CN115747078A

CN115747078A - 一株牛排菇高产菌株及其选育方法

Info

Publication number: CN115747078A
Application number: CN202211251730.XA
Authority: CN
Inventors: 应汉杰; 魏荷芬; 陈勇; 刘庆国; 温庆仕; 薛施锦; 周萍; 徐雯晖
Original assignee: Nanjing Institute Of White Biotech Co ltd; Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Institute Of White Biotech Co ltd; Nanjing Tech University
Priority date: 2022-10-13
Filing date: 2022-10-13
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本发明属于食用菌选育技术领域，具体涉及一株高产蛋白的大型食用真菌及其选育方法。所述的高产蛋白的大型食用真菌，分类命名为牛排菇(Fistulln hepatica)，菌株号GXGD‑EF‑8‑1，已于2022年08月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221254。其选育方法包括如下步骤：牛排菇菌丝体的制备、菌丝体悬液的制备、菌丝体酶解制备原生质体、ARTP诱变、初筛、摇瓶复筛，得到牛排菇高产菌株GXGD‑EF‑8‑1。本发明通过对牛排菇原生质体制备过程中稳定剂和酶解液的优化，提升了牛排菇原生质体的释放率和再生率，并利用ARTP诱变技术选育出了一株能够快速生长和高产蛋白的牛排菇菌株。

Description

一株牛排菇高产菌株及其选育方法

技术领域

本发明属于食用菌选育技术领域，具体涉及一株牛排菇高产菌株及其选育方法。

背景技术

牛排菇(Fistulln hepatica)又名洋松茸、波多黎各菌、褐菇、猪肝菌、猪舌菌、日本称肝脏茸、鲜血茸，菇肉质松软、多汁、红褐色、短柄式或无、香味浓，可以入药，食疗补血作用。牛排菇是寒温带至亚热带地区一种珍稀的食用菌，食之鲜嫩，具有特殊的柠檬香味，富含维生素C及多种氨基酸。经常食用可减少胆固醇累积，降低血压，增加人体免疫力，防治坏血病；并且可以入药，具有消炎化积、治疗胃肠炎和补血作用。牛排菌的发酵菌丝中含有一种新的抗真菌抗生素(牛排菌素)，其能强烈抑制肉瘤5180。并且含有一种稀有氨基酸-丁氨酸，是一种名贵的色形味具全、药食兼优的美味食用菌，有“山上的牛肉”之美誉，深受消费者青睐，商品价值高，可大面积生产。该菌价格昂贵，市场缺口很大。

我国的大型食用真菌的人工栽培主要采用二次发酵料床架式栽培模式，层播或穴播麦粒种等固体菌种，液体菌种的应用较少。液体菌种具有生产周期短、萌发点多、发菌一致、发菌速度快等优点，在食用菌制种与栽培中应用潜力较大。何培新等人通过单因素实验和均匀设计对牛排菇SB65菌株的液体菌种培养基和培养条件进行了优化，初始pH＝7.2，培养温度28℃，培养时间12d，摇床转速160r/min，装液量50mL/250mL三角瓶，接种量8％(v/v)时获得菌丝体的生物量为4.579g/L。其产量仍较低，菌株的生长周期仍较长，关于牛排菇的菌株特性改良提升成为工业化应用中的关键问题。

牛排菇属于大型食用菌，通常因其存在较厚细胞壁结构，造成菌种选育的困难，因此需要对其分纯复壮及相关菌株改良工作，去壁处理成了首先解决的问题，即原生质体的制备。原生质体的成功制备是原生质体诱变、融合育种技术的必要条件。但是目前制备原生质体试剂盒中的几种酶，例如Yatalase、Lysing Enzymes、β-Glucuronidase、崩溃酶，这些酶因其价格昂贵，效果不理想，造成限制规模化推广的主要因素。本案例中将通过使用较为廉价易得的蜗牛酶、纤维素酶、壳聚糖酶、几丁质酶、果胶酶中的一种或几种，作为主要的溶壁作用，通过调整酶活、添加量以及其他条件参数，来控制其原生质体在再生率，为进一步的菌种选育提供充足的备选种质资源。

