CN107058119B - 一种提高蛹虫草液态发酵生产虫草素和耐热蛋白酶产量的方法 - Google Patents

一种提高蛹虫草液态发酵生产虫草素和耐热蛋白酶产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种提高蛹虫草液态发酵生产虫草素和耐热蛋白酶产量的方法，涉及一种菌株，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，利用该菌株通过液体发酵蛹虫草菌种的制备和液体菌种发酵生产虫草素，实验结果表明，本发明菌株深层液态通风发酵虫草素含量达到4.12g/L，耐热蛋白酶活力达到92554U/ml。同时，本发明的方法具有操作简单，成本低，周期短、易于实现，原料来源丰富易取，成本低，无环境污染，所用设备、试剂价格便宜等优点，便于规模化生产。

Description

一种提高蛹虫草液态发酵生产虫草素和耐热蛋白酶产量的 方法
技术领域
本发明涉及一种具有高产耐热蛋白酶和虫草素的蛹虫草菌株，具体涉及一种提高蛹虫草液态发酵生产虫草素和耐热蛋白酶的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
蛹虫草[Cordyceps militaris (L.) Link]，又名北冬虫夏草，现代科学研究表明，蛹虫草具有丰富的活性物质，如虫草多糖、虫草素、虫草酸，氨基酸，蛋白酶等，具有抗肿瘤、抗氧化和衰老、抗炎抗菌、抗疲劳、抑制病毒生长、增强免疫力等多种药理作用和滋补功能，是具有开发潜力的一大药用宝典。在蛹虫草的活性成分中，虫草素（cordycepin），是蛹虫草中（尤其是核苷类）主要活性成分，是第一个被分离出的核苷类抗生素。虫草素具有多种生物活性，有抗菌、降血脂、减肥、抗肿瘤和抗癌等作用。蛹虫草是主要产虫草素的菌株，但其子实体生长周期长，产量低，虫草素的含量也比较低，从子实体中提取虫草素成本极高，价格昂贵，很难满足临床的广泛使用。
另一方面，当前，畜牧行业饲料资源紧张、成本上涨，食品安全问题频发，环境污染日益严重，酶制剂作为一种绿色、安全、无污染的添加剂呈现出越来越明显的价值与作用。近年来，蛋白酶在饲料中广泛添加，对动物生产性能、养分消化率以及肠道健康有积极作用。向饲料中添加蛋白酶，可以对饲料中的一些抗营养因子以及难以被动物消化吸收的如来源于豆粕、菜粕、棉籽粕、玉米、小麦、鱼粉、肉骨粉、羽毛粉和血粉等的蛋白质有强的降解作用，消除抗营养因子的负面作用，提高蛋白饲料的利用价值。因此选育能够产生蛋白酶的菌株对开发虫草饲料具有重要意义。
目前有报道蛹虫草深层发酵，但虫草素的含量较低，而且发酵时间长、培养基成本高，限制了虫草素的规模化生产。另外，目前关于高产耐热蛋白酶及高产虫草素的蛹虫草菌株及液态发酵制备方法还未见报道。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种提高蛹虫草发酵液中虫草素和耐热蛋白酶产量的方法，其目的在于：为了发酵产物用于食品或者饲料中，提供一种能显著提高北虫草发酵液中虫草素和耐热蛋白酶产量、且生产工艺简单、发酵培养基原料成本低、发酵时间相对较短的虫草素和耐热蛋白酶生产工艺。
本发明的技术解决方案：
一种高产耐热蛋白酶及高产虫草素的蛹虫草菌株(Cordyceps militaris)HYCM12，已于2016年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC（地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101），保藏编号：CGMCC No.13179。该菌株是本发明的发明人经过筛选并经过诱变后得到的。
所述的蛹虫草菌株(Cordyceps militaris)的筛选方法，包括以下步骤：
步骤一、蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种的分离筛选：
（1）菌株的分离筛选
2015年8月在山东省沂南县沂蒙山采集野生蛹虫草，采集地为土质疏松、腐殖质丰富的树林中，环境温度20~28℃，空气湿度为70~80%。总共采集到9株野生虫草菌株，将虫草从图层中慢慢剥离，清水反复冲洗虫草表面，直到处理干净为止。再用无菌滤纸吸干虫草表面水分。再用75%的乙醇或0.1升汞对表面消毒，再次无菌水冲洗。然后，从蛹虫草子座中小心切出一小块，置于虫草活化固体培养基上，22~26℃下静置培养。待菌丝长出后，每天观察。选择无杂菌污染的菌丝进一步转接到新的PDA斜面培养基。将得到的所有菌株分别接到蛋白酶筛选固体培养基上，24~28℃静置培养3~4天，查看菌落周围是否有水解圈。最后得到产生水解圈的纯化蛹虫草菌株共5株。
虫草活化固体培养基：蔗糖10~20g，蛋白胨2~5g，酵母粉1~2g，20%的马铃薯浸提液1000ml，琼脂粉15g，pH6.0~7.0，121℃灭菌20min。
蛋白酶筛选固体培养基：20%马铃薯浸提液200ml，干酪素5~15g，蔗糖10~20g，KH2P04 1~2g，MgS04·7H20 0.5~1g，琼脂粉15g，pH6.5，补充去离子水至1000ml，121℃灭菌20min。
20%的马铃薯浸提液的制备方法：去皮马铃薯200g，切成小块，加水800ml，大火煮沸后改为小火，继续煮30min，中间添加去离子水并搅拌，防止锅底焦糊，冷却后，过滤，收集滤液，添加去离子水至1000ml，即得到20%的马铃薯浸提液。
