢子收集、多次梯度稀释、涂布、培养、挑选，鉴定等步骤后培育得到带细胞壁的单核菌丝（即菌丝单倍体），整个培育周期需要25天左右，耗时长且分选率低；原生质体分选包括菌丝体培养、制备原生质体、转接培养、人工挑取菌落后再生培养、镜检，最后得到不带细胞壁的单核原生质体（即原生质体单倍体），整个培育过程中人工挑取工作量大，挑取成功率小，使得再生培养后的单倍体得率仅为30%～60%，远远无法满足食用菌新品种的培育需求。

发明内容

本发明目的在于提供一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法，分离周期短，且单倍体收率高达90%以上，可以直接作为杂交育种材料。

为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：

本发明所述的食用菌单倍体的无菌快速分离方法，包括以下具体步骤：

第一步，将菌丝置于液体培养基中于25℃培养3～8天，无菌过滤得成熟的菌丝体；

第二步，取第一步得到的菌丝体于无菌离心管内，加入研磨珠研磨30～120s；将研磨后的菌丝体进行处理得到染色菌丝液或染色原生质体悬浮液；

第三步，将第二步得到的染色菌丝液或染色原生质体悬浮液用流式细胞仪进行倍性分析，找到有效的峰值区域，确定菌丝单倍体或原生质体单倍体的区域间阈值的M值，菌丝二倍体或原生质体二倍体的区域间阈值的M值，以及菌丝单倍体M值和菌丝二倍体M值的倍数关系或原生质体单倍体M值与原生质体二倍体M值的倍数关系；

第四步，按照第三步中确定的菌丝单倍体M值和菌丝二倍体M值调整流式细胞仪的分选参数，利用流式细胞仪对第二步中的染色菌丝液进行分选，收集得到菌丝单倍体；

或者按照第三步中确定的原生质体单倍体M值和原生质体二倍体M值调整流式细胞仪的分选参数，利用流式细胞仪对第二步中的染色原生质体悬浮液进行分选，收集得到原生质体单倍体。

所述第二步中将菌丝体处理成染色菌丝液的具体方法为：三角瓶内加入裂解液，将研磨后的菌丝转移至三角瓶内裂解20～40min，过滤，滤液内加入DAPI染色剂染色10～20min，得到染色菌丝液。

所述第二步中将菌丝体处理成染色原生质体悬浮液的具体方法为：三角瓶内加入酶解液，将研磨后的菌丝体转移至三角瓶内，酶解3～5h，过滤，依次用KCl溶液、STC溶液洗涤，再用STC溶液悬浮得到原生质体悬浮液，向原生质体悬浮液中加入DAPI染色剂染色10～20min得染色原生质体悬浮液。

所述第二步菌丝体酶解时菌丝体的重量与酶解液的体积比为1:5～1:10。

所述第二步中的酶解液为溶壁酶溶液，具体配制方法为：称取0.3g溶壁酶溶解在3mL N-buffer中，待溶壁酶完全溶解后用微孔过滤膜过滤除菌，向滤液中添加17mL P-buffer制得浓度为1.5%的酶解液。

所述第二步中菌丝体的酶解温度为30～37℃。

本发明优点在于克服了传统单倍体分选得率低、培育周期长的技术问题，本发明的整个培育过程可实现无菌分离，避免单倍体感染，且单倍体培育周期短，分选得到的单倍体得率高，可直接作为杂交育种的原料，特别适用于平菇、香菇、木耳等二倍体食用菌的单倍体分离，为食用菌新品种的培育打下基础。具体体现在以下两点：

1）、本发明直接对裂解后的菌丝液进行分选得到带有细胞壁的菌丝单倍体，周期短，分离方法简单，菌丝单倍体中的单倍体含量在90%以上（即单倍体得率≥90%），可直接作为杂交育种的原料；

2）、本发明对菌丝体进一步处理成原生质体悬浮液，将原生质体悬浮液分选得到没有细胞壁的单倍体，虽然分离方法相对复杂，但是单倍体分离效果更好，单倍体得率高达99%以上，能够直接用于杂交育种的原料。

附图说明

图1是本发明原生质体单倍体、二倍体的倍性关系图。

图2是本发明原生质体单倍体中单倍体的分布图。

图3是本发明不同浓度原生质体单倍体的再生萌发图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行更加详细的说明，其中所用实验试剂均为市售产品，本发明的平菇菌丝品种均为黑平16-1。

实施例1

本实施例以平菇菌丝为原材料，在无菌环境中将平菇菌丝培养成熟后利用流式细胞仪分选即可得到菌丝单倍体，具体包括以下步骤：

第一步，将生长条件良好的平菇菌丝接种到PDA液体培养基中，然后于摇床（摇床速度为150rpm）内在25℃培养3～5天，用5层无菌擦镜纸过滤收集得到成熟的平菇菌丝体；