目前针对大型食用真菌菌株的选育方法，单纯的通过原生质体的制备和再生难以满足的实际需求，通过结合其他育种技术，其中将原生质体的制备和再生与诱变育种技术的结合，可以有效提高菌种的选育水平。该方法不仅能对菌株进行脱毒复壮，还能通过基因错配提高优良基因的突变率，为菌株的进一步选育提供充足的种质资源。

在现有技术中，发现目前食用菌的粗蛋白水平整体较低，其中平菇的蛋白含量在19-24％；杏鲍菇蛋白含量在14-23％；茶树菇蛋白含量在24-30％；香菇蛋白含量在8-20％；金针菇蛋白含量在11-18％，等。本案例的出发菌株选择为牛排菇，其粗蛋白含量有25％～33％，在食用菌蛋白菌株中处于较优出发蛋白，暂无关于其菌株选育的相关报道。本案例将通过原生质体的制备以及ARTP(常温等离子)诱变等诱变技术，对其生长速度和蛋白产量进行提高筛选。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株牛排菇高产菌株。

本发明还要解决的技术问题是提供上述牛排菇高产菌株的选育方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一株牛排菇高产菌株，分类命名为牛排菇(Fistulln hepatica)，菌株号GXGD-EF-8-1，已于2022年08月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221254。

其中，所述的牛排菇高产菌株，其生长速度最高达17.05mm/d，有机物含量(干重)最高达20.28g/L，蛋白含量最高达42.50％。

上述牛排菇高产菌株的选育方法，包括如下步骤：

(1)牛排菇菌丝体的制备：将出发菌株牛排菇子实体段用75％v/v酒精消毒后，用无菌水反复浸洗，切除子实体外层组织，在子实体心部切取米粒大小组织接种于改良PDA平板上，于26℃避光培养3-5d后，将生长出的白色菌丝体进行转接分纯，获得纯种牛排菇菌丝体。

(2)菌丝体悬液的制备：将步骤(1)获得的纯种牛排菇菌丝体，按照5-6块/瓶，接入种子液中，26℃、150rpm培养2-3d；然后经振荡过滤收集菌丝体悬液，10000rpm、4℃离心10min后，收集菌丝体，用稳定剂冲洗1-2遍，再用酶解液重悬制备菌丝体悬液。

(3)菌丝体酶解制备原生质体：将步骤(2)得到的菌丝体悬液，置于30℃，200rpm条件下，酶解3h制备原生质体悬液。

(4)原生质体的再生：将步骤(3)原生质体悬液浓度调整到10⁶个/mL，取0.1mL原生质体悬浮液涂布于再生培养基上，观察、计算原生质体的再生率，并将原生质体再生菌株分纯复壮，筛选生长快速，菌落较大的再生菌株。

(5)ARTP诱变：将步骤(4)筛选的再生菌株制备原生质体悬液，调整原生质体的数量在10⁵-10⁶CFU/mL；取10μL调整后的悬液均匀涂布在灭菌载片表面，液层厚度为0.2-0.4cm；在工作功率100W、工作气流10SLM、照射距离2mm条件下，设置照射时间0～180s；

(6)初筛：待步骤(5)ARTP诱变处理完毕，将带菌载片置于装有生理盐水的EP管中充分混匀，并稀释菌丝体含量至50-100CFU/mL(血球计数板计数)，涂布于再生培养基上，26℃培养2～3d。待再生培养基上长出单菌落后，以菌落直径、生长速率为依据初筛，挑选出生长快速，菌落较大的突变菌株。

(7)摇瓶复筛：将步骤(6)初筛的突变菌株，分别接种于装有200mL种子液的三角瓶中，于26℃、150rpm条件下培养2-3d，按10％v/v接种量接入二级种子液中培养，26℃、150rpm条件下静置发酵3d后，以固渣的湿重、灰分、干重、有机物含量、蛋白含量为指标复筛，选育出促进牛排菇快速生长及蛋白高产的菌株。