该蛋白酶的最适作用温度为50~60℃，最适pH为4.5~7.0，且该酶在高温环境80℃下，保持20min，酶活力保持90%以上，在70℃下保温24h，酶活力保持95%以上。
（2）出草试验：
将分离筛选获得的5株菌株，进行出草试验，检验菌株是否具有出草能力。接种入装有40~50g大米、80~120ml营养液的罐头瓶中。将接种好的罐头瓶置于人工气候箱中培养。23~26℃下先进行暗培养7～15天，待菌丝长满培养基后，在罐头瓶封口膜上打通通气孔并转入光照培养，培养温度调整为16~22℃，光照强度为，300～500Lux，空气相对湿度60～80％，培养40～60天，子待子实体不再生长，表面形成粒状子囊壳、即子座成熟。采收并检测子实体产量和成分。得到一株虫草产量较高的菌株XZCM6，子实体产量平均鲜重51.6g/瓶。40℃烘干后，每瓶的平均干重9.81g/瓶，生物转化率为103.2%。虫草素含量达到2.157mg/g。
营养液配方为葡萄糖8~15g，蛋白胨5~7g，KH2P04 2~3g，酵母膏1~2g，MgS04 0.5~1g，VBl 5~10mg，20％马铃薯浸汁100ml，蚕蛹粉2~8 g，pH5～7，补充自来水至1000 mL。
步骤二、本发明产耐热蛋白酶及虫草素的菌株HYCM12诱变方法如下：
（1）菌株活化培养
将上述步骤二中分离得到的野生菌株XZCM6转接到PDA固体斜面培养基进行活化培养，25~28℃恒温静置培养4～5天，按照如上方法菌株活化2次。
（2）菌株菌丝体制备
从活化好的菌丝固体平板培养基上取1cm2菌丝块接种到装有40 mL PDA菌丝培养基的250mL锥形瓶中，24~28℃，160~200 r/min进行恒温震荡培养3~7天。S04
菌丝液体培养基配方：葡萄糖20~30g、蛋白胨5~8g、20%马铃薯浸出液200ml，(NH4)2S04 3~5g、KH2P04 1~2g、MgS04·7H20 1~2g、酵母粉4~6g，加水定容至lL，pH 6.5~7.0，121℃灭菌20min。
(3) 原生质体制备
将MgS04·7H20、甘露醇溶解于双蒸水中并配制成浓度为0.6 mol/L的渗透压稳定剂溶液，高压灭菌后备用。以0.6mol/L的渗透压稳定剂配制浓度分别为0.5~0.6%和0.8~1.2%(W/V)的蜗牛酶及纤维素酶溶液，并用0.22nm微孔滤膜过滤，按照2:1的体积比混合备用。用渗透压稳定溶液将无菌滤纸过滤后的菌丝体洗涤3次。按照每100mg制备好的湿菌丝对应加入1~1.5mL混合酶液的比例，向菌丝体中加入酶液并置于25~28℃摇床上50r/min缓缓震荡孵育3~6h。酶解后用无菌棉花柱过滤除去菌丝，滤液3000~4000r/min离心5~8min，温和地沉淀原生质体，弃去上清，将原生质体悬于渗透压稳定剂中并适当稀释备用。
（4）原生质体亚硝基胍（NTG）与紫外线复合诱变
用丙酮试剂将亚硝基胍溶液配制成终浓度为1~2 mg/mL。取1 mL NTG处理液与稀释成一定浓度的1 mL原生质体悬液混合，于旋转式摇床，转速50~80r/min，26℃处理10~60min后，将处理液3000~4000r/min离心5~10min，弃去上清，用pH6.5，0.1mol/L的无菌磷酸缓冲液洗涤菌体2~3次，终止反应。然后将洗涤后的原生质体稀释后取悬浮液4mL在30W紫外灯下，照射距离30cm条件下，缓缓磁力搅拌下照射20s~60s，接着原生质体再生培养。
（5）原生质体再生培养
经亚硝基胍和紫外线诱变后的原生质体系列稀释后，吸取150~200μL涂布于再生固体培养基平板做再生培养。
原生质体再生培养基配方为：20%的马铃薯浸提液200ml，葡萄糖20~30g，蛋白胨4~8g，酵母粉4~6g，KH2P04 1~2g，MgS04·7H20 0.5~1g，琼脂粉15g，维生素B1 0.02g，补充去离子水至1000 mL，pH6.5~7.0，121℃灭菌20min；培养条件为：25~28℃避光恒温培养5~8天。将生长较快的菌落再次接到新的再生培养基上，相同条件下培养，得到第一代诱变菌株。按照以上条件培养三次，得到第三代诱变菌株。将获得的第三代菌株接到蛋白酶筛选固体培养基上，25~28℃，培养3~7天，挑选水解圈大菌株保藏，进一步复筛。
蛋白酶筛选固体培养基配方：20%马铃薯浸提液200ml，干酪素5~15g，蔗糖10~20g，KH2P04 1~2g，MgS04·7H20 0.5~1g，琼脂粉15g，pH6.5，补充去离子水至1000ml，121℃灭菌20min。培养基灭菌后充分摇匀，随着摇动，在60~70℃下倒入平板中。
（6）发酵复筛培养
将在蛋白酶固态筛选培养基上水解圈大的菌株分别接种到装有30~50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，24~28℃，160~200r/min震荡培养3~6天。
液体种子培养基配方：20%的马铃薯浸提液200ml，葡萄糖20~30g，蛋白胨4~8g，酵母粉4~6g，KH2P04 1~2g，MgS04·7H20 0.5~1g，补充去离子水至1000 mL，pH6.5~7.0，121℃灭菌20min。然后按照6~10%的接种量以上培养好的种子液到装有100~200ml液体发酵培养基的1000ml三角瓶中。过滤，测定发酵液中虫草素含量及蛋白酶活力。通过筛选得到一株虫草素含量和蛋白酶活力较高的菌株，命名为HYCM12。将该菌株保藏备用。