第二步，取第一步得到的菌丝体于无菌离心管内，加入研磨珠机器研磨120s；三角瓶内加入裂解液，将研磨后的菌丝体转移至三角瓶内裂解20min，过滤，向滤液内加入DAPI染色剂染色10～20min得染色菌丝液；

第三步，取第二步得到的染色菌丝液用流式细胞仪（流式细胞仪型号为CUBE8，倍性分析前先对流式细胞仪紫外消毒30min，再利用酒精对其上样口和出样口消毒）进行倍性分析，调节仪器的不同域值，找到有效的峰值区域，确定菌丝单倍体区域间阈值的M值和菌丝二倍体的区域间阈值的M值，菌丝单倍体的M值和菌丝二倍体的M值成倍数关系，结果见表1；

表1菌丝体的倍性分析

从表1可以看出，菌丝单倍体的M值和菌丝二倍体的M值成倍数关系，能够做倍性分析，且菌丝单倍体和菌丝二倍体显著分离；

第四步，按照菌丝单倍体的M值和二倍体的M值设定流式细胞仪的分选参数，在流式细胞仪出样口处连接无菌试管，点击流式细胞仪的分选按钮对染色菌丝液进行分选，收集得到菌丝单倍体。

本实施例第一步、第二步、第三步和第四步均在无菌条件下进行。

对收集的菌丝单倍体进行倍性分析验证：用流式细胞仪对第三步中的菌丝单倍体进行倍性分析，圈定菌丝单倍体中的单倍体区域。结果表明，分选得到的菌丝单倍体中的单倍体区域≥90%，即单倍体的得率≥90%。因此，本实施例分选得到的菌丝单倍体可直接作为杂交育种的材料。

实施例2

本实施例以平菇菌丝原材料，先将平菇菌丝培养为成熟的菌丝体，再利用成熟的菌丝体制备原生质体，利用流式细胞仪对原生质体进行分选即可得到原生质体单倍体，具体包括以下步骤：

第一步，将生长条件良好的平菇菌丝接种到PDA液体培养基中，然后于摇床（摇床速度为150rpm）内在25℃培养3～5天，用5层无菌擦镜纸过滤收集得到成熟的平菇菌丝体；

在平菇菌丝体培养过程中，配制以下溶液：

P-buffer（即0.6M 缓冲渗稳剂）：称取39.35g MgSO₄、1.76g柠檬酸三钠，用蒸馏水溶解后转移至200mL容量瓶内定容，定容后调节pH至5.5；

N-buffer：称取9.11g（原为9.105g，统一小数点）山梨醇、0.74g柠檬酸三钠，用蒸馏水溶解后转移至50mL容量瓶内定容，定容后调节pH至5.8；

STC溶液：称取18.21g山梨醇、二水合氯化钙，用80ml蒸馏水完全溶解后加入5mL浓度为1M的Tris-HCl（pH=8.0），混合均匀后转移至100mL容量瓶内定容；

0.6M KCl溶液：称取2.68g KCl，用蒸馏水溶解后转移至60mL容量瓶内定容；

上述四种溶液配制后经121℃灭菌30min后室温保存备用；

酶解液配制：称取0.3g溶壁酶溶解在3mL N-buffer中，待溶壁酶完全溶解后用0.25μm微孔过滤膜过滤除菌，向滤液中添加17mL P-buffer制得浓度为1.5%的酶解液；

第二步，称取1mg第一步中的菌丝体于1.5mL离心管内，向离心管内添加2个研磨珠，研磨机研磨60s；量取5mL酶解液于三角瓶内，将研磨后的菌丝体转移至三角瓶内密封，将三角瓶置于摇床内于30℃酶解3h，过滤（滤液直接过滤到无菌离心管内），向滤液内加入30mL 0.6M KCl溶液，摇晃使滤液与KCl溶液充分混匀，于4℃下离心10min（离心机转速为4000r/min），弃上清液；再向离心管内加入10 mL STC溶液，摇晃充分混匀，于4℃下离心10min（离心机转速为4000r/min），弃上清液；再向离心管内加入10 mL STC溶液充分悬浮得原生质体悬浮液；量取原生质体悬浮液稀释后加入DAPI染色剂染色20min；

第三步，取第二步得到的染色原生质体悬浮液用流式细胞仪进行倍性分析，调节仪器的不同域值，找到有效的峰值区域，确定原生质体单倍体区域间阈值的M值和原生质体二倍体的区域间阈值的M值，具体如图1（图1中左峰为原生质体二倍体，右峰为原生质体单倍体）所示；原生质体单倍体的M值和原生质体二倍体的M值成倍数关系，结果见表2；