其中，步骤(1)中，所述的出发菌株牛排菇为D-15，购自于山东省菇园食用菌科技有限公司，菇龄28天。

其中，步骤(2)中，所述的振荡过滤收集菌丝体悬液，其振荡是用10-20颗玻璃珠振荡，其过滤是用mircloth神奇滤布过滤。

其中，步骤(2)中，所述的稳定剂为试剂A和/或试剂B；其中，所述的试剂A为：10mMNaH₂PO₄、0.8M NaCl，pH 6.0，溶剂是水；所述的试剂B为：0.6-0.8mol/L的甘露醇，pH 6.0，溶剂是水；所述的酶解液包括4000-10000U/mL纤维素酶、200-500U/mL蜗牛酶、100-400U/mL壳聚糖酶、100-400U/mL几丁质酶、100-400U/mL果胶酶中的任意一种或几种的组合，其余为稳定剂。

优选的稳定剂为试剂A与试剂B按照1:1混合制得的稳定剂，优选的酶解液为8000U/mL纤维素酶，400U/mL蜗牛酶，其余为稳定剂。

其中，步骤(2)和步骤(7)中，所述的种子液为：葡萄糖9g/L、酵母膏0.9g/L、可溶性淀粉6g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、无水硫酸镁0.1g/L、VB₁ 0.02g/L、麸皮24g/L，溶剂为水分装150-200mL/瓶。

其中，步骤(3)中，所述的原生质体悬液，其原生质体的释放量为1.0×10⁶-6.2×10⁶CFU/mL，其原生质体的再生率为0.33-3.37％。

优选的原生质体的释放量为5.8×10⁶CFU/mL，其原生质体的再生率为3.37％。

其中，步骤(4)和步骤(6)中，所述的再生培养基为：0.6mol/L蔗糖、抗生素50mg/L、土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L、VB₁ 0.1g/L，溶剂为水。

其中，步骤(4)中，所述的再生菌株为EF-1、EF-2、EF-3、EF-4、EF-5、EF-6、EF-7、EF-8，优选的再生菌株为EF-8。

其中，步骤(5)中，经ARTP诱变处理再再生培养后，观察0S的菌落数，并计算突变菌株在30S、60S、90S、120S、180S照射时间下的诱变致死，其致死率分别为18.18％、30.43％、64.06％、93.75％、95.31％，正突变率分别为9.20％、11.12％、34.69％、46.25％、35.94％。

进一步的，由于菌株在致死率90％以上时突变效应最好，根据正突变率数据，综合考虑，优选120s照射时间下，致死率93.75％，正突变率46.25％的突变菌株进行再生初筛。

其中，步骤(6)中，所述的初筛，共挑选出了6株突变菌株，分别命名为EF-8-1、EF-8-2、EF-8-3、EF-8-4、EF-8-5、EF-8-6。

其中，步骤(7)中，所述的摇瓶复筛，优选的突变菌株为EF-8-1。

其中，步骤(7)中，所述的发酵培养基为：玉米粉糖化液50mL/L，玉米浆20g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁0.5g/L，七水合硫酸亚铁0.08g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，VB₁ 0.02g/L，pH5.0。

上述牛排菇高产菌株在制备食用菌中的应用也在本发明的保护范围之内。

有益效果：

本发明通过对牛排菇原生质体制备过程中稳定剂和酶解液的优化，提升了牛排菇原生质体的释放率和再生率，并利用ARTP诱变技术选育出了一株能够快速生长和高产蛋白的牛排菇菌株GXGD-EF-8-1。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1：牛排菇菌丝体形态及大小

图2：牛排菇原生质体的释放情况

图3：牛排菇原生质体的再生情况

图4：牛排菇原生质体的ARTP突变菌株生长情况，其中上面三个从左往右依次为0S、30S、60S，下面三个从左往右依次为90S、120S、180S。

图5：原生质体菌株(EF-8)与目标菌株(EF-8-1)生长情况图

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中，所述的牛排菇为D-15，购自于山东省菇园食用菌科技有限公司，所述的蜗牛酶购自于上海源叶生物科技有限公司，所述的纤维素酶购自于山东蔚蓝生物科技有限公司。