液体发酵培养基配方：可溶性淀粉20~30g、葡萄糖10~20g、大豆蛋白胨10~15、硫酸铵5~8g、酵母提取物5~8g、KH2P04 1~2g、MgS04·7H20 0.5~1g、ZnS04·7H20 0.05~0.1 g、FeS04·7H20 0.02~0.05g、VB1 0.1~0.5g，加水定容至1L，pH 6.5~7.0，121℃温度下灭菌20min，23~26℃ 160~180r/min震荡培养4~8天。
一种蛹虫草三角瓶液体菌种的制备方法，包括：
（1）液体发酵蛹虫草菌种的制备：
步骤1 蛹虫草斜面菌种的制备：
将去皮马铃薯200g，切成小块，加水800ml，大火煮沸后改为小火，继续煮30min，中间添加去离子水并搅拌，防止锅底焦糊，冷却后，过滤，收集滤液，添加去离子水至1000ml，即得到20%的马铃薯浸提液；
取20%马铃薯浸提液200ml、蔗糖10~20g、蛋白胨5~10g、酵母粉5~10g、磷酸二氢钾1.0~2g、琼脂15g，补充去离子水至1000ml制成PDA斜面培养基；
将保藏的蛹虫草菌株在PDA斜面培养基上进行活化，22~28℃下黑暗培养4~6天，待菌丝长满培养基平面即完成。
步骤2 蛹虫草三角瓶液体菌种的制备：
取20%马铃薯浸提液200ml、葡萄糖10~20g、蛋白胨5~10g、玉米浆5~10ml、蚕蛹粉3~5g、KH2PO4 1~2g、(NH4)2S04 1~3g、NaN03 0.2~0.5g、MgS04 0.1~0.5g、FeS04·7H20 0.01~0.05g、CaC03 0.5~1g、pH值5.5~6.5，121℃灭菌20min制成液体种子培养基。
在超净台中，先将步骤1制备好的斜面培养基上的活化好的菌种取1块6~10平方毫米大小的菌苔接入装有50~80ml种子培养基的250ml三角瓶中，在24~27℃、振荡器转速为180~220r/min恒温振荡器上发酵2~4天，形成微小的菌球。
一种提高蛹虫草发酵液中虫草素和耐热蛋白酶产量的方法：
第一种：三角瓶液体发酵生产虫草素：
按照接种量8~15%的接种量将上述步骤2中培养好的蛹虫草液体菌种接入已灭菌的装有100~300mL液体发酵培养基的1000mL三角瓶中。发酵前期(1~2天)温度为25～28℃，摇瓶转速为160~180r/min；发酵中期(3～5天)温度为28～32℃，摇床转速调整为180~210r/min。发酵后期（7~12天）温度为24～28℃。发酵至5天时，将灭过菌的补充营养液60~120ml（pH5.5）倒入以上三角瓶中，同时补加虫草素复合激活剂使发酵液中激活剂总量的浓度达到0.5~1.2g/L。接着继续震荡发酵培养，发酵时间达到7~12天时，发酵终止。所得发酵液虫草素含量为：虫草素含量达到最大值2.89g/L。其产耐热性蛋白酶活力达到5326U/ml。
液体发酵培养基配方：20%马铃薯浸出液200ml，麸皮浸出液20~50ml，豆粕粉20~30g，玉米淀粉10~20g，蔗糖10~20g，麦芽糖5~10g，蚕蛹粉5~10g，蚕蛹粉水解液5~10ml，玉米浆3~10ml，酵母粉2~5g，KH2PO4 1~2g，MgS04·7H20 0.5~1g，CaCl2 1~2g，补充去离子水至1000ml。
补充营养液配方：玉米淀粉20~30g，大豆粉20~30g，(NH4)SO4 5~10g，NaNO3 3~6g，玉米浆6~10ml，KH2PO4 3~5g，补充去离子水至1000ml。
发酵液中蛋白酶活的测定：采用Folin--酚法测定，以酪蛋白(2％)为底物，1 ml酶液在pH6.0、50℃下，一个蛋白酶活力单位(U)定义为每分钟释放出1μg酪氨酸所需的酶量。
虫草素复合激活剂配制方法：各种激活剂按照质量浓度称量好并混合一起，加去离子水溶解。其质量浓度分别为：NH4Cl 10~15g/L，甘氨酸8~20g/L，半胱氨酸5~6g/L，腺嘌呤4~5g/L。
粗蛋白酶性质研究：
初步研究了所产蛋白酶的粗酶性质，分别研究了作用温度（30、40、45、50、55、60、70及80℃）和作用pH（3.0~10.0）对该酶活力的影响，发现该蛋白酶的最适作用温度为50~60℃，最适pH为4.5~7.0，且该酶在高温环境80℃下，保持20min，酶活力保持90%以上，在70℃下保温24h，酶活力保持95%以上。该酶为耐高温型的蛋白酶。在饲料加过程中可以保持高活力。
第二种：7.5L发酵罐液体发酵生产虫草素
在7.5L发酵罐中加入4.0~5.0L液体发酵培养基，关闭各阀门通入蒸汽进行实罐灭菌。灭菌操作完成后开循环水阀门降温，待温度降至25~28℃后打开罐口以8~12％接种量倒入上述步骤2中培养好的蛹虫草液体菌种进入发酵操作。罐压0.03~0.05MPa。打开控制器设置发酵条件为发酵前期(1~2天)温度28~32℃，发酵中(3~5天)温度28~32℃，发酵后期（7~12天）温度为24～28℃。发酵前期搅拌器转速为200~400转/分，通气量1.2~1.6L/(L·min)；发酵中后期(3天到发酵终止)，根据发酵罐中的溶氧情况，对搅拌速度和通气率予以调节，使溶氧维持于30%以上。发酵液pH以蠕动泵补料10％NaOH或磷酸进行控制，发酵前期，发酵液pH值维持在5.0~6.0，发酵中后期(48h到发酵终止)，发酵液pH值维持在5.5~6.5。发酵进行到5天开始朴料，每天补料一次，每次补加体积比为10~20％的补充营养液，一共补加六次，即到10天补加最后一次补充营养液。虫草素复合激活剂补加方式如下：从发酵第5天开始，每天补加复合激活剂，每次补加的量是发酵液中复合激活剂终浓度达到：1~2g/L。发酵第10天时，补加最后一次复合激活剂。采用以上发酵方式，发酵液中虫草素含量达3.56g/L，产耐热性蛋白酶活力达到8854U/ml。