表2 原生质体的倍性分析参数

从图1可以看出，原生质体上机检测后，能够明显区分原生质体单倍体和原生质体的峰值；从表2可以看出，原生质体单倍体和二倍体显著分离；

第四步，按照原生质体单倍体的M值和二倍体的M值设定流式细胞仪的分选参数，流式细胞仪的出样口处连接无菌试管，点击流式细胞仪的分选按钮对染色后的原生质体悬浮液进行分选，收集得到原生质体单倍体。

本实施例第一步、第二步、第三步和第四步均在无菌条件下进行。

对第四步中的原生质体单倍体中单倍体数量进行验证：

（a）、倍性分析验证：利用流式细胞仪对第四步中的原生质体单倍体进行倍性分析，结果如图2所示。

从图2可以看出，图2中方框内为原生质体二倍体的含量，仅为0.4%，故本实施例第四步分选得到的原生质体单倍体中单倍体的得率为99.6%。

（b）、对第四步中收集的原生质体单倍体进行显微镜镜检验证，具体验证方法为：将收集到的原生质体单倍体分别稀释至不同倍数（可以为100倍、1000倍等），重复本申请第二步中原生质体悬浮液制备相关步骤，将稀释后的原生质体单倍体制成单倍体悬浮液，无菌吸取0.5mL单倍体悬浮液注入到PDA培养基内于25℃下再生培养7天，不同稀释倍数的原生质体单倍体再生培养萌发后的状态如图3所示。从图3可以看出，稀释1000倍后比较容易挑取培养。

原生质体单倍体萌发后镜检，镜检时以无索状联合现象为原生质体单倍体的标志。多次再生培养镜检结果表明，再生培养为单倍体的数量≥99%。

因此，本实施例分选得到的原生质体单倍体可直接作为杂交育种材料。

Claims (3)

1.一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法，其特征在于：包括以下具体步骤：

第一步，将菌丝置于液体培养基中于25℃培养3～8天，无菌过滤得成熟的菌丝体；

第二步，取第一步得到的菌丝体于无菌离心管内，加入研磨珠研磨30～120s；将研磨后的菌丝体进行处理得到染色菌丝液或染色原生质体悬浮液；其中，将菌丝体处理得到染色菌丝液的具体方法为：向三角瓶内加入裂解液，将研磨后的菌丝转移至三角瓶内裂解20～40min，过滤，滤液内加入DAPI染色剂染色10～20min，得到染色菌丝液；

将菌丝体处理得到染色原生质体悬浮液的具体方法为：三角瓶内加入酶解液，将研磨后的菌丝体转移至三角瓶内，酶解3～5h，过滤，依次用KCl溶液、STC溶液洗涤，再用STC溶液悬浮得到原生质体悬浮液，向原生质体悬浮液中加入DAPI染色剂染色10～20min得染色原生质体悬浮液；其中，所述酶解液为溶壁酶溶液，具体配制方法为：称取0.3g溶壁酶溶解在3mL N-buffer中，待溶壁酶完全溶解后用微孔过滤膜过滤除菌，向滤液中添加17mL P-buffer制得浓度为1.5%的酶解液；

P-buffer为0.6M缓冲渗稳剂，其配制方法包括以下内容：称取39.35g MgSO₄ 、1.76g柠檬酸三钠，用蒸馏水溶解后转移至200mL容量瓶内定容，定容后调节pH至5.5；

N-buffer的配制方法包括以下内容：称取9.11g山梨醇、0.74g柠檬酸三钠，用蒸馏水溶解后转移至50mL容量瓶内定容，定容后调节pH至5.8；

第三步，将第二步得到的染色菌丝液或染色原生质体悬浮液用流式细胞仪进行倍性分析，找到有效的峰值区域，确定菌丝单倍体或原生质体单倍体的区域间阈值的M值，菌丝二倍体或原生质体二倍体的区域间阈值的M值，菌丝单倍体M值和菌丝二倍体M值的倍数关系或原生质体单倍体M值与原生质体二倍体M值的倍数关系；

第四步，按照第三步中确定的菌丝单倍体M值和菌丝二倍体M值调整流式细胞仪的分选参数，利用流式细胞仪对第二步中的染色菌丝液进行分选，收集得到菌丝单倍体；

或者按照第三步中确定的原生质体单倍体M值和原生质体二倍体M值调整流式细胞仪的分选参数，利用流式细胞仪对第二步中的染色原生质体悬浮液进行分选，收集得到原生质体单倍体。

2.根据权利要求1所述食用菌单倍体的无菌快速分离方法，其特征在于：所述第二步菌丝体的重量与酶解液的体积比为1:5～1:10。

3.根据权利要求1所述的食用菌单倍体的无菌快速分离方法，其特征在于：所述第二步中菌丝体的酶解温度为30～37℃。

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