下述实施例中，所述的GXGD-EF-8-1与EF-8-1表示的意思相同，都为经过ARTP诱变最终选育得到的牛排菇高产菌株。

实施例1：牛排菇原生质体的制备(最优酶解液和最佳稳渗剂)

(1)牛排菇菌丝体的制备：在超净工作台下将牛排菇D-15子实体段用75％v/v酒精消毒后，用无菌水反复浸洗，切除子实体外层组织，在子实体心部切取米粒大小组织接种于改良PDA平板上，于26℃避光培养3-5d。将生长出的白色菌丝体进行转接分纯，获得纯种后，验证其出菇情况，鉴定为牛排菇。其菌丝形态特点如图1所示，菌丝体直径2-4μm。

对菌丝体进行测序分析，引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。测序结果如SEQ ID No.:1所示，获得656bp大小的片段(由武汉擎科生物技术有限公司进行PCR扩增及测序)，具体序列如下。

AAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTCATAATAAGTGTTTTATGGCACTTTTTAAATCCATATCCACCTTGTGTGCAATGTCAGTCGATCTTCTTCATGGAGATCGACCAAACATCAACCTTTATCTTTTAACTCTTTGTCTGAAAAATATTATGAATAAACAATTCAAAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCATATTGCGCTCTTTGGTATTCCGAAGAGCATGCTTGTTTGAGTATCAGTAAACACCTCAAAGCTTTTGGATTTTTTTAATCGAAAAGCTTTGGACTTGAGCAATCCCAACACCAATCTTTTTGAGATCGGTGGCGGGTTGCTTGAAATGCAGGTGCAGCTGGACATTCTCCTGAGCTAAAAGCATATTCATTTAGTCCCGTCAAACGGATTATTACTTTTGCTGCAGCTAACATAAAGGGAGTTTGACCGTATTGGCTGACTGATGCAGGATTTCACAAGGGTCGGCAACGATTCTTGTTAAACTCGATCTCAAATCAAGTAAGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCA

其中，PDA平板配方如下：土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L、VB₁ 0.1g/L。

(2)菌丝体悬液的制备：将牛排菇菌丝体，按照5-6块/瓶，接入种子液中，26℃、150rpm培养2-3d。然后将灭菌后的10-20颗玻璃珠放入种子液中振荡5-10min后，用孔径为22-25μm的mircloth神奇滤布(Calbiochem公司)过滤菌丝团，收集菌丝体悬液，10000rpm、4℃离心10min后，收集菌丝体，用稳定剂冲洗1-2遍，再用酶解液重悬制备菌丝体悬液。

其中，种子液配方如下：葡萄糖9g/L、酵母膏0.9g/L、可溶性淀粉6g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、无水硫酸镁0.1g/L、VB₁ 0.02g/L、麸皮24g/L，分装150-200mL/瓶。

其中，渗透剂配方如下：试剂A：10mM NaH₂PO₄、0.8M NaCl，pH 6.0；试剂B：0.6-0.8mol/L的甘露醇，pH 6.0；试剂A与试剂B按照1:1混合制得稳定剂。

其中，酶解液的制备如下：将蜗牛酶与纤维素酶，分别按照400U/mL与8000U/mL的比例配置于渗透剂中，于8000rpm离心15-20min后，用0.22μm的微孔滤膜过滤上清液，所得滤液即为混合酶解液。

酶活定义：在一定反应条件(pH 4.8，50℃，恒温l h)下，以水解反应中，1mL纤维素酶液1min催化纤维素生成lμg葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。

(3)菌丝体酶解制备原生质体：将配置好的菌丝体悬液置于酶解液中，30℃，200rpm条件下，酶解3h后，制备原生质体悬液。采用血球计数板(watson 25*16)对酶解产生的原生质体进行观察计数，如图2所示，测得原生质体的释放量为5.8×10⁶CFU/mL，原生质体直径范围大小为4-6um。