第三种：20L发酵罐液体发酵生产虫草素
在20L发酵罐中加入12~15L液体发酵培养基，关闭各阀门通入蒸汽进行实罐灭菌。灭菌操作完成后开循环水阀门降温，待温度降至25~28℃后打开罐口以10~14％接种量倒入上述步骤2中培养好的蛹虫草液体菌种进入发酵操作。罐压0.03~0.05MPa。打开控制器设置发酵条件为发酵前期(1~2天)温度28~32℃，发酵中(3~5天)温度28~32℃，发酵后期（7~12天）温度为24～28℃。发酵前期搅拌器转速为200~400转/分，通气量1.3~1.8L/(L·min)；发酵中后期(3天到发酵终止)，根据发酵罐中的溶氧情况，对搅拌速度和通气率予以调节，使溶氧维持于30%以上。发酵液pH以蠕动泵补料10％NaOH或磷酸进行控制，发酵前期，发酵液pH值维持在5.0~6.0，发酵中后期(48h到发酵终止)，发酵液pH值维持在5.5~6.5。发酵进行到5天开始朴料，补料采取流加的方式。每天流加补充营养液为发酵液总体积的15~20％。到发酵10天时，停止流加补充营养液。虫草素复合激活剂补加方式如下：从发酵第5天开始，每天补加复合激活剂，每次补加的量是发酵液中复合激活剂终浓度达到：1~2g/L。发酵第10天时，补加最后一次复合激活剂。采用以上发酵方式，发酵液中虫草素含量达4.12g/L，产耐热性蛋白酶活力达到89255U/ml。
与现有的蛹虫草发酵技术相比，本发明具有以下优势：
1）蛹虫草液体发酵过程中根据蛹虫草菌体的生长规律以及虫草素和耐热蛋白酶的产生特点，采用了分三阶段进行温度控制和通气情况控制，可以显著提高虫草素和耐热蛋白酶的产量。
2）通过在蛹虫草发酵一段时间后补加虫草素复合激活剂，可显著提高北虫草发酵液中虫草素的产量，发酵罐发酵其产量高达4.12g/L，远远高于未添加复合激活剂的传统发酵的产量。
3）本发明的蛹虫草液体发酵产物中，不仅具有高产量的虫草素，还有耐热性蛋白酶，发酵罐发酵耐热蛋白酶产量达到89255U/ml。发酵产物应用于动物饲料添加剂，能够激活强化动物的免疫系统，提高免疫机能，使动物生长快，可免去动物饲料中抗生素的添加而使动物产品可真正成为绿色食品。耐热蛋白酶适合用作饲用酶，稳定性强，酶活力高。
4）本发明采用的液态通风发酵技术，易于实现工艺过程的连续化、自动化生产，降低人力生产成本。发酵过程紧密结合菌体的生长和产物的形成，进行发酵条件严格优化，实现了分阶段温度调节、pH调节、通气量调节，达到发酵产物最优化生产的目的。
5）发酵后期进行了补料发酵，有效防止了菌体的衰老，延长了菌体代谢产物虫草素和耐热蛋白酶的生产，显著提高了产量。
6）发酵培养基应用了价格低廉的麸皮、豆粕、玉米淀粉、蚕蛹粉等农副产物，为蛹虫草的生长和产物形成提供了丰富的氮源、氮源和生长促进因子，且节约了成本。
本发明通过三角瓶液体发酵生产虫草素、7.5L发酵罐液体发酵生产虫草素以及20L发酵罐液体发酵生产虫草素对比得知20L发酵罐发酵方式最优，菌株深层液态通风发酵虫草素含量达到4.12g/L，耐热蛋白酶活力达到92554U/ml。同时，本发明的方法具有操作简单，成本低，周期短、易于实现，原料来源丰富易取，成本低，无环境污染，所用设备、试剂价格便宜等优点，便于规模化生产。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明做进一步描述：
1、菌株的分离筛选
2015年8月在山东省沂南县沂蒙山采集野生蛹虫草，采集地为土质疏松、腐殖质丰富的树林中，环境温度20~28℃，空气湿度为70~80%。总共采集到9株野生虫草菌株，将虫草从图层中慢慢剥离，清水反复冲洗虫草表面，直到处理干净为止。再用无菌滤纸吸干虫草表面水分。再用75%的乙醇或0.1升汞对表面消毒，再次无菌水冲洗。然后，从蛹虫草子座中小心切出一小块，置于虫草活化固体培养基上，22~26℃下静置培养。待菌丝长出后，每天观察。选择无杂菌污染的菌丝进一步转接到新的PDA斜面培养基。将得到的所有菌株分别接到蛋白酶筛选固体培养基上，24~28℃静置培养3~4天，产看菌落周围是否有水解圈。最后得到产生水解圈的纯化蛹虫草菌株共5株。
虫草活化固体培养基：蔗糖10~20g，蛋白胨2~5g，酵母粉1~2g，20%的马铃薯浸提液1000ml，琼脂粉15g，pH6.0~7.0，121℃灭菌20min。
蛋白酶筛选固体培养基：20%马铃薯浸提液200ml，干酪素5~15g，蔗糖10~20g，KH2P04 1~2g，MgS04·7H20 0.5~1g，琼脂粉15g，pH6.5，补充去离子水至1000ml，121℃灭菌20min。
20%的马铃薯浸提液的制备方法：去皮马铃薯200g，切成小块，加水800ml，大火煮沸后改为小火，继续煮30min，中间添加去离子水并搅拌，防止锅底焦糊，冷却后，过滤，收集滤液，添加去离子水至1000ml。
、出草试验：