原生质体释放量计算公式为：

(5)原生质体的再生：将原生质体浓度调整到10⁶个/mL，取0.1mL原生质体悬浮液涂布于再生培养基上，观察并计算原生质体的再生率，经过计算再生率为3.37％，如图3所示。

再生率计算公式：

(6)再生菌株生长特性的表征：从图3所示的原生质体菌落中选取了8个生长快速，菌落较大的再生菌株EF-1、EF-2、EF-3、EF-4、EF-5、EF-6、EF-7、EF-8进行再生，并分纯复壮。待再生培养基上长出单菌落后，挑选生长快速，菌落较大的再生菌株与出发菌株进行生长情况对比，观察其菌丝体含量并测量其菌落直径，记录并计算其生长速率，结果如表1所示。

其中，再生培养基配方如下：0.6mol/L蔗糖、抗生素50mg/L、土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L、VB₁ 0.1g/L。

表1再生菌株的生长速度及产量情况

根据表1结果，可以看出经过菌株原生质体脱毒复壮后，其中EF-8的生长速度为13.65mm/d，蛋白产量为35.52％，其与出发菌株(D-15)蛋白含量无显著变化。因此选取EF-8作为下一步诱变的出发菌株。

对比例1：牛排菇原生质体的制备(酶解液的筛选)

通过添加稳渗剂对酶解液中蜗牛酶和纤维素酶的酶活比例及酶量进行稀释调整，其余条件与实施例1相同，考察牛排菇原生质体的释放量及再生率，结果如表2所示。

表2不同酶组合条件下牛排菇原生质体的释放量及再生率

通过对不同组别酶活的调整发现，在酶解液中，蜗牛酶的酶活为400U/mL，纤维素酶的酶活为8000U/mL，纤维素酶：蜗牛酶的酶活比例为20:1的条件下，牛排菇原生质体的释放量最高，再生率也是最高的，其原生质体的活力最大。

对比例2：牛排菇原生质体的制备(渗透剂的筛选)

仅调整渗透剂的配方，其余条件与实施例1相同，考察牛排菇原生质体的释放量及再生率，结果如表3所示。

表3不同酶组合条件下牛排菇原生质体的释放量及再生率

稳定剂的配方	原生质体释放量(CFU/mL)	再生率(％)
			试剂A	2.78×10<sup>6</sup>	1.11％
试剂B	1.74×10<sup>6</sup>	1.26％
			试剂A：试剂B＝1:1	5.8×10<sup>6</sup>	3.37％

通过对稳渗剂配方的调整，结果表明复合稳渗剂比在单一无机盐或极性稳渗剂的条件下，其原生质体的释放量有了一定的提高，复合稳渗剂相对于试剂A，原生质体数目提高了2.09倍，再生率提高了3.04倍；复合稳渗剂相对于试剂B，原生质体数目提高了3.33倍，再生率提高了2.67倍。

实施例2牛排菇菌株的筛选(原生质体经过ARTP诱变)

(1)ARTP诱变：将实施例1中选取的EF-8作为出发菌株，按照实施例1的步骤(2)和步骤(3)制备原生质体悬液。调整原生质体的数量在10⁵-10⁶CFU/mL，取10μL调整后的悬液均匀涂布在灭菌载片表面，液层厚度为0.2-0.4cm。在工作功率100W、工作气流10SLM、照射距离2mm条件下，设置照射时间0～180s。

(2)初筛：ARTP诱变处理完毕后，将带菌载片置于装有生理盐水的EP管中充分混匀，并稀释菌丝体含量至50-100CFU/mL后，涂布于再生培养基上，26℃培养2～3d，观察其诱变致死情况为：以0S处理作为对照，在30S、60S、90S、120S、180S，其致死率分别为18.18％、30.43％、64.06％、93.75％、95.31％，正突变率分别为9.20％、11.12％、34.69％、46.25％、35.94％，如图4。由于菌株在致死率90％以上时突变效应最好，根据正突变率数据，综合考虑，优选120s照射时间下，致死率93.75％，正突变率46.25％的突变菌株进行再生初筛。

待再生培养基上长出单菌落后，以菌落直径、生长速率为依据初筛，挑选生长快速，菌落较大的突变菌株与出发菌株EF-8进行生长情况对比，观察其菌丝体含量并测量其菌落直径，记录并计算其生长速率。

其中，致死率＝(未经诱变处理菌落－经诱变处理菌落)/未经诱变处理菌落数×100％。

其中，正突变率为以菌丝蛋白含量提高10％以上作为正向突变。

在初筛时总共挑选出6株突变菌株，分别命名为EF-8-1、EF-8-2、EF-8-3、EF-8-4、EF-8-5、EF-8-6，其在连续4d的生长情况如表4，其生长速度相对于出发菌株EF-8分别提高了24.97％、15.75％、19.41％、12.82％、7.33％、12.82％。

表4突变菌株的平板直径及生长速度及产量情况

(2)摇瓶复筛：将步骤(2)挑选出的6种快速生长的突变菌株EF-8-1、EF-8-2、EF-8-3、EF-8-4、EF-8-5、EF-8-6，分别接种于装有200mL种子液的三角瓶中，于26℃、150rpm条件下培养2～3d，按10％v/v接种量接入二级种子液中培养(200mL/1L三角瓶)，26℃、150rpm条件下，发酵3d，以固渣的湿重、灰分、干重、有机物含量、蛋白含量等指标复筛，具体复筛结果如表5所示。

其中，有机物含量＝干重-灰分含量。

表5 6种快速生长的突变菌株的复筛结果

从表5可以看出，突变菌株EF-8-1、EF-8-2、EF-8-3、EF-8-4、EF-8-5、EF-8-6，其有机物含量相对于EF-8分别提高了31.69％、27.28％、18.77％、12.01％、23.77％、27.79％，其蛋白含量相对于EF-8分别提高了23.55％、12.85％、19.04％、6.42％、8.17％、6.89％。

综上，经过综合对比分析，选育出了一株突变菌株EF-8-1，其生长速度最快，有机物含量最高且蛋白产量最高。将突变菌株EF-8-1，于2022年08月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株号：GXGD-EF-8-1，保藏编号为CCTCC M 20221254。

其中，固渣的湿重：以4000rpm离心10min，弃上清和留固渣，称湿重，105℃、24h烘干得干重，水分、灰分、粗蛋白具体的检测步骤和方法分别参考国标GB5009.3-2016、GB5009.4-2016、GB 5009.5-2016。

对比例3牛排菇菌株的筛选(原生质体未经过ARTP诱变)

牛排菇原生质体未经过ARTP诱变，直接将实施例2制备的原生质体悬液稀释涂布于再生培养基上，26℃培养2～3d，观察其生长状况。考察在原生质体未经ARTP诱变的条件下，筛选出的牛排菇菌株的生长速度和蛋白含量情况。

结果如表6所示，经过原生质体的制备过程，菌株的生长速度都得到了一定的提升，但是蛋白含量无显著变化。经过诱变后，菌株的生长速度以及蛋白含量均有较大的提升和突破。说明将原生质体的制备与ARTP诱变技术的联合使用，能够诱变出生长速度快，蛋白含量高的菌株(图5)。

表6不同处理方式下菌株的生长速度和蛋白含量对比情况

结果分析：目标菌株EF-8-1相对于出发菌株D-15的产量提升情况为：4d内平均生长速度提升56.14％、蛋白含量提升24.09％、有机物含量提升100％。根据上述结果，可以看出获得的目标产物均显著提升，因此将原生质体与ARTP诱变进行联合对大型食用真菌再进行多步选育、筛选，这将成为大型食用真菌选育的有效途径。

本发明提供了一株牛排菇高产菌株及其选育方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims

1.一株牛排菇高产菌株，分类命名为牛排菇Fistulln hepatica，菌株号GXGD-EF-8-1，已于2022年08月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221254。

2.根据权利要求1所述的牛排菇高产菌株，其特征在于，所述的牛排菇高产菌株，其生长速度最高达17.05mm/d，有机物含量最高达20.28g/L，蛋白含量最高达42.50％。