将分离筛选获得的5株菌株，进行出草试验，检验菌株是否具有出草能力。接种入装有40~50g大米、80~120ml营养液的罐头瓶中。将接种好的罐头瓶置于人工气候箱中培养。23~26℃下先进行暗培养7～15天，待菌丝长满培养基后，在罐头瓶封口膜上打通通气孔并转入光照培养，培养温度调整为16~22℃，光照强度为，300～500Lux，空气相对湿度60～80％，培养40～60天，子待子实体不再生长，表面形成粒状子囊壳、即子座成熟。采收并检测子实体产量和成分。得到一株虫草产量较高的菌株XZCM6，子实体产量平均鲜重51.6g/瓶。40℃烘干后，每瓶的平均干重9.81g/瓶，生物转化率为103.2%。虫草素含量达到2.157mg/g。
营养液配方为：葡萄糖8~15g，蛋白胨5~7g，KH2P04 2~3g，酵母膏1~2g，MgS04 0.5~1g，VBl 5~10mg，20％马铃薯浸汁100ml，蚕蛹粉2~8 g，pH5～7，补充自来水至1000 mL。
、菌株鉴定
菌株XZCM6形态特征鉴定：菌株的特征如下：
形态特征： 在黑暗条件下PDA培养基上24~26℃培养6~8天 后，整个菌落呈纯白色的绒毛状、菌落直径为17~32mm，菌丝生长旺盛、粗壮、菌丝致密，有光泽。显微镜下观察，菌丝细胞多核、菌丝体顶端形成分生孢子梗，孢子梗顶端不膨大，无分枝，分生孢子以链状方式着生。孢子呈椭圆状。整体形状与蛹草拟青霉极为相似，初步鉴定该菌株无性型为拟青霉属(Paecilomyces militaris)的一个种。
在栽培大米培养基上培养，待菌丝长满后，将栽培瓶移入出草室内，在薄膜中央扎4～6个孔，保持相对湿度60%～90%和足够的散射光，5～7天后培养料表面或四周有桔黄色色素形成，进一步光照培养后，长出子实体，子实体橘黄色，柄粗壮，头部膨大呈球形，出草整齐均匀，出草率高。子实体高1~4cm、直径5~7mm。
菌株XZCM6的分子鉴定：
提取菌株XZCM6基因组，依据真菌ITS序列中最保守的序列设计引物，引物如下：ITS 1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。引物由上海英俊生物工程技术有限公司合成。PCR 反应体系为(20 μL): ddH2O 12.7 μL，，10×PCRbuffer 2.0 μL，dNTP mix (2.5 mmol/L) 2.0 μL，正向引物(10 μmol/L) 1.0 μL，反向引物(10 μmol/L) 1.0 μL，Taq FlexiPolymerase (5 U/μL) 0.3 μL， 模板 1.0 μL。热循环参数94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火60s，72℃延伸2min，循环30次，72℃延伸10min。用pGM-T载体克隆测序。测得序列与从NCBI中比对获得的相近菌株的ITS序列采用ClustalX1.83进行多序列比对。
其测定结果如下：
1 AAGTAAAAGT CGTAACAAGG TCTCCGTTGG TGAACCAGCG GAGGGATCAT TAACGAGTTT
61 TCCAACTCCC AACCCTTTGT GAACATACCT ATCGTTGCTT CGGCGGACTC GCCCAGCGCC
121 TGGACGCGGG CCTGGGCGGC GGCCGTCGGG GGCCCCAAAC ACTGTATCTA CCAGTTTTTC
181 TGAATCCGCC GCAAGGCAAA ACAAATGAAT CAAAACTTTC AACAACGGAT CTCTTGGCTC
241 TGGCATCGAT GAAGAACGCA GCGAACTGCG ATAAGTAATG TGAATTGCAG AATTCAGTGA
301 ATCATCGAAT CTTTGAACGC ACATTGCGCC CGCCAGCATT CTGGCGGGCA TGCCTGTTCG
361 AGCGTCATTT CAACCCTCGA CGTCCCATGG GGGATGTCGG CGTTGGGGAC CGGCAGCACA
421 CCGCCGCCCC CGAAATGAAG TGGCGGCCCG TCCGCGGCGA CCTCTGCGTA GTACTCCAAC
481 TCGCACCGGG AACCCGACGT GGCCACGCCG TAAAACGCCC AACTCTGAAC GTTGACCTCG
541 GATCAGGTAG GAATACCCGC TGAACTTAAG CATAT
对所测ITS序列与GenBank中的ITS序列进行比较，结果表明菌株XZCM6的ITS基因序列与序列数据库中所有Cordyceps militaris系列菌株的序列相似度均达到了99.2％。根据ITS序列鉴定特点，序列相似性>99％时，可判断为相同种。结合前面的菌丝结构及分生孢子的产孢类型和栽培特性，可以确定所测菌株XZCM6是蛹虫草（Cordyceps militaris）。
、蛹虫草菌株的复合诱变和选育方法
（1）菌株活化培养
将上述分离得到的野生菌株XZCM6转接到PDA固体斜面培养基进行活化培养，25~28℃恒温静置培养4～5天。按照如上方法菌株活化2次。
（2）菌株菌丝体制备
从活化好的菌丝固体平板培养基上取1cm2菌丝块接种到装有40 mL PDA菌丝培养基的250mL锥形瓶中，24~28℃，160~200 r/min进行恒温震荡培养3~7天。菌丝液体培养基配方：葡萄糖20~30g、蛋白胨5~8g、20%马铃薯浸出液200ml，(NH4)2S04 3~5g、KH2P04 1~2g、MgS04·7H20 1~2g、酵母粉4~6g，加水定容至lL，pH 6.5~7.0，121℃灭菌20min。
(3) 原生质体制备
将MgS04·7H20、甘露醇溶解于双蒸水中并配制成浓度为0.6 mol/L的渗透压稳定剂溶液，高压灭菌后备用。以0.6mol/L的渗透压稳定剂配制浓度分别为0.5~0.6%和0.8~1.2%(W/V)的蜗牛酶及纤维素酶溶液，并用0.22nm微孔滤膜过滤，按照2:1的体积比混合备用。用渗透压稳定溶液将无菌滤纸过滤后的菌丝体洗涤3次。按照每100mg制备好的湿菌丝对应加入1~1.5mL混合酶液的比例，向菌丝体中加入酶液并置于25~28℃摇床上50r/min缓缓震荡孵育3~6h。酶解后用无菌棉花柱过滤除去菌丝，滤液3000~4000r/min离心5~8min，温和地沉淀原生质体，弃去上清，将原生质体悬于渗透压稳定剂中并适当稀释备用。
（4）原生质体亚硝基胍（NTG）与紫外线复合诱变
用丙酮试剂将亚硝基胍溶液配制成终浓度为1~2 mg/mL。取1 mL NTG处理液与稀释成一定浓度的1 mL原生质体悬液混合，于旋转式摇床，转速50~80r/min，26℃处理10~60min后，将处理液3000~4000r/min离心5~10min，弃去上清，用pH6.5，0.1M的无菌磷酸缓冲液洗涤菌体2~3次，终止反应。然后将洗涤后的原生质体稀释后取悬浮液4mL在30W紫外灯下，照射距离30cm条件下，缓缓磁力搅拌下照射20s~60s。接着原生质体再生培养。
（5）原生质体再生培养
经亚硝基胍和紫外线诱变后的原生质体系列稀释后，吸取150~200μL涂布于再生固体培养基平板做再生培养。原生质体再生培养基配方为：20%的马铃薯浸提液200ml，葡萄糖20~30g，蛋白胨4~8g，酵母粉4~6g，KH2P04 1~2g，MgS04·7H20 0.5~1g，琼脂粉15g，维生素B1 0.02g，补充去离子水至1000 mL，pH6.5~7.0，121℃灭菌20min；培养条件为：25~28℃避光恒温培养5~8天。将生长较快的菌落再次接到新的再生培养基上，相同条件下培养，得到第一代诱变菌株。按照以上条件培养三次，得到第三代诱变菌株。将获得的第三代菌株接到蛋白酶筛选固体培养基上，25~28℃，培养3~7天，挑选水解圈大菌株保藏，进一步复筛。
蛋白酶筛选固体培养基配方：20%马铃薯浸提液200ml，干酪素5~15g，蔗糖10~20g，KH2P04 1~2g，MgS04·7H20 0.5~1g，琼脂粉15g，pH6.5，补充去离子水至1000ml，121℃灭菌20min。培养基灭菌后充分摇匀，随着摇动，在60~70℃下倒入平板中。
（6）发酵复筛培养
将在蛋白酶固态筛选培养基上水解圈大的菌株分别接种到装有30~50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，24~28℃ 160~200r/min震荡培养3~6天。液体种子培养基配方：20%的马铃薯浸提液200ml，葡萄糖20~30g，蛋白胨4~8g，酵母粉4~6g，KH2P04 1~2g，MgS04·7H20 0.5~1g，补充去离子水至1000 mL，pH6.5~7.0，121℃灭菌20min。然后按照6~10%的接种量以上培养好的种子液到装有100~200ml液体发酵培养基的1000ml三角瓶中。过滤，测定发酵液中虫草素含量及蛋白酶活力。通过筛选得到一株虫草素含量和蛋白酶活力较高的菌株，命名为HYCM12，将该菌株保藏备用。
液体发酵培养基配方：可溶性淀粉20~30g、葡萄糖10~20g、大豆蛋白胨10~15、硫酸铵5~8g、酵母提取物5~8g、KH2P04 1~2g、MgS04·7H20 0.5~1g、ZnS04·7H20 0.05~0.1 g、FeS04·7H20 0.02~0.05g、VB1 0.1~0.5g，加水定容至1L，pH 6.5~7.0，121℃灭菌20min），23~26℃ 160~180r/min震荡培养4~8天。
、液体发酵蛹虫草菌种的制备
步骤1 蛹虫草斜面菌种
从诱变后复选获得的菌株HYCM12从保存的斜面上挑取菌丝接到备好的PDA斜面培养基上进行活化，22~28℃下黑暗培养4~6天，待菌丝长满培养基平面。
PDA斜面培养基：20%马铃薯浸提液200ml、蔗糖10~20g、蛋白胨5~10g、酵母粉5~10g、磷酸二氢钾1.0~2g、琼脂15g，补充去离子水至1000ml。
步骤2 蛹虫草三角瓶液体菌种
在超净台中，先将步骤1制备好的斜面培养基上的活化好的菌种取1块6~10mm2大小的菌苔接入装有50~80ml种子培养基的250ml三角瓶中，在24~27℃、振荡器转速为180~220r/min恒温振荡器上发酵2~4天，形成微小的菌球。
液体种子培养基：20%马铃薯浸提液200ml、葡萄糖10~20g、蛋白胨5~10g、玉米浆5~10ml、蚕蛹粉3~5g、KH2PO4 1~2g、(NH4)2S04 1~3g、NaN03 0.2~0.5g、MgS04 0.1~0.5g、FeS04·7H20 0.01~0.05g、CaC03 0.5~1g、pH值5.5~6.5，121℃灭菌20min。
、三种方式发酵生产虫草素及耐热蛋白酶的对比
（1）三角瓶液体发酵生产虫草素及耐热蛋白酶