3.权利要求1所述的牛排菇高产菌株的选育方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)牛排菇菌丝体的制备：将出发菌株牛排菇子实体段用75％v/v酒精消毒后，用无菌水反复浸洗，切除子实体外层组织，在子实体心部切取米粒大小组织接种于改良PDA平板上，于26℃避光培养3-5d后，将生长出的白色菌丝体进行转接分纯，获得纯种牛排菇菌丝体；

(2)菌丝体悬液的制备：将步骤(1)获得的纯种牛排菇菌丝体，按照5-6块/瓶，接入种子液中，26℃、150rpm培养2-3d；然后经振荡过滤收集菌丝体悬液，10000rpm、4℃离心10min后，收集菌丝体，用稳定剂冲洗1-2遍，再用酶解液重悬制备菌丝体悬液；

(3)菌丝体酶解制备原生质体：将步骤(2)得到的菌丝体悬液，置于30℃，200rpm条件下，酶解3h制备原生质体悬液；

(4)原生质体的再生：将步骤(3)原生质体悬液浓度调整到10⁶个/mL，取0.1mL原生质体悬浮液涂布于再生培养基上，观察、计算原生质体的再生率，并将原生质体再生菌株分纯复壮，筛选再生菌株；

(5)ARTP诱变：将步骤(4)筛选的再生菌株制备原生质体悬液，调整原生质体的数量在10⁵-10⁶CFU/mL；取10μL调整后的悬液均匀涂布在灭菌载片表面，液层厚度为0.2-0.4cm，在工作功率100W、工作气流10SLM、照射距离2mm条件下，设置照射时间0-180s；

(6)初筛：待步骤(5)ARTP诱变处理完毕，将带菌载片置于装有生理盐水的EP管中充分混匀，并稀释菌丝体含量至50-100CFU/mL后，涂布于再生培养基上，26℃培养2-3d，待再生培养基上长出单菌落后，以菌落直径、生长速率为依据初筛；

(7)摇瓶复筛：将步骤(6)初筛的菌株，分别接种于装有200mL种子液的三角瓶中，于26℃、150rpm条件下培养2-3d，按10％v/v接种量接入二级种子液中摇瓶培养，26℃、150rpm条件下静置发酵3d后，以固渣的湿重、灰分、干重、有机物含量、蛋白含量为指标复筛，选育促进牛排菇快速生长及蛋白高产的菌株。

4.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的出发菌株牛排菇为D-15，菇龄28天。

5.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的振荡过滤收集菌丝体悬液，其振荡是用10-20颗玻璃珠振荡，其过滤是用mircloth神奇滤布过滤。

6.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的稳定剂为试剂A和/或试剂B；其中，所述的试剂A为：10mM NaH₂PO₄、0.8M NaCl，pH 6.0，溶剂是水；所述的试剂B为：0.6-0.8mol/L的甘露醇，pH 6.0，溶剂是水；所述的酶解液包括4000-10000U/mL纤维素酶、200-500U/mL蜗牛酶、100-400U/mL壳聚糖酶、100-400U/mL几丁质酶、100-400U/mL果胶酶中的任意一种或几种的组合，其余为稳定剂。

7.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(7)中，所述的种子液为：葡萄糖9g/L、酵母膏0.9g/L、可溶性淀粉6g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、无水硫酸镁0.1g/L、VB₁ 0.02g/L、麸皮24g/L，溶剂为水，分装150-200mL/瓶。

8.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的原生质体悬液，其原生质体的释放量为1.0×10⁶-6.2×10⁶CFU/mL，其原生质体的再生率为0.33-3.37％。

9.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于，步骤(4)和步骤(6)中，所述的再生培养基为：0.6mol/L蔗糖、抗生素50mg/L、土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L、VB₁ 0.1g/L，溶剂为水。

10.根据权利要求9所述的选育方法，其特征在于，所述的再生培养基中，其抗生素为链霉素、青霉素、青霉素钾盐中的任意一种。