按照接种量8~15%的接种量将上述培养好的蛹虫草液体菌种接入已灭菌的装有100~300mL液体发酵培养基的1000mL三角瓶中。发酵前期(1~2天)温度为25～28℃，摇瓶转速为160~180r/min；发酵中期(3～5天)温度为28～32℃，摇床转速调整为180~210 r/min。发酵后期（7~12天）温度为24～28℃。发酵至5天时，将灭过菌的补充营养液60~120ml（pH5.5）倒入以上三角瓶中，同时补加虫草素复合激活剂使发酵液中激活剂总量的浓度达到0.5~1.2g/L。接着继续震荡发酵培养，发酵时间达到7~12天时，发酵终止。所得发酵液虫草素含量为2.89g/L，发酵液中耐热性蛋白酶活力达到5326U/ml。
液体发酵培养基配方：20%马铃薯浸出液200ml，麸皮浸出液20~50ml，豆粕粉20~30g，玉米淀粉10~20g，蔗糖10~20g，麦芽糖5~10g，蚕蛹粉5~10g，蚕蛹粉水解液5~10ml，玉米浆3~10ml，酵母粉2~5g，KH2PO4 1~2g，MgS04·7H20 0.5~1g，CaCl2 1~2g，补充去离子水至1000ml。
补充营养液配方：玉米淀粉20~30g，大豆粉20~30g，(NH4)SO4 5~10g，NaNO3 3~6g，玉米浆6~10ml，KH2PO4 3~5g，补充去离子水至1000ml。
发酵液中蛋白酶活的测定：采用Folin--酚法测定，以酪蛋白(2％)为底物，1 ml酶液在pH6.0、50℃下，一个蛋白酶活力单位(U)定义为每分钟释放出1μg酪氨酸所需的酶量。
虫草素复合激活剂：各种激活剂按照质量浓度称量好并混合一起，加去离子水溶解。其质量浓度分别为：NH4Cl 10~15g/L，甘氨酸8~20g/L，半胱氨酸5~6g/L，腺嘌呤4~5g/L。
粗蛋白酶性质研究：
初步研究了所产蛋白酶的粗酶性质，分别研究了作用温度（30、40、45、50、55、60、70及80℃）和作用pH（3.0~10.0）对该酶活力的影响，发现该蛋白酶的最适作用温度为50~60℃，最适pH为4.5~7.0，且该酶在高温环境80℃下，保持20min，酶活力保持90%以上，在70℃下保温24h，酶活力保持95%以上。该酶为耐高温型的蛋白酶。在饲料加工过程中可以保持高活力。
（2）7.5L发酵罐液体发酵生产虫草素
在7.5L发酵罐中加入4.0~5.0L培养基，关闭各阀门通入蒸汽进行实罐灭菌。灭菌操作完成后开循环水阀门降温，待温度降至25~28℃后打开罐口以8~12％接种量倒入种子液进入发酵操作。罐压0.03~0.05MPa。打开控制器设置发酵条件为发酵前期(1~2天)温度28~32℃，发酵中(3~5天)温度28~32℃，发酵后期（7~12天）温度为24～28℃。发酵前期搅拌器转速为200~400r/min，通气量1.2~1.6L/(L·min)；发酵中后期(3天到发酵终止)，根据发酵罐中的溶氧情况，对搅拌速度和通气率予以调节，使溶氧维持于30%以上。发酵液pH以蠕动泵补料10％NaOH或磷酸进行控制，发酵前期，发酵液pH值维持在5.0~6.0，发酵中后期(48h到发酵终止)，发酵液pH值维持在5.5~6.5。发酵进行到5天开始朴料，每天补料一次，每次补加体积比为10~20％的补充营养液，一共补加六次，即到10天补加最后一次补充营养液。虫草素复合激活剂补加方式如下：从发酵第5天开始，每天补加复合激活剂，每次补加的量是发酵液中复合激活剂终浓度达到：1~2g/L。发酵第10天时，补加最后一次复合激活剂。采用以上发酵方式，发酵液中虫草素含量达3.56g/L，产耐热性蛋白酶活力达到8854U/ml。
（3）20L发酵罐液体发酵生产虫草素
在20L发酵罐中加入12~15L发酵培养基，关闭各阀门通入蒸汽进行实罐灭菌。灭菌操作完成后开循环水阀门降温，待温度降至25~28℃后打开罐口以10~14％接种量倒入种子液进入发酵操作。罐压0.03~0.05MPa。打开控制器设置发酵条件为发酵前期(1~2天)温度28~32℃，发酵中(3~5天)温度28~32℃，发酵后期（7~12天）温度为24～28℃。发酵前期搅拌器转速为200~400转/分，通气量1.3~1.8L/(L·min)；发酵中后期(3天到发酵终止)，根据发酵罐中的溶氧情况，对搅拌速度和通气率予以调节，使溶氧维持于30%以上。发酵液pH以蠕动泵补料10％NaOH或磷酸进行控制，发酵前期，发酵液pH值维持在5.0~6.0，发酵中后期(48h到发酵终止)，发酵液pH值维持在5.5~6.5。发酵进行到5天开始朴料，补料采取流加的方式。每天流加补充营养液为发酵液总体积的15~20％。到发酵10天时，停止流加补充营养液。虫草素复合激活剂补加方式如下：从发酵第5天开始，每天补加复合激活剂，每次补加的量是发酵液中复合激活剂终浓度达到：1~2g/L。发酵第10天时，补加最后一次复合激活剂。采用以上发酵方式，发酵液中虫草素含量达4.12g/L，产耐热性蛋白酶活力达到89255U/ml。
通过三角瓶液体发酵生产虫草素、7.5L发酵罐液体发酵生产虫草素以及20L发酵罐液体发酵生产虫草素对比得知20L发酵罐发酵方式最优，菌株深层液态通风发酵虫草素含量达到4.12g/L，耐热蛋白酶活力达到92554U/ml。
综上，本发明达到预期目的。
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Claims (8)

1.一种蛹虫草菌株，其特征在于：该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No. 13179。
2.一种提高蛹虫草发酵液中虫草素和耐热蛋白酶产量的方法，包括：
步骤1 液体发酵蛹虫草菌种的制备
（1）蛹虫草斜面菌种的制备：
将权利要求1保藏的蛹虫草菌株在PDA斜面培养基上进行活化，22~28℃下黑暗培养4~6天，待菌丝长满培养基平面即完成；
（2）蛹虫草三角瓶液体菌种的制备：
先将上述制备好的斜面培养基上的活化好的菌种取1块6~10平方毫米大小的菌苔接入装有50~80ml种子培养基的250ml三角瓶中，在24~27℃、振荡器转速为180~220r/min恒温振荡器上发酵2~4天，形成微小的菌球；
步骤2 液体菌种发酵生产虫草素
包括：三角瓶液体发酵和发酵罐液体发酵，所述三角瓶液体发酵为：按照接种量8%～15%的接种量将步骤1中培养好的蛹虫草三角瓶液体菌种接入已灭菌的装有100～300mL液体发酵培养基的1000mL三角瓶中进行发酵，包括：
发酵前期：温度为25～28℃，摇瓶转速为160～180r/min，发酵1~2天；
发酵中期：温度为28～32℃，摇床转速调整为180～210 r/min，发酵3~5天；
发酵后期：温度为24～28℃，发酵7~12天，发酵至5天时，将灭过菌的补充营养液60～120ml，倒入以上三角瓶中，营养液的pH值为5.5，同时补加虫草素复合激活剂使发酵液中激活剂总量的浓度达到0.5～1.2g/L，接着继续震荡发酵培养，发酵时间达到7～12天时，发酵终止；所述发酵罐液体发酵，分为：（1）发酵前期准备发酵罐分为7.5L发酵罐或20L发酵罐：在7.5L发酵罐中加入4.0~5.0L液体发酵培养基，关闭各阀门通入蒸汽进行实罐灭菌，灭菌操作完成后开循环水阀门降温，待温度降至25~28℃后打开罐口以8~12％接种量倒入步骤1中培养好的蛹虫草三角瓶液体菌种，罐压0.03~0.05Mpa，进入发酵操作；在20L发酵罐中加入12~15L液体发酵培养基，关闭各阀门通入蒸汽进行实罐灭菌，灭菌操作完成后开循环水阀门降温，待温度降至25~28℃后打开罐口以10~14％接种量倒入步骤1中培养好的蛹虫草三角瓶液体菌种，罐压0.03~0.05Mpa，进入发酵操作；
（2）发酵
发酵前期：温度28~32℃，搅拌器转速为200~400转/分，通气量1.3~1.8L/(L·min)，发酵1~2天，发酵液pH值维持在5.0~6.0；
发酵中期：温度28~32℃，发酵3~5天，发酵液pH值维持在5.5~6.5；
发酵后期：温度为24～28℃，发酵7~12天，发酵液pH值维持在5.5~6.5；
发酵进行到5天开始补料，补料采取流加的方式，每天流加补充营养液为发酵液总体积的15~20％，到发酵10天时，停止流加补充营养液；
虫草素复合激活剂补加方式如下：从发酵第5天开始，每天补加复合激活剂，每次补加的量是发酵液中复合激活剂终浓度达到：1~2g/L，发酵第10天时，补加最后一次复合激活剂。
3.根据权利要求2所述一种提高蛹虫草发酵液中虫草素和耐热蛋白酶产量的方法，其特征在于：所述步骤2中液体发酵培养基的配制方法为：可溶性淀粉20~30g、葡萄糖10~20g、大豆蛋白胨10~15、硫酸铵5~8g、酵母提取物5~8g、KH2P04 1~2g、MgS04·7H20 0.5~1g、ZnS04·7H20 0.05~0.1 g、FeS04·7H20 0.02~0.05g、VB1 0.1~0.5g，加水定容至1L，pH 6.5~7.0，121℃温度下灭菌20min，23~26℃ 160~180r/min震荡培养4~8天。
4.根据权利要求2所述一种提高蛹虫草发酵液中虫草素和耐热蛋白酶产量的方法，其特征在于：所述步骤2中复合激活剂配制方法为：各种激活剂按照质量浓度称量好并混合一起，加去离子水溶解，其质量浓度分别为：NH4Cl 10~15g/L，甘氨酸8~20g/L，半胱氨酸5~6g/L，腺嘌呤4~5g/L。
5.根据权利要求2所述一种提高蛹虫草发酵液中虫草素和耐热蛋白酶产量的方法，其特征在于：所述步骤2中补充营养液配方为：玉米淀粉20~30g，大豆粉20~30g，(NH4)2SO4 5~10g，NaNO3 3~6g，玉米浆6~10ml，KH2PO4 3~5g，补充去离子水至1000ml。
6.根据权利要求2所述一种提高蛹虫草发酵液中虫草素和耐热蛋白酶产量的方法，其特征在于：所述步骤1中PDA斜面培养基的配方为：取20%马铃薯浸提液200ml、蔗糖10~20g、蛋白胨5~10g、酵母粉5~10g、磷酸二氢钾1.0~2g、琼脂15g，补充去离子水至1000ml制成。
7.根据权利要求2所述一种提高蛹虫草发酵液中虫草素和耐热蛋白酶产量的方法，其特征在于：所述步骤1中液体种子培养基配方为：取20%马铃薯浸提液200ml、葡萄糖10~20g、蛋白胨5~10g、玉米浆5~10ml、蚕蛹粉3~5g、KH2PO4 1~2g、(NH4)2S04 1~3g、NaN03 0.2~0.5g、MgS04 0.1~0.5g、FeS04·7H20 0.01~0.05g、CaC03 0.5~1g、pH值5.5~6.5，121℃灭菌20min制成。
8.根据权利要求7所述一种提高蛹虫草发酵液中虫草素和耐热蛋白酶产量的方法，其特征在于：所述马铃薯浸提液配方：将去皮马铃薯200g，切成小块，加水800ml，大火煮沸后改为小火，继续煮30min，中间添加去离子水并搅拌，防止锅底焦糊，冷却后，过滤，收集滤液，添加去离子水至1000ml。